Name: In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Impara a smontare i capsidi del virus influenzale A in vitro mediante centrifugazione in gradiente di velocità. Questo metodo consente l'analisi quantitativa del processo di uncoating in condizioni sperimentali definite.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Yohei Yamauchi e Roberta Mancini per averci fornito i reagenti. Il laboratorio AH è stato sostenuto dalle reti di formazione iniziale Marie Curie (ITN), il Consiglio europeo della ricerca (CER), e dal Fondo Nazionale Svizzero (Sinergia).

1. Preparazione di Tamponi e soluzioni madre <ol><li> Preparare tampone MNT (20 mm MES, 30 mM Tris e 100 mm NaCl) sciogliendo 470 mg Tris cloridrato, 390 mg MES idratare e 580 mg di NaCl in 80 ml ​​di DDH 2 O. Regolare il buffer a pH 7,4 e portarlo ad un volume finale di 100 ml con DDH 2 O. </li><li> Preparare tre soluzioni identiche di 500 tampone mM MES sciogliendo 9,76 g MES idrato in 80 ml ​​di dH 2 O ciascuno. Regolare i buffer a pH 5.8, 5.4 e 5.0, rispettivamente per titolazione con NaOH concentrato. Portare ogni buffer ad un volume finale di 100 ml con dH 2 O. </li><li> Preparare due soluzioni identiche di 500 tampone Tris mM sciogliendo 7.88 g Tris cloridrato in 80 ml ​​dH 2 O ciascuno e regolare il pH a rispettivamente 7,4 e 6,4,, per titolazione con HCl concentrato. Portare il buffer ad un volume finale di 100 ml con dH 2 O. </li><li> Preparare la soluzione di glicerolo al 50% in DH 2 O e mescolare bene fino a quando il GLYCErol è omogeneamente misto. Filtrare la soluzione attraverso un gruppo di filtraggio Steritop (0,22 micron dimensioni dei pori) in una bottiglia di vetro. </li><li> Preparare soluzione al 10% NP-40 e 1 M NaCl in DH 2 O. </li><li> Preparare 25x inibitore della proteasi concentrata sciogliendo due compresse in 4 ml DDH 2 O. </li></ol> 2. Preparazione di glicerolo gradienti <ol><li> Preparare 5 ml di detersivo maestro tampone mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x concentrata inibitori della proteasi) soluzione per ogni condizione di pH a prova (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, e 5.0). A questo scopo, mescolare 9 ml di 1 M NaCl, 6 ml di 10% NP-40, 2,4 ml di inibitore della proteasi archivio 25x e 9 ml DDH 2 0. </li><li> Per ogni condizione di pH pipetta 4,4 ml di master mix in un tubo conico da 50 ml. </li><li> Per i valori di pH superiori a 5.8 aggiungere 0,6 ml del rispettivo pH aggiustato soluzione 500 mM Tris magazzino al tubo. Per pH 5,8 ed inferiore aggiungere 0,6 ml della rispettiva soluzione stock di 500 mm MES pH modificato. </li><li> Fare 5ml di soluzione tampone contenente 300 mM NaCl, inibitore della proteasi 2x, 60 mM Tris a pH 7,4 e DDH 2 O. Questo servirà come il buffer di controllo del gradiente senza detersivo. </li><li> Se necessario, fine-regolare il pH delle soluzioni a pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 e 5.0 aggiungendo soluzioni HCI o NaOH concentrati rispettivamente. </li><li> Aggiungere 5 ml di stock di glicerolo 50% a 5 ml della miscela tampone detergenti contenenti e senza detergenti risultanti in sei diverse soluzioni di glicerolo 25%. Verificare i valori di pH utilizzando strisce indicatrici pH. NOTA: Nel caso in cui il pH misurato differisce significativamente dal