Separazione immunomagnetica di Sca1 Fat Depot-specifica ^alta derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC)

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule staminali mesenchimali Sca1 positive da vari cuscinetti adiposi di topo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, utilizzando la selezione cellulare basata su biglie immunomagnetiche, le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo provenienti da diversi depositi di grasso possono essere efficacemente arricchite per esperimenti successivi. In generale, i ricercatori nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché la forza e la durata della digestione tissutale mediata dalla collagenasi dovrebbero essere ottimizzate per procurarsi un numero adeguato di cellule per lo smistamento.

Per isolare i cuscinetti adiposi sottocutanei, iniziare posizionando il topo su una tavola da dissezione in schiuma in posizione supina e spruzzando l'animale con etanolo al 70%. Dopo aver fissato le zampe alla tavola, praticare una piccola incisione nella pelle del basso addome. Quindi, afferrando la parte superiore del taglio con una pinza, usa le forbici per separare la pelle e il peritoneo dall'addome al torace.

Facendo tagli laterali nella pelle, lungo il lato del corpo, si riflette la pelle lontano dal peritoneo verso la testa. Quindi, tira indietro la pelle rimanente, tenendo il grasso inguinale lontano dal corpo, e usa aghi da 22 gauge per fissare la pelle alla tavola. Quindi, usa la pinza per afferrare un cuscinetto adiposo inguinale all'origine vicino al peritoneo e usa le forbici sottili per tagliare tra la pelle e il grasso inguinale, progredendo verso l'inguine ed evitando di contaminare il cuscinetto adiposo sottocutaneo con la pelle.

Quindi, posizionare il cuscinetto adiposo inguinale isolato in un piatto da 60 millimetri marcato SQ contenente un terreno di coltura a 37 gradi Celsius e raccogliere il cuscinetto adiposo inguinale dall'altro lato dell'animale allo stesso modo. Per isolare i cuscinetti adiposi viscerali, tagliare il peritoneo per esporre i cuscinetti adiposi viscerali e l'intestino. Quindi sposta l'intestino da parte, verso il torace.

Afferrando il cuscinetto adiposo viscerale all'estremità distale, tirare delicatamente verso l'alto il tessuto adiposo e sezionarlo, facendo attenzione a escludere il tessuto epididimale. Quindi posizionare il cuscinetto adiposo in un piatto da 60 millimetri marcato VIS contenente terreno di coltura a 37 gradi Celsius. Quando tutti i cuscinetti adiposi sono stati raccolti, trasferire le piastre in una cappa di coltura tissutale e aspirare il terreno.

Usa le forbici curve per tritare i cuscinetti. Quindi, aggiungere i pezzi di grasso in singoli tubi da 50 millilitri contenenti collagenasi appena preparata. Quindi, agitare i tubi a 300 giri/min e 37 gradi Celsius per 10-20 minuti, fino a quando i tessuti non sono stati digeriti.

Alcuni pezzi di tessuto adiposo sottocutaneo possono essere ancora visibili. Aggiungere 20 millilitri di terreno di coltura alla soluzione di collagenasi per fermare la digestione e utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per aspirare e dispensare il liquame tissutale 10 volte per dissociare completamente i tessuti digeriti. Filtrare le cellule attraverso filtri cellulari da 100 micron e centrifugare i tessuti.

Quindi decantare accuratamente il terreno, facendo attenzione a non disturbare i pellet, e risospendere delicatamente entrambi i gruppi di cellule in cinque millilitri di acqua sterile. Attendere due minuti affinché gli eritrociti vengano lisati. Quindi arrestare la reazione in ogni provetta con 25 millilitri di terreno integrato con FBS.

Filtrare entrambe le popolazioni di adipociti attraverso nuovi filtri cellulari da 100 micron, farli girare di nuovo verso il basso e quindi risospendere i pellet in uno o tre millilitri di terreno. Dopo aver contato per esclusione del blu di tripano, preparare separatamente una volta per dieci fino alla sesta cellula adiposa sottocutanea e le cellule viscerali nei pozzetti individuali di una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti. Dopo aver tripsinizzato le cellule, diluire la tripsina con un millilitro di tampone di separazione, quindi centrifugare le piastre di coltura.

