Name: Separazione immunomagnetica di Sca1 Fat Depot-specifica alta derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Impara a isolare cellule staminali mesenchimali Sca1 positive da tessuto adiposo murino mediante separazione immunomagnetica. Questo metodo consente di arricchire efficacemente le ASC da diversi depositi di grasso per studi di rigenerazione tissutale.

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Questo lavoro è sostenuto da NIH DK095137 (al THC). Ringraziamo i membri del laboratorio attuali ed ex che hanno contribuito allo sviluppo e alla sofisticazione dei metodi descritti.

Etica Dichiarazione: L&#39;Università del Michigan Comitato Uso e manutenzione degli animali (UCUCA) ha approvato tutti i metodi ei protocolli in conformità con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (Institute for Research Laboratory Animal, Consiglio Nazionale delle Ricerche). I topi sono mantenuti in una Università del Michigan Vivarium e sono dati il ​​libero accesso a cibo e acqua e tenuti al / ciclo di luce 12 ore scuro. 1. preparati <ol><li> Preparare terreni di coltura primaria con DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G, e 1x antibiotici / antimicotici. Questo verrà utilizzato per mantenere i tessuti nella digestione prima. Mettere magazzino e aliquota in 37 ° C bagnomaria. </li><li> Preparare cinque millilitri di Tipo III soluzione di collagenasi a 5 mg / ml sciolti in HBSS (+ Ca, Mg +) per ciascun tipo di cuscinetto adiposo essere isolati, fino a cinque topi. Per esempio, quando isolando SQ e VIS da un singolo genotipo, fare 10 ml, se wild-type e mutante SQ e VIS, fanno 20 ml. Regolare il pH a 7,4 e sterile filtro. Aliquota in provette da 50 ml. Mettere da parte al riparo dalla luce. </li><li> Utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare campo chirurgico. Pulire e coprire con un tampone blu. Spruzzare un po &#39;di etanolo sul pad blu. </li><li> Utilizzare i 22 aghi G da definire un tampone assorbente alla scheda di polistirolo e tagliare con le forbici. Spruzzare il pad con etanolo quindi impostare la scheda sul pad blu e coprire con un altro pad blu fino al inizio dissezione. </li><li> Riempire due provette da 50 ml con etanolo e posto in una posizione adiacente al campo chirurgico. Mettere le forbici e pinze in etanolo. </li><li> Riempire un altro tubo da 50 ml con PBS 1x più anti-anti per il risciacquo etanolo off strumenti chirurgici. </li><li> Nel cofano, etichetta di 60 piatti mm per ogni tipo di tessuto e riempire con terreni di coltura riscaldato a 37 ° C. Posizionare le piastre adiacenti alla zona chirurgica. </li></ol> 2. Isolamento di sottocutanea (SQ) Fat Pads <ol><li> Euthanize mouse con una dose eccessiva di isoflurano e pneumotorace. </li><li> Delicatamentespruzzare il mouse con il 70% di etanolo e laici in posizione supina. Pin le zampe al bordo della gomma piuma con 22 aghi G. </li><li> Fare un piccolo taglio nella pelle del basso addome. Tenendo la parte superiore del taglio con le pinze, prendere le forbici e separare la pelle dal peritoneo. </li><li> Una volta che la pelle è separato dal peritoneo dall&#39;addome al torace, riflettere la pelle lontano dal peritoneo verso la testa mediante tagli laterali nella pelle lungo il lato del corpo. </li><li> Riflettere il restante pelle tiene il grasso inguinale lontano dal corpo e definire con precisione alla scheda con 22 aghi G. </li><li> Passare a forbici sottili e pinze. Afferra il cuscinetto adiposo inguinale con la pinza all&#39;origine vicino al peritoneo e tagliare via tra la pelle e il grasso inguinale progredendo verso l&#39;inguine evitando di contaminare il SQ con la pelle. </li><li> Posizionare il cuscinetto adiposo inguinale insolated in mm piatto etichettato 60. </li></ol> 3. Isolamento di Visceral (VIS) cuscinetti di grasso <ol><li> In modo simile al punto 2.5, tagliare il peritoneo aperto per esporre il viscerale cuscinetti adiposi e intestino. </li><li> Spostare l&#39;intestino via verso il torace. </li><li> Afferra il cuscinetto adiposo VIS alla fine distale e delicatamente tirare su. Sezionare il cuscinetto adiposo VIS facendo attenzione ad escludere dell&#39;epididimo (o uterina, se si utilizza topi di sesso femminile) dei tessuti. </li><li> Posto nel piatto etichettati e ripetere il punto 3.3 per il pad VIS rimanente. </li></ol> 4. Collagenasi digestione dei grassi Pad <ol><li> Spostare 60 mm piatti alla cappa coltura tissutale e aspirare fuori media. </li><li> Tritare i cuscinetti adiposi con forbici curve poi aggiungere alla soluzione di collagenasi. Assicuratevi di risciacquare le forbici e pinze tra tipi di tessuto con etanolo e