valore desiderato, le rispettive soluzioni dovrebbero essere preparate di nuovo. </li><li> Preparare la soluzione di glicerolo al 15% mescolando 50% stock di glicerolo con dH 2 O in un rapporto 3: 7. </li></ol> 3. Ultracentrifugazione di IAV <ol><li> Aggiungere 3 ml di soluzione di glicerolo al 15% in tubi centrifugazione ultra chiare (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) utilizzando una siringa da 5 ml e una neeDLE (21 G, 9 cm di lunghezza). Non lasciare gocce alla parete interna del tubo in quanto questo potrebbe disturbare l&#39;integrità del gradiente. Ripetere questo per un totale di sei tubi centrifugazione, uno per ciascuna delle cinque condizioni di pH per testare e uno per il campione di controllo. </li><li> Posizionare con cura soluzione di glicerolo 3,4 ml di 25% sotto il livello di glicerolo 15% utilizzando una siringa da 5 ml e un lungo ago. Fare attenzione a non mescolare i due strati. Ripetere questa operazione per tutte le sei condizioni per testare con le rispettive soluzioni di glicerolo pH regolato. NOTA: Il lavoro in classe II biosicurezza cabinet per i seguenti passaggi. </li><li> sovrapporre delicatamente i gradienti di glicerolo con 30 ml chiarito liquido allantoico contenente IAV (X31, H3N2) diluito in 1 ml MNT tampone (corrisponde a circa 20-30 mg di proteina virale totale) per ogni sfumatura. </li><li> Equilibrio opposte tubi e metterli in un rotore ultracentrifugazione SW41. Centrifugare per 150 min, a 55.000 xg, e 12 ° C. </li><li> Dopo la centrifugazione, accuratamenteRimuovere il surnatante, cioè, entrambi gli strati glicerolo utilizzando una pipetta Pasteur pulita e un aspiratore. Risospendere il pellet in 40 microlitri (1x) non riducenti tampone campione LDS. E &#39;importante pipettare su e giù più volte per sciogliere completamente il pellet. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li></ol> 4. SDS-PAGE di pellet frazioni e Coomassie colorazione <ol><li> Riscaldare tutti i campioni a 95 ° C per 10 min. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C finché non vengono analizzati mediante SDS-PAGE. </li><li> Carico 20 ml di pellet disciolti SU UN gradiente di pre-cast (4-12%) mini gel Bis-Tris e corrono per 1 ora a 200 V in 1x MOPS SDS tampone di corsa. </li><li> Fai la soluzione fissazione con il 40% di metanolo e acido acetico glaciale al 10% in DDH 2 O. </li><li> Incubare il gel in soluzione di fissaggio per 1 ora e macchiare notte in un 15 centimetri piatto di coltura cellulare con un volume sufficiente di soluzione colloidale Coomassie mentre delicatamenteagitazione a temperatura ambiente. NOTA: È importante chiudere il piatto in modo da evitare l&#39;evaporazione della soluzione colorante. </li><li> Decolorare il gel in DDH 2 O. Sostituire il DDH 2 O ogni 15-20 minuti fino a quando il fondo del gel diventa chiaro. Conservare il gel in DDH 2 O a 4 ° C fino a quando non viene sottoposto a scansione per la banda quantificazione. </li><li> Eseguire la scansione del gel ad alta risoluzione e di utilizzare il software disponibile o su misura commercialmente per la quantificazione di intensità di banda proteine. Sottrarre il segnale di fondo da una regione vicino alle rispettive bande e normalizzare questi valori per i campioni di controllo senza detergente (a pH 7,4). </li></ol>