Sospendiamo le cellule in 500 microlitri per provetta di tampone di separazione e centrifughiamo nuovamente le cellule. Ora, risospendere le cellule in 90 microlitri per provetta di tampone di separazione e mescolare 10 microlitri di anticorpo primario anti-Sca1 FITC nella sospensione cellulare. Dopo 10 minuti di incubazione a quattro gradi Celsius al buio, lavare le cellule con un millilitro di tampone di separazione per provetta.

Dopo la rotazione, le cellule vengono risospese in 80 microlitri di tampone di separazione per sospensione cellulare. Quindi mescolare 20 microlitri di microsfere Anti-FITC in ogni pozzetto e posizionare le piastre a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in un millilitro di tampone di separazione e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone fresco per provetta.

Ora, posiziona una colonna nel supporto magnetico e risciacqua la colonna con 500 microlitri di tampone separato. Trasferire le cellule dalla coltura di tessuto adiposo sottocutaneo sulla colonna, facendo attenzione a evitare bolle, e raccogliere le cellule Sca1 negative non marcate in una provetta conica da 15 millilitri. Quando tutte le celle sono passate, lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone di separazione.

Quindi trasferire la colonna dal magnete in un nuovo tubo conico da 15 millilitri e immergere un millilitro di tampone di separazione fresco attraverso la colonna per eluire le celle Sca1 positive. Infine, ridurre le frazioni cellulari positive e negative di Sca1 e risospendere i pellet in un millilitro di terreno di coltura. Quindi contare il numero di cellule in ciascuna frazione e impiattare le frazioni nei pozzetti individuali di una nuova piastra di coltura cellulare a sei pozzetti.

Le cellule stromali vascolari isolate dal grasso sottocutaneo mostrano una forma cellulare allungata simile a quella dei fibroblasti, indipendentemente dal loro livello di espressione di Sca1. Come le cellule alte Sca1 derivate dal grasso inguinale sottocutaneo, le cellule alte Sca1 derivate dal grasso epididimo viscerale mostrano una forma cellulare allungata simile a quella dei fibroblasti. Mentre le cellule basse di VIS Sca1 mostrano una forma epitelioide.

Le cellule alte Sca1 isolate da topi isolati Sca1-GFP sono facilmente identificabili come cellule GFP positive in coltura tissutale. Infatti, quando queste cellule vengono valutate mediante citometria a flusso, la maggior parte delle cellule GFP positive è confermata per esprimere le proteine Sca1 sulla loro superficie cellulare, come rilevato dagli anticorpi anti-Sca1. Insieme alle analisi PCR in tempo reale, è possibile dimostrare l'espressione differenziale delle metalloproteinasi della matrice collagenolitica tra cellule staminali Sca1 ad alto adiposo derivate dal grasso inguinale e dell'epididimo.

Inoltre, quando i gel di collagene di tipo I marcati con fluoresceina vengono utilizzati per valutare l'attività di degradazione pericellulare, si osserva un marcato aumento dell'attività di rimodellamento del collagene mediata da cellule staminali viscerali Sca1 ad alto contenuto adiposo. Una volta padroneggiato, l'isolamento delle cellule del cuscinetto adiposo può essere completato in due ore se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere un campo chirurgico pulito e organizzato per garantire un efficiente isolamento dei cuscinetti adiposi.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come un test di degradazione del collagene, per rispondere a ulteriori domande sul rimodellamento dei tessuti mediato da cellule staminali di derivazione adiposa. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'obesità e della biologia delle matrici per esplorare il ruolo delle cellule staminali di derivazione adiposa nel rimodellamento e nella funzione del tessuto adiposo nei topi e negli esseri umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come procurarti e arricchire le cellule primarie Sca1 positive dai depositi di tessuto adiposo.