PBS. </li><li> Agitare a 300 rpm e 37 ° C per 10-20 minuti fino a quando i tessuti vengono digeriti. È accettabile se alcuni pezzi di SQ sono ancora visibili. Questo problema verrà affrontato in un passaggio successivo. </li><li> Aggiungere 25 ml di terreni di coltura per la soluzione di collagenasi per fermare la collagtrattamento enase, e pipetta su e giù per 10 volte con una pipetta 10 ml sierologica per disperdere i tessuti digeriti. </li><li> cellule Strain usando un colino cella di 100 micron. Centrifugare per 10 min a 300 x g. </li><li> decantare con cautela media non disturbare il pellet e aggiungere 5 ml di acqua sterile per il pellet e delicatamente pipetta di sospendere le cellule. Attendere 2 minuti per la lisi degli eritrociti. </li><li> Aggiungere 25 ml di media con cellule FBS e di deformazione del 10% attraverso un nuovo colino cella 100 micron. </li><li> Centrifugare per 10 min a 300 x g. mezzi decantare e risospendere pellet in 1 ml di terreni di coltura. </li><li> Contare le cellule con un emocitometro utilizzando 1: 1 trypan blu. </li><li> Piastra 1 x 10 6 cellule in un bene su un 6-pozzetti. </li></ol> 5. separazione cellulare magnetica <ol><li> Dopo circa 4 a 6 ore di adesione cellulare, lavare le cellule due volte con HBSS (-Ca, -Mg). Dissociarsi cellule aderenti con 0,05% tripsina. Diluire sospensione cellulare tripsina in tampone di separazione 1 ml e girare per5 min a 300 x g. </li><li> Aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer. Rimuovere una aliquota di 10 microlitri e contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> cellule Spin per 5 min a 300 x g. </li><li> Aspirare il surnatante completamente. Risospendere le cellule in 90 microlitri di buffer. Aggiungere 10 microlitri anticorpo primario anti-Sca1-FITC. Mescolare bene e incubare per 10 minuti a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di tampone e celle di centrifugazione per 5 min a 300 x g. Rimuovere completamente il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 80 microlitri di buffer. Aggiungere 20 microsfere anti-FITC microlitri. Mescolare bene e incubare per 15 min a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di tampone e celle di centrifugazione per 5 min a 300 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 500 microlitri di buffer. </li><li> Mettere colonna del supporto magnetico e risciacquare colonna con 500 microlitri di buffer. </li><li> Aggiungere sospensione cellulare a colonna. Evitare bolle mentre pipettaggio. </li><li> Raccogliere il Sca1 senza etichetta - &lt;/ Sup&gt; cellule e lavare colonna 3 volte con 500 microlitri di buffer. Solo aggiungere nuovo buffer quando il serbatoio è vuoto. Evitare bolle mentre pipettaggio. </li><li> Rimuovere colonna dal supporto magnetico e posto in un tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone a colonna ed eluire Sca1 + spingendo stantuffo fornito attraverso il serbatoio di colonna. </li><li> Centrifugare frazioni cellulari per 5 min a 300 x g. Risospendere le cellule in terreni di coltura 1 ml. </li><li> Rimuovere una aliquota di 10 microlitri dalle frazioni etichettati e senza etichetta e contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Piastra ogni frazione di cellule in 1 pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. </li></ol> 6. Verifica di separazione immunomagnetica di Sca1 alta ACSS con citometria a flusso <ol><li> Lavare le cellule due volte con HBSS (-Ca, -Mg) e dissociare le cellule utilizzando 0,05% tripsina. </li><li> cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. Risospendere le cellule in terreni di coltura 1 ml e contare con un emocitometro. </li><li> Ottenere&gt; 10 6 </sup&gt; cellule in 1 ml di terreni di coltura e centrifugare a 300 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e ripetere il punto 6.3 altre due volte. </li><li> Risospendere le cellule con 1 ml di 2% siero di capra + 2% BSA e blocco per 30 minuti a RT. </li><li> cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere soluzione bloccante. </li><li> Aggiungere topo IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 mg, 1: 400) o anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 mg, 1: 400), in 100 ml di PBS con siero di capra 2% e il 2% BSA + PBS a 4 ° C per 30 minuti al buio. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS freddo per le cellule. Centrifugare 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e ripetere il punto 6.9 altre due volte. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di PBS. Passare sospensioni cellulari attraverso un colino cella di 100 micron di preparazione per l&#39;analisi di citometria di flusso. </li></ol>