<ol><li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Evolution%2C+Host+Adaptation%2C+and+Pandemic+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li>
<li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry%3A+the+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).</li>
<li>de Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+a+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).</li>
<li>Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+influenza+virus+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells.</a> J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+virus+entry+via+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Dissecting virus entry via endocytosis.</a> J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).</li>
<li>Yoshimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Cell+Entry+Mechanism+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus.</a> Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).</li>
<li>White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-fusion+activity+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane-fusion activity of influenza virus.</a> Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%3A+The+viral+matrix+protein+%28M1%29+promotes+export+and+inhibits+import%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import.</a> Cell. 67 (1), 117-130 (1991).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).</li>
<li>Chou, Y. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+Different+Influenza+Viral+RNA+Segments+in+the+Cytoplasm+before+Viral+Budding+as+Shown+by+Single-molecule+Sensitivity+FISH+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+incoming+influenza+virus+nucleocapsids+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus.</a> Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).</li>
<li>Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+M1+protein+and+low+pH+on+nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.</a> Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Controlled+Two-Step+Uncoating+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus.</a> Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).</li>
<li>Stauffer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+priming+by+acidic+pH+and+high+K%2B+is+required+for+efficient+uncoating+of+influenza+A+virus+cores+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration.</a> Journal of Virology. , (2014).</li>
<li>Zhirnov, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+matrix+protein+M1%2FM+from+virions+occurs+at+different+pH+for+orthomyxo-+and+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses.</a> Virology. 176 (1), 274-279 (1990).</li>
<li>Banerjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+uses+the+aggresome+processing+machinery+for+host+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry.</a> Science. 346 (6208), 473-477 (2014).</li>
<li>Huotari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin-3+regulates+late+endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cullin-3 regulates late endosome maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylase+8+Is+Required+for+Centrosome+Cohesion+and+Influenza+A+Virus+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).</li>
<li>Bachmayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Solubilization+of+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+from+Influenza+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses.</a> Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).</li>
<li>Reginster, M., Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Characterization+of+Influenza+Virus+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores.</a> Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).</li>
<li>Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+Investigation+on+the+Fine+Structure+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus.</a> Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).</li>
<li>Schulze, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+influenza+virus%3A+II.+A+model+based+on+the+morphology+and+composition+of+subviral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles.</a> Virology. 47 (1), 181-196 (1972).</li>
<li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+virus+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of virus uncoating.</a> Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).</li>
<li>Yamauchi, Y., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+entry+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Virus entry at a glance.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+Influenza+C+Viruses%2C+Distinct+from+That+of+Influenza+A+and+B+Viruses+Requires+Neutral-Alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH.</a> Virology. 200 (1), 284-291 (1994).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

