In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

L'obiettivo generale di questa centrifugazione a gradiente di velocità è analizzare i capsidi del virus dell'influenza A in condizioni che imitano l'ambiente endocitico che i virus in arrivo incontrano durante l'ingresso nelle cellule. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come i capsidi del virus dell'influenza A si disassemblano durante l'ingresso in cellule, come l'effetto specifico del pH leggermente acido sulla stabilità del capside. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi quantitativa del processo di decoating del virus dell'influenza A in condizioni sperimentali definite.

Oltre a fornire informazioni su come viene avviata la rimozione del rivestimento del virus dell'influenza A, questo metodo può essere applicato anche allo studio di altri virus dell'involucro con relativi meccanismi di srivestimento. A dimostrare la procedura, sarà Firat Nebloglu, un ex studente del mio laboratorio. Dopo aver preparato i tamponi e i reagenti secondo il protocollo di testo, per ogni condizione di pH da testare, preparare la miscela master del tampone detergente mescolando nove millilitri di cloruro di sodio molare, sei millilitri di 10% NP40, 2,4 millilitri dello stock di inibitore della proteasi 25X e nove millilitri di acqua doppia distillata.

Quindi, per ogni condizione di pH, pipettare 4,4 millilitri della miscela master in una provetta conica da 50 millilitri. Per valori di pH superiori a 5,8, aggiungere 0,6 millilitri della rispettiva soluzione madre Tris da 500 milliMolari aggiustata per pH nella provetta. Per valori di pH pari o inferiori a 5,8, aggiungere 0,6 millilitri della rispettiva soluzione madre MES da 500 milliMolari aggiustata per il pH.

Preparare cinque millilitri di soluzione tampone, contenente 300 milliMolare di cloruro di sodio, 2X inibitore della proteasi, 60 milliMolare Tris, regolato a pH 7,4 e acqua doppia distillata. Questo servirà come tampone di controllo del gradiente senza detergente. Quindi, aggiungi cinque millilitri del brodo di glicerolo al 50% a cinque millilitri di miscele tampone contenenti detersivo e prive di detergenti, ottenendo sei diverse soluzioni di glicerolo al 25%.

Utilizzare strisce pH per verificare i valori di pH. Preparare una soluzione di glicerolo al 15% mescolando un rapporto da tre a sette di glicerolo al 50% con acqua distillata. Utilizzando una siringa da cinque millilitri e un ago, aggiungere tre millilitri di soluzione di glicerolo al 15% a sei provette da centrifugazione ultratrasparenti.

Lavare l'ago in acqua bidistillata dopo ogni passaggio. Utilizzare una siringa da cinque millilitri e un ago lungo per iniettare con cura 3,4 millilitri di soluzione di glicerolo al 25% sotto lo strato di glicerolo al 15%, facendo attenzione a non mescolare i due strati. Un'interfaccia tra i due strati è chiaramente visibile.

Ripetere l'operazione per tutte e sei le condizioni da testare con le rispettive soluzioni di glicerolo a pH aggiustato. Successivamente, in una cappa di biosicurezza di Classe II, utilizzare un millilitro di liquido allantoico chiarificato e diluito, contenente il virus dell'influenza A, per sovrapporre delicatamente i gradienti di glicerolo. Trasferire le provette nei secchi del rotore, bilanciare le provette opposte e posizionarle con cura in un rotore di ultracentrifugazione SW-41 pre-raffreddato.

Centrifugare a 2100 giri/min e 12 gradi Celsius per 150 minuti. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta Pasteur pulita e un aspiratore per rimuovere con cura entrambi gli strati di glicerolo. Quindi, con 40 millilitri di tampone per campioni LDS 1X non riducente, risospendere completamente il pellet pipettandolo su e giù prima di trasferire il campione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Per eseguire SDS-PAGE, riscaldare tutti i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Caricare 20 microlitri di pellet disciolti su un mini-gel Bis-Tris a gradiente prefabbricato e far funzionare a 200 Volt per un'ora in 1X MOPS SDS running buffer. Incubare il gel in soluzione di fissazione per un'ora.

Sciacquare una o due volte con acqua e colorare per una notte in una piastra di coltura cellulare di 15 centimetri con un volume sufficiente di soluzione colloidale di Coomassie, agitando delicatamente a temperatura ambiente. Smacchiare il gel in acqua distillata doppiamente, sostituendo il liquido ogni 15-20 minuti fino a quando lo sfondo del gel diventa chiaro. Conservare il gel in acqua distillata a quattro gradi Celsius fino a quando non viene scansionato per la quantificazione della banda.

Infine, scansiona il gel ad alta risoluzione e utilizza un software personalizzato disponibile in commercio per la quantificazione dell'intensità della banda proteica. Sottrarre il segnale di fondo da una regione vicina alle rispettive bande e normalizzare i valori ai valori di controllo senza detersivo. In questo esperimento, l'X31 derivato dal fluido allantoico chiarificato è stato sottoposto a centrifugazione in gradiente di velocità a livelli di pH compresi tra 7,4 e 5,0 e analizzato mediante SDS-PAGE.

Senza detergente presente nel gradiente, i virioni intatti vengono pellettati come riflesso dal caratteristico modello di bande, che rappresentano HA, NP e M1 nel gel colorato con Coomassie. Dopo l'aggiunta di NP40 allo strato inferiore di glicerolo, l'involucro virale, inclusi HA, NA e M2, è stato solubilizzato e il nucleo virale da solo è stato sedimentato nel pellet durante l'ultracentrifugazione. A partire da un pH inferiore a 6,5, M1 viene gradualmente perso dalla frazione del pellet, raggiungendo un minimo compreso tra pH 5,8 e pH 5,4.

Al di sotto del pH 5,8, i vRNP sono stati dissociati e quindi persi dal pellet. Dalle bande proteiche analizzate, sono state rivelate due distinte soglie di pH per il disassemblaggio dello strato M1 e la dissociazione dei fasci di vRNP, tra cui rispettivamente pH 6,5 e pH 5,8. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che a seconda del particolare ceppo virale dell'influenza A o mutante, si possono osservare diverse proprietà di disassemblaggio.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia elettronica per ottenere ulteriori informazioni come la struttura dei capsidi isolati del virus dell'influenza.