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<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui dimostriamo l&#39;isolamento e la separazione immunomagnetica cellule di ASC murine da diversi cuscinetti di grasso e il loro utilizzo per esperimenti in vitro. Il metodo presentato è efficace per la rapida isolamento di un gran numero di ASC SCA1-positivo, che è vantaggiosa sulla tecnicamente complessi e costosi isolamento FACS-mediata di ASC 9,14. Diversamente FACS, separazione immunomagnetica non consente l&#39;uso di antigeni multipli per l&#39;identificazione di una popolazione di cellule be...

Staminali antigene cella 1 (Sca1, o Ly6A / E) per la prima volta identificata come un marcatore di superficie cellulare espressa da ematopoietiche e mesenchimali staminali cellule 5,6. La frazione vascolare stromale (SVF) di tessuto adiposo ottenuto da depositi di grasso del mouse è una popolazione eterogenea di cellule che compongono dei fibroblasti, macrofagi, cellule endoteliali vascolari, cellule neuronali e cellule progenitrici degli adipociti 7. Cellule progenitrici degli adipociti, o le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (CSA) sono cellule non carichi di lipidi che si trovano nella matrice extracellulare perivascolare ricchi di collagene (ECM) 8. Circa il 50% della SVF costituiti da ASC, caratterizzati come lineage-negative (Lin -) e CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. La maggior parte di queste cellule sono Sca1 +: CD24 - progenitori adipociti, che sono capaci di adipociti differenziazione in vitro; Tuttavia, solo una frazione di cellule (0,08% del SVF) costituisce Sca1 <sup&gt; +: CD24 + cellule che sono pienamente in grado di proliferare e differenziarsi in adipociti nelle condizioni in vivo 9. Nonostante il potenziale avvertenza di usare Sca1 + SVF senza discriminare le cellule CD24 + CD24 da - cellule, isolando Sca1 + ASC da depositi di grasso che utilizzano la separazione immunomagnetica è un approccio efficiente e pratico per determinare il fenotipo delle cellule-autonoma di cellule progenitrici degli adipociti primaria. Nel campo di obesità e diabete, fibrosi dei tessuti e l&#39;infiammazione gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella manutenzione del diabete di tipo-2 3. Recentemente, Tokunaga et al. hanno dimostrato che le cellule di alta SCA1 isolate da inguinale (o sottocutanea, SQ) e perigonadal (o viscerale, VIS) depositi di grasso C57BL6 / J mostrano diverse firme genetiche e ECM rimodellamento in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), un membro prototipico della membrana-tmatrix ipo metalloproteinasi (MMP) famiglia media lo sviluppo di tessuto adiposo bianco (WAT), attraverso la sua attività collagenolitica 1. Esempi di esperimenti che possono essere eseguite con le cellule isolate e arricchite attraverso il seguente protocollo includono cultura tridimensionale, studi di differenziazione, saggi di degradazione del collagene, e RNA sequenziamento 10,11. Test di degradazione devono essere condotte con il collagene acido estratto per garantire la conservazione di telopeptide 11,12. Il seguente protocollo dimostrerà i metodi per isolare le cellule stromali vascolari primarie da diversi depositi di grasso e di arricchire le cellule progenitrici degli adipociti utilizzando separazione immunomagnetica. La validità della separazione delle cellule sarà valutata con la citometria a flusso e attraverso l&#39;utilizzo di topi Sca1-GFP che esprimono GFP in Sca1 + cellule, guidata da un promotore Sca1 13.