capsids virali sono metastabili complessi macromolecolari. Durante il montaggio del virioni richiede l&#39;incapsidamento e condensazione del genoma del virus, l&#39;inizio del prossimo ciclo di infezione dipende lo smontaggio di tale struttura capside compatta. I virus sono evoluti per sfruttare vari meccanismi cellulari per controllare il ciclo di verniciatura-uncoating, inclusi recettori cellulari, accompagnatori, enzimi proteolitici, forze fisiche fornite da proteine ​​motrici o helicases nonché pH e interruttori io...

Virus influenzale A (IAV) è un virus con involucro e appartiene alla famiglia delle Orthomyxoviridae. I suoi geni sono codificati su un segmentato, negativo-senso e di genoma a singolo filamento di RNA. Negli esseri umani, IAV provoca infezioni respiratorie, che si verificano in epidemie stagionali e porta il potenziale di pandemie globali 1. Al legame con residui di acido sialico sulla superficie della cellula ospite 2, IAV è internalizzata per endocitosi clatrina-dipendente e le vie clatrina-indipendenti 3-8. L&#39;acido ambiente (pH &lt;5,5) nei vacuoli endocitici innesca un importante cambiamento conformazionale della IAV picco glicoproteina emoagglutinina (HA), che si traduce in fusione del virale e la fine della membrana 9 endosomal. Una volta che il capside IAV (qui noto anche come &quot;core&quot; virale) è sfuggito da endosomi ritardo (LES), è non rivestito nel citosol seguito dal trasporto dei ribonucleoproteine ​​virali (vRNPs) nel nucleo - il sito oreplicazione del virus F e trascrizione 10-13. Prima all&#39;attivazione acido HA del virus subisce una progressiva diminuzione del pH nel sistema endocitico, che innesca il nucleo per il suo successivo smontaggio 14-16. In questo &quot;priming&quot; passo i canali ionici M2 nella membrana virale mediare l&#39;afflusso di protoni e K +10,14,16. La variazione della concentrazione ionica nell&#39;interno virus disturba le interazioni costruire dal virale proteine ​​della matrice M1 e gli otto vRNP fascio, e facilita IAV uncoating nel citoplasma seguente fusione della membrana 10,14-17. Analisi diretta e quantitativa della fase di caricamento è stata ostacolata dal fatto che endosomi sono di difficile accesso sperimentalmente. Il processo di inserimento è inoltre altamente non sincrono. Inoltre, i test end-point, come qRT-PCR di misure di RNA o di infettività virale rilasciate, non forniscono un quadro dettagliato sullo stato biochimico del Capsi viraled in qualsiasi punto di entrata. Mentre perturbazione di endosomi di siRNA o trattamento farmacologico ha contribuito in modo significativo alla comprensione della IAV ingresso 18-20, messa a punto è difficile e soggetta a effetti collaterali non specifici nel programma endosome maturazione strettamente controllato. Per evitare questi problemi, abbiamo adattato un protocollo precedentemente sviluppato in vitro basato sull&#39;uso di gradiente di velocità di centrifugazione 17. A differenza di altri tentativi di 21,22, 23,24, che sono stati in gran parte basati su combinazioni di taglio proteolitico e il trattamento detergente seguita da analisi EM, questo approccio ha consentito un risultato facilmente quantificabile. Centrifugazione attraverso diversi strati gradiente permette alle particelle di sedimentazione per essere esposti e reagiscono con mutevoli condizioni in modo controllato. Nel protocollo presentato, IAV derivato dal liquido allantoico chiarito o particelle virali purificate sedimentate in una glicerolo a due stratigradiente in cui lo strato inferiore contiene il detergente non ionico NP-40 (Figura 1). Come il virus entra nel secondo strato, detergenti contenenti, i lipidi busta e busta glicoproteine ​​virali sono delicatamente solubilizzate e lasciati alle spalle. Il nucleo, composto da otto vRNP fascio e circondato da uno strato di matrice, sedimenti come una struttura stabile nella frazione pellet. proteine ​​essenziali virali, quali M1 e nucleoproteina vRNP-associato (NP), possono essere identificati in pellet mediante SDS-PAGE e colorazione Coomassie. In particolare, approfittando di gel gradiente disponibili in commercio e colorazione con l&#39;colloidale altamente sensibile Coomassie 25, permette alta precisione e rilevamento di quantità anche minime di proteine ​​essenziali associate virali. Questo pone le basi per testare se le condizioni diverse, come il pH, la concentrazione di sale, e fattori uncoating putativi avere effetto sul comportamento di sedimentazione delle componenti di base e il nucleo stabil<html> lità. A questo scopo, solo il strato detergenti contenenti più bassa nel gradiente di glicerolo viene modificato introducendo il fattore o condizione di interesse. La tecnica è stata particolarmente prezioso nelle indagini l&#39;effetto di differenti valori di pH e concentrazioni saline sull&#39;integrità del nucleo IAV 16. Passi intermedi di IAV uncoating potrebbero essere monitorati compresa dissociazione dello strato di matrice a pH leggermente acido (&lt;6.5) seguita da vRNP dissociazione a pH 5,5 ed inferiore 16,17 (figura 1). Quest&#39;ultima fase è stata ulteriormente potenziata dalla presenza di alta K + concentrazione nello strato di glicerolo, riflettendo un ambiente ritardo endocytic 16. Così, come il virus e il nucleo sedimentate attraverso il gradiente hanno sperimentato un ambiente che cambia che imita le condizioni in endosomi. Il risultato è stato uno smontaggio graduale del nucleo virale in vitro, integrando i risultati derivati ​​da test di biologia cellulare. t &quot;&gt; Il metodo presentato qui ha permesso veloce e analisi altamente riproducibile di IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) uncoating innescato da pH acido e aumentando K +16,17 così come lo smontaggio di core paramyxovirus su esposizione pH alcalino 17. Non si può escludere che l&#39;approccio può essere adattato ad altri virus con involucro di acquisire conoscenze in proprietà biochimiche della struttura del capside virale e capside smontaggio durante l&#39;immissione delle cellule.

