Isolamento e differenziazione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo sottocutaneo da Suini tessuti adiposi

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule staminali derivate dal tessuto adiposo da tessuti adiposi bianchi sottocutanei suini per valutare la loro capacità di differenziarsi in adipociti mesenchimali, osteociti e condrociti. Questo metodo può contribuire a rispondere alle domande fondamentali della ricerca sull'obesità. È uno strumento utile per svelare il meccanismo molecolare coinvolto nella regolazione dello sviluppo del tessuto adiposo.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di ottenere un numero abbondante di cellule stromavascolari, permettendo un'analisi approfondita della differenziazione e della biologia degli adipociti. L'importanza di questa tecnica si rivolge alla ricerca sulle terapie con cellule staminali, poiché le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo del maiale mostrano multipotenza per la transdifferenziazione in molteplici linee cellulari. Iniziare posizionando il suino in posizione prona su un tavolo operatorio pulito.

Radiare tutti i peli lungo la linea mediana dal collo alla coda e detergere la pelle dorsale con iodopovidone al 7,5% per tre volte. Dopo la terza detersione, lasciare agire l'iodopovidone sulla superficie della pelle per circa 10 minuti. Quindi, spruzzare la pelle con etanolo al 70%.

E utilizzare tamponi di garza imbevuti di etanolo per strofinare la pelle in un'unica direzione, rimuovendo così il disinfettante fino a quando non si osserva alcun colore evidente. Successivamente, praticare un'incisione dalla regione del collo fino alla gamba. Poi, sollevando il grasso e la pelle con una pinza, utilizzare un bisturi per separare lo strato adiposo dorsale suino dei tessuti adiposi sottocutanei e lo strato cutaneo adiacente dai muscoli.

Immergere immediatamente il tessuto cutaneo e adiposo in un becher sterilizzato da 200 millilitri contenente DMEM privo di siero a 37 gradi Celsius e spruzzare l'esterno del becher con etanolo al 70%. Successivamente, posizionare il becher all'interno di una cappa a flusso laminare per colture cellulari e accanto al becher posizionare un foglio di alluminio sterile, triplo strato, di dimensioni 40 per 30 centimetri. Trasferire il tessuto, con la pelle rivolta verso il basso, sull'alluminio.

E usare pinze e forbici per rimuovere il tessuto muscolare residuo dal tessuto adiposo. Tagliare il grasso in pezzi quadrati di 7 per 7 centimetri, quindi trasferire i pezzi di grasso in un nuovo becher sterilizzato da 200 millilitri contenente DMEM senza siero, a 37 gradi Celsius. Posizionare ora un porta-campioni personalizzato, dotato di una lama in acciaio al carbonio, sulla pellicola di copertura e appoggiare uno dei pezzi di grasso sul tagliatore con il lato grasso rivolto verso il basso.

Tagliare il tessuto adiposo in pezzi spessi circa 1 millimetro, il più vicino possibile alla pelle senza tagliarla. Successivamente, utilizzare le forbici per tritare i pezzi di tessuto adiposo nel modo più fine possibile e aggiungerli a un matraccio Erlenmeyer da 250 millilitri contenente mezzo di digestione filtrato integrato con collagenasi. Incubare il matraccio con movimento rotatorio per 90 minuti a 45 giri al minuto, in un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius.

Quando il mezzo di digestione diventa una sospensione omogenea, senza grumi significativi di tessuto, interrompere la digestione aggiungendo un volume uguale di mezzo di coltura contenente DMEM F-12 con il 10% di FBS. Per raccogliere le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo del maiale, filtrare la sospensione di tessuto adiposo digerito attraverso un singolo strato di garza in una bottiglia sierologica sterile da 250 millilitri, utilizzando pinze per premere al centro della garza, al fine di guidare e facilitare il passaggio del digesto. Svuotare e torcere la garza con le pinze per completare il passaggio e distribuire il mezzo in quattro tubi conici da centrifuga da 50 millilitri.

Raccogliere le cellule stromal-vascolari mediante centrifugazione. Quindi, aspirare il soprannatante senza disturbare il pellet per rimuovere la maggior parte del grasso superficiale contenente gli adipociti maturi. Successivamente, risospendere i pellet in 10 millilitri di DMEM mediante pipettaggio e agitazione delicata.

Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere i pellet in 10 millilitri di buffer di lisi ACK. Dopo sette minuti a temperatura ambiente, interrompere la lisi dei globuli rossi aggiungendo 10 millilitri di DMEM a ciascun tubo, agitando delicatamente i tubi per mescolare. Quindi, centrifugare nuovamente le cellule.

Lavare le cellule altre due volte con 10 millilitri di DMEM, quindi raccogliere i soprannatanti attraverso un filtro da 100 micron in un singolo tubo conico da 50 millilitri. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare più volte per distribuire uniformemente le cellule e contare le cellule mediante esclusione del blu di Trypan. Infine, seminare le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo del maiale a una densità di 6 × 10⁴ per centimetro quadrato in un contenitore di coltura di dimensioni appropriate, utilizzando mezzo di coltura cellulare.

E incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5%CO2, per favorire la formazione di un monolayer. La morfologia delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo suino, ottenute dalla frazione stromale-vascolare, è simile a quella delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo di topo o umane, con una morfologia espansa simile a fibra di vetro osservata 24 ore dopo la semina. Le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo suino diventano confluenti entro 72 ore, momento in cui sono pronte per la differenziazione in adipociti o in altri tipi mesenchimali.

Queste cellule mostrano anche un forte potenziale adipogenico dopo induzione chimica e adipociti maturi possono essere osservati dopo nove giorni di differenziazione, con oltre il 90% delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo del suino che mostrano differenziazione adipogenica. I marcatori di superficie delle cellule staminali mesenchimali, tra cui CD 29, CD 44, CD 90 e MHC 1, sono fortemente espressi sulle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo del suino, mentre CD 4a, CD 31, CD 45 e MHC II sono appena rilevabili, dimostrando che queste cellule staminali del suino presentano caratteristiche di tipo mesenchimale senza significativa contaminazione da cellule endoteliali o ematopoietiche. Inoltre, le cellule staminali differenziate del suino possono essere identificate come adipociti, osteociti o condrociti mediante l'utilizzo di specifici coloranti istologici, dimostrando che queste cellule derivate dalla frazione stromale-vascolare conservano una multipotenza tipica dei progenitori di tipo mesenchimale.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di adottare una buona tecnica asettica per la coltura cellulare e di eseguire tutti i passaggi nel minor tempo possibile, al fine di massimizzare la vitalità delle cellule. Una volta acquisita padronanza, le cellule possono essere raccolte da due a tre suini in sei ore, se la tecnica viene eseguita correttamente.

Questa tecnica standard ha aperto la strada ai ricercatori dell'obesità nel campo del diabete per esplorare gli interruttori molecolari, come i fattori di trascrizione, che controllano la differenziazione degli adipociti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo del maiale e valutare la capacità pluripotente di queste cellule di differenziarsi in adipociti, osteociti e condrociti.