<table><tbody><tr><td>Tipo 3 Collagenasi</td><td>Worthington Biochimico</td><td>LS004182</td><td>Digestione dei tessuti</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Terreno di coltura ad alto contenuto di glucosio</td></tr><tr><td>Pen/Streptococco/Glutammina (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Terreno antibiotico</td></tr><tr><td>Anti-anti (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Terreno antimicotico</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7,4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&mu; Filtro cellulare m</td></tr><tr><td>Piastre da 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td> grandi <td>FST</td><td>14091-11</td><td>Punta fine e curva</td></tr><tr><td>Pinze grandi</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8" aghi</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da 22G 1,5"</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 ml</td><td>BD</td><td>Falcon 352097</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di separazione MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Kit microsfere Anti-Sca1 (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&ordm; Microsfere anticorpi e anti-FITC 2&ordm; Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS tampone di corsa</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetti chux blu</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetti assorbenti</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Pannello di polistirolo</td><td></td><td></td><td>Utilizzare da provette da 50 ml</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td></td><td></td><td></td>al 70%</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-topo Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Tubo a fondo tondo</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash; Ca, &ndash; Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Per soluzione di collagenasi</td></tr><tr><td>Collagene di tipo I (2,7 mg/ml in acido acetico da 37 mm</td><td>Preparare in casa12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0,34 N NaOH</td><td>Preparare in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 acido carbossilico, estere succinimidilico, isomeri misti</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0,89 M NaHCO3&nbsp; </sotto></td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

separazione immunomagnetica di sca1 fat depot-specifica<sup&gt; alta</sup&gt; derivate da tessuto adiposo cellule staminali (asc)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

L'isolamento delle cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) è un metodo importante nel campo della biologia del tessuto adiposo, dell'adipogenesi e del rimodellamento della matrice extracellulare (ECM). In vivo, l'ambiente ricco di ECM costituito da collageni fibrillari fornisce un supporto strutturale ai tessuti adiposi durante la progressione e la regressione dell'obesità. Il rimodellamento fisiologico della ECM mediato dalle metalloproteinasi della matrice (MMP) svolge un ruolo importante nella regolazione delle dimensioni e della funzione del tessuto adiposo1,2. La perdita del fisiologico rimodellamento della ECM collagenolitica può portare a un eccessivo accumulo di collagene (fibrosi tissutale), infiltrazione di macrofagi e, infine, a una perdita dell'omeostasi metabolica, inclusa l'insulino-resistenza3,4. Quando si osserva un cambiamento fenotipico del tessuto adiposo in modelli murini geneticamente mirati, isolare le ASC primarie dai depositi di grasso per studi in vitro è un approccio efficace per definire il ruolo del gene specifico nella regolazione della funzione delle ASC. Di seguito, definiamo una separazione immunomagnetica di ASCalte Sca1.

Arricchimento di alte ASC SCA1 provenienti da diversi cuscinetti di grasso. Le cellule stromali vascolari isolati dalla visualizzazione grasso SQ fibroblasti-like, allungato la forma delle cellule indipendentemente dal livello di espressione Sca1 (Figura 1A). D&#39;altra parte, VIS (EWAT-derivati) SCA1 alta e bassa Sca1 cellule mostrano netta differenza nella loro forma cellula...

Presentiamo le tecniche necessarie per isolare la frazione vascolare stromale (SVF) dai depositi di tessuto adiposo inguinale (sottocutaneo) e perigonadico (viscerale) di topo per valutare la loro espressione genica e l'attività collagenolitica. Questo metodo include l'arricchimento di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC)ad alto contenuto di Sca1 utilizzando la separazione cellulare immunomagnetica.