<table><tbody><tr><td>compresse per inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11873580001</td><td>La soluzione madre può essere conservata a 2-8 gradi C per 1 o 2 settimane</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Merck Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo anidro BioChemica</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Merck Millipore</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Ago per iniezione lunga (21&nbsp; G, 9 cm, smussato o smussato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>Ora disponibile in commercio come IGEPAL&reg; CA-630</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% mini gel Bis-Tris, 10&nbsp; pozzetti, 1,0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS tampone per campioni (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS tampone di funzionamento (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Strisce indicatrici di pH, pH 4,0-7,0</td><td>Merck Millipore</td><td>109542</td><td></td></tr><tr><td>QC Colorazione colloidale per coomassie</td><td>BIO RAD</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>Sodio cloruro</td><td>Merck Millipore</td><td>106406</td><td></td></tr><tr><td>idrossido di sodio</td><td>Merck Millipore</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>unità filtrante Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti, set di rotori per ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall, provette per centrifuga ultratrasparenti, 13.2&nbsp; ml, 14 mm x 89 mm</td><td>Coltro di Beckman</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris cloridrato&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td></td></tr><tr><td>X31 Virus dell'influenza A (H3N2), uovo cresciuto, liquido allantoideo chiarificato</td><td>Virapur</td><td></td><td>Appena scongelato il 4 &deg; E</td></tr></tbody></table>

in vitro smontaggio del virus influenzale a capsids per centrifugazione in gradiente

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

I processi molecolari innescati dall'acido controllano da vicino l'ingresso cellulare di molti virus che entrano attraverso il sistema endocitico. Nel caso del virus dell'influenza A (IAV), la fusione del virus con la membrana endosomiale e il successivo disassemblaggio del capside virale, chiamato uncoating, è governato dalle condizioni ioniche all'interno delle vescicole endocitiche. Le prime fasi del ciclo di vita del virus sono difficili da studiare perché non è possibile accedere direttamente agli endosomi in via sperimentale, creando la necessità di un approccio in vitro. Qui, descriviamo un metodo basato sulla centrifugazione in gradiente di velocità di virioni purificati attraverso un gradiente di glicerolo a due strati, che consente l'analisi del nucleo IAV e della sua stabilità. Il gradiente contiene un detergente non ionico (NP-40) nel suo strato inferiore per rimuovere la membrana virale mediante solubilizzazione mentre il virus sedimenta verso il fondo. A pH neutro, i nuclei virali vengono pellettati come strutture stabili. I principali componenti principali, la proteina della matrice (M1) e le ribonucleoproteine virali (vRNP), possono essere chiaramente identificati nella frazione del pellet mediante SDS-PAGE. Diminuendo il pH a 6,0 o inferiore nello strato inferiore, si rimuove selettivamente M1 dal pellet, seguito dal rilascio di vRNP in condizioni più acide. Le bande proteiche virali su gel colorati con Coomassie possono essere sottoposte a quantificazione densitometrica per monitorare gli stati intermedi di disassemblaggio dell'IAV. Oltre al pH, è possibile valutare altri fattori che influenzano la stabilità del nucleo virale, come la concentrazione di sale e i fattori di scopertura virale putativi, semplicemente modificando di conseguenza lo strato di glicerolo contenente detergente. Nel complesso, la tecnica presentata consente un'analisi altamente riproducibile e quantitativa dell'uncoating virale in vitro. Può essere applicato ad altri virus avvolti che subiscono complessi processi di srivestimento.

Come già discusso, adescamento in endosomi è necessario per rendere il nucleo IAV uncoating competente. Protonazione del nucleo indebolisce interazione di M1 e vRNPs (composto di RNA virale, NP, e la polimerasi PB1 complesso / PB2 / PA). è iniziato questo processo quando il virus in arrivo è esposto ad un pH di 6,5 (o inferiore) in endosomi precoci (SEO) e continua fino a quando i fusibili virus in giro pH 5.0 a Les. Per simul...