Separazione immunomagnetica di Sca1 Fat Depot-specifica<sup&gt; alta</sup&gt; derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule staminali mesenchimali positive per Sca1 da diversi depositi adiposi del topo. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che, utilizzando il sorting cellulare basato su microsferette immunomagnetiche, è possibile arricchire efficacemente cellule staminali derivate dal tessuto adiposo provenienti da diversi distretti adiposi per successivi esperimenti. In generale, i ricercatori alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché la forza e la durata della digestione tissutale mediata da collagenasi devono essere ottimizzate per ottenere un numero adeguato di cellule da sottoporre a sorting.Per isolare i cuscinetti adiposi sottocutanei, iniziare posizionando il topo su una tavola anatomica in schiuma in posizione supina e spruzzando l'animale con etanolo al 70%. Dopo aver fissato gli arti alla tavola, effettuare una piccola incisione nella pelle dell'addome inferiore. Quindi, afferrando con una pinzetta il margine superiore dell'incisione, utilizzare le forbici per separare la pelle e il peritoneo dall'addome fino al torace.Eseguire dei tagli laterali nel tessuto cutaneo lungo i lati del corpo, sollevando il tessuto cutaneo dal peritoneo verso la testa. Successivamente, tirare indietro la parte rimanente della pelle, tenendo il grasso inguinale lontano dal corpo, e utilizzare aghi da 22 gauge per fissare la pelle alla tavoletta. Poi, utilizzare la pinzetta per afferrare un cuscinetto adiposo inguinale alla sua origine vicino al peritoneo, e con forbici fini effettuare dei tagli tra la pelle e il grasso inguinale, procedendo verso l'inguine, evitando di contaminare il cuscinetto adiposo sottocutaneo con la pelle.Quindi, posizionare il cuscinetto adiposo inguinale isolato in una piastra da 60 millimetri etichettata SQ contenente mezzo di coltura a 37 gradi Celsius, e raccogliere il cuscinetto adiposo inguinale dall'altro lato dell'animale nello stesso modo. Per isolare i cuscinetti adiposi viscerali, tagliare il peritoneo per esporre i cuscinetti adiposi viscerali e l'intestino. Successivamente, spostare l'intestino di lato, verso il torace.Afferrando il cuscinetto di grasso viscerale all'estremità distale, sollevare delicatamente il tessuto adiposo ed estrarlo con attenzione, evitando il tessuto epididimario. Quindi posizionare il cuscinetto di grasso in una piastra da 60 millimetri etichettata VIS contenente mezzo di coltura a 37 gradi Celsius. Una volta raccolti tutti i cuscinetti di grasso, trasferire le piastre in una cappa a flusso laminare per colture cellulari e aspirare il mezzo.Usare forbici curve per tritare i cuscinetti. Successivamente, aggiungere i pezzi di tessuto adiposo in singole provette da 50 millilitri contenenti collaghenasi appena preparata. Poi, agitare le provette a 300 giri al minuto e a 37 gradi Celsius per 10-20 minuti, fino a quando i tessuti non sono digeriti.Alcuni frammenti di tessuto del cuscinetto adiposo sottocutaneo potrebbero essere ancora visibili. Aggiungere 20 millilitri di mezzo di coltura alla soluzione di collaghenasi per arrestare la digestione e utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per aspirare e dispensare 10 volte la sospensione tissutale al fine di dissociare completamente i tessuti digeriti. Filtrare le cellule attraverso filtri cellulari da 100 micron e centrifugare i tessuti.Quindi versare con attenzione il mezzo, avendo cura di non disturbare i pellet, e risospendere delicatamente entrambi i gruppi cellulari in cinque millilitri di acqua sterile. Attendere due minuti affinché gli eritrociti vengano lisati. Successivamente, arrestare la reazione in ogni provetta aggiungendo 25 millilitri di mezzo integrato con FBS.Filtrare entrambe le popolazioni di adipociti attraverso nuovi filtri cellulari da 100 micron, centrifugarli nuovamente, quindi risospendere i pellet in uno-tre millilitri di mezzo. Dopo il conteggio mediante esclusione del blu di tripano, seminare separatamente 1 × 10⁶ cellule del grasso sottocutaneo e cellule viscerali in singoli pozzetti di una piastra da coltura cellulare a sei pozzetti. Dopo la tripsinizzazione delle cellule, diluire la tripsina con un