Lo smontaggio dei nuclei del virus dell'influenza A durante l'ingresso del virus nelle cellule ospiti è un processo a più fasi. Descriviamo un metodo in vitro per analizzare le prime fasi dell'uncoating virale. In questo approccio, la centrifugazione in gradiente di velocità viene utilizzata per sezionare biochimicamente le fasi che avviano l'uncoating in condizioni definite.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

L'obiettivo generale di questa centrifugazione in gradiente di velocità è analizzare i capside del virus dell'influenza A in condizioni che imitano l'ambiente endocitico incontrato dai virus in entrata durante l'ingresso cellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo al modo in cui i capside del virus dell'influenza A si disassemblano durante l'ingresso cellulare, come l'effetto specifico di un pH leggermente acido sulla stabilità del capside. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un'analisi quantitativa del processo di decapsidazione del virus dell'influenza A in condizioni sperimentali definite.Oltre a fornire informazioni su come viene avviata la decapsidazione del virus dell'influenza A, questo metodo può essere applicato anche allo studio di altri virus a capside con meccanismi di decapsidazione simili. A dimostrare la procedura sarà Firat Nebloglu, un ex studente del mio laboratorio. Dopo aver preparato le soluzioni tampone e i reagenti secondo il protocollo descritto, per ogni condizione di pH da testare, preparare il mix master del buffer con detergente mescolando nove millilitri di cloruro di sodio uno Molare, sei millilitri di NP40 al 10%, 2,4 millilitri della soluzione stock di inibitore delle proteasi 25X e nove millilitri di acqua bidistillata.Quindi, per ogni condizione di pH, pipettare 4,4 millilitri della soluzione madre in un tubo conico da 50 millilitri. Per valori di pH superiori a 5,8, aggiungere al tubo 0,6 millilitri della rispettiva soluzione stock di Tris 500 milliMolare aggiustata al pH. Per valori di pH pari a 5,8 o inferiori, aggiungere 0,6 millilitri della rispettiva soluzione stock di MES 500 milliMolare aggiustata al pH.Preparare cinque millilitri di soluzione tampone, contenente cloruro di sodio 300 milliMolare, inibitore delle proteasi 2X, Tris 60 milliMolare, aggiustato a pH 7,4, e acqua doppio-distillata. Questa soluzione fungerà da tampone di gradiente privo di detergente. Successivamente, aggiungere cinque millilitri della soluzione madre di glicerolo al 50% a cinque millilitri delle miscele di tampone contenenti detergente e prive di detergente, ottenendo sei diverse soluzioni di glicerolo al 25%.Utilizzare strisce per il pH per verificare i valori di pH. Preparare una soluzione di glicerolo al 15% mescolando una proporzione di tre a sette di soluzione madre di glicerolo al 50% con acqua distillata. Utilizzando una siringa da cinque millilitri e un ago, aggiungere tre millilitri di soluzione di glicerolo al 15% a sei provette ultrachiare per centrifugazione.Lavare l'ago con acqua bidistillata dopo ogni passaggio. Utilizzare una siringa da cinque millilitri e un ago lungo per iniettare con attenzione 3,4 millilitri di soluzione di glicerolo al 25% al di sotto dello strato di glicerolo al 15%, avendo cura di non mescolare i due strati. Un'interfaccia tra i due strati è chiaramente visibile.Ripetere questa procedura per tutte e sei le condizioni da testare con le rispettive soluzioni di glicerolo aggiustate al pH. Successivamente, all'interno di un armadio di sicurezza di Classe II, utilizzare un millilitro di liquido allantocoico chiarificato e diluito, contenente il virus dell'influenza A, per sovrapporre delicatamente i gradienti di glicerolo. Trasferire le provette nei portaprovette del rotore, bilanciare le provette opposte e posizionarle con cura in un rotore per ultracentrifugazione SW-41 precedentemente raffreddato.Centrifugare a 2100 giri al minuto e 12 gradi Celsius per 150 minuti. Al termine della centrifugazione, utilizzare una pipetta Pasteur pulita e un aspiratore per rimuovere con attenzione entrambi gli strati di glicerolo. Quindi, risospendere completamente il pellet in 40 millilitri di buffer campione LDS 1X non riducente, aspirando e dispensando ripetutamente con la pipetta, prima di trasferire il campione in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri.Per eseguire l'SDS-PAGE, riscaldare tutti i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Caricare 20 microlitri dei pellet risospesi su un gel mini Bis-Tris gradient preconfezionato ed eseguire la corsa a 200 Volt per un'ora in tampone di corsa MOPS SDS 1X. Incubare il gel in soluzione di fissaggio per un'ora.Risciacquare una o due volte con acqua e colorare durante la notte in una piastra per colture cellulari da 15 centimetri con un volume sufficiente di soluzione di Coomassie colloide, agitando delicatamente a temperatura ambiente. Decolorare il gel con acqua bidistillata, sostituendo il liquido ogni 15-20 minuti fino a quando lo sfondo del gel diventa chiaro. Conservare il gel in acqua bidistillata a quattro gradi Celsius fino alla scansione per la quantificazione delle bande.Infine, scansionare il gel ad alta risoluzione e utilizzare un software personalizzato disponibile in commercio per la quantificazione delle intensità delle bande proteiche. Sottrarre il segnale di fondo proveniente da una regione vicina alle bande corrispondenti e normalizzare i valori rispetto ai valori del controllo senza detergente. In questo esperimento, X31 ottenuto da liquido allantocoico chiarificato è stato sottoposto a centrifugazione su gradiente di velocità a valori di pH compresi tra 7,4 e 5,0 ed analizzato mediante SDS-PAGE.In assenza di detergente presente nel gradiente, i virioni integri vengono pellettizzati, come indicato dal tipico schema di bande, rappresentanti HA, NP e M1 nel gel colorato con Coomassie. Aggiungendo NP40 allo strato glicerolico inferiore, l'involucro virale, comprensivo di HA, NA e M2, viene solubilizzato e soltanto il core virale sedimenta nel pellet durante l'ultracentrifugazione. A partire da un pH inferiore a 6,5, M1 viene progressivamente perso dalla frazione pellet, raggiungendo un minimo tra pH 5,8 e pH 5,4.Sotto pH 5,8, i vRNP si sono dissociati e quindi persi nel pellet. Dall'analisi delle bande proteiche, sono emersi due distinti valori soglia di pH per la disassemblaggio dello strato di M1 e la dissociazione dei fasci di vRNP, pari rispettivamente a pH 6,5 e pH 5,8. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che, a seconda del ceppo o della mutante specifica del virus dell'influenza A, possono essere osservate proprietà di disassemblaggio diverse.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la microscopia elettronica, al fine di ottenere ulteriori informazioni, come la struttura dei capside del virus dell'influenza isolati.