millilitro di buffer di separazione, quindi centrifugare le piastre di coltura.Sospendiamo le cellule in 500 microlitri per provetta di buffer di separazione e centrifughiamo nuovamente le cellule. A questo punto, risospendiamo le cellule in 90 microlitri per provetta di buffer di separazione e aggiungiamo 10 microlitri di anticorpo primario anti-Sca1 FITC alla sospensione cellulare. Dopo 10 minuti di incubazione a quattro gradi Celsius al buio, laviamo le cellule con un millilitro di buffer di separazione per provetta.Dopo la centrifugazione, le cellule vengono risospese in 80 microlitri di buffer di separazione per ogni sospensione cellulare. Quindi aggiungere 20 microlitri di microperle anti-FITC in ogni pozzetto e incubare le piastre a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce, per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con un millilitro di buffer di separazione e risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer fresco per ogni provetta.Ora, posizionare una colonna nel supporto magnetico e risciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone di separazione. Trasferire le cellule dal tessuto adiposo sottocutaneo alla colonna, avendo cura di evitare bolle, e raccogliere le cellule negative per Sca1 non marcate in un tubo conico da 15 millilitri. Una volta che tutte le cellule sono passate, lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone di separazione.Trasferire quindi la colonna dal magnete in un nuovo tubo conico da 15 millilitri e far passare attraverso la colonna un millilitro di tampone di separazione fresco per eluire le cellule positive per Sca1. Infine, centrifugare entrambe le frazioni cellulari positive e negative per Sca1 e risospendere i pellet in un millilitro di mezzo di coltura. Contare quindi il numero di cellule in ciascuna frazione e seminare le frazioni in pozzetti separati di una nuova piastra per colture cellulari a sei pozzetti.Le cellule stromali vascolari isolate dal tessuto adiposo sottocutaneo mostrano una forma allungata simile a quella dei fibroblasti, indipendentemente dal loro livello di espressione di Sca1. Come le cellule positive a Sca1 derivate dal grasso sottocutaneo inguinale, anche le cellule positive a Sca1 derivate dal grasso viscerale epididimale mostrano una forma allungata simile a quella dei fibroblasti. Al contrario, le cellule VIS Sca1 low presentano una forma epitelioide.Le cellule Sca1 high isolate da topi Sca1-GFP sono facilmente identificabili come cellule GFP positive in coltura tissutale. In effetti, quando queste cellule vengono analizzate mediante citometria a flusso, la maggior parte delle cellule GFP positive risulta esprimere proteine Sca1 sulla loro superficie cellulare, come rilevato dall'anticorpo anti-Sca1. Accoppiando questi dati ad analisi di PCR in tempo reale, è possibile dimostrare l'espressione differenziale delle matrix metalloproteinasi collagenolitiche tra cellule staminali adipose Sca1 high ottenute da tessuto adiposo inguinale ed epididimale.Inoltre, quando vengono utilizzati gel di collagene di tipo I marcati con fluoresceina per valutare l'attività di degradazione pericellulare, si osserva un'attività di rimodellamento del collagene notevolmente aumentata mediata da cellule staminali derivate dal tessuto adiposo viscerale Sca1 high. Una volta acquisita padronanza della tecnica, l'isolamento delle cellule dal grasso può essere completato in due ore se eseguito correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere un campo operatorio pulito e organizzato per garantire un isolamento efficiente del grasso.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come un saggio di degradazione del collagene, per rispondere ad ulteriori domande sul rimodellamento tissutale mediato da cellule staminali derivate dal tessuto adiposo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'obesità e della biologia della matrice per esplorare il ruolo delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo nel rimodellamento e nella funzione del tessuto adiposo in topi ed esseri umani. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere ed arricchire cellule primarie positive per Sca1 da depositi di tessuto adiposo.

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