in-vitro-disassembly-influenza-virus-capsids-gradient

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il genoma del virus influenzale A si compone di otto complessi separati di RNA e proteine, chiamate complessi ribonucleoproteina virale (vRNPs). Questo documento descrive la purificazione gradiente glicerolo e microscopia elettronica visualizzazione trasmissione di influenza A vRNPs.

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

Noi descriviamo il processo di isolamento del DNA ad alta herpesvirus nucleocapside purezza dalle cellule infette. Il DNA finale catturato dalla soluzione è di alta concentrazione e purezza, rendendolo ideale per high-throughput sequencing, l'alta fedeltà reazioni di PCR, e trasfezioni per produrre nuovi ricombinanti virali.

Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

Uncoating è un passo essenziale nella fase iniziale del ciclo di vita di HIV-1 ed è definito come lo smontaggio del guscio capside e il rilascio del complesso ribonucleoproteina virale (vRNP). In questo studio dimostriamo tecniche per isolare nuclei intatti da HIV-1 virioni e per quantificare la loro...

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

Un modo semplice, efficace e robusto per sincronizzare l'erogazione di più componenti virali di cellule vegetali...

Semplice e robusta In vivo E In vitro</emApproccio> per lo Studio Assemblea Virus

I virus influenzali replicare il loro genoma RNA in associazione con la cellula ospite cromatina. Qui, vi presentiamo un metodo per purificare intatti complessi ribonucleoproteina virali dalla cromatina delle cellule infette. Purificato complessi virali possono essere analizzati mediante Western blot e sia di estensione del primer di proteine ​​e RNA, rispettivamente.

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Source: Stauffer, S. et al. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the pH-dependent disassembly of influenza A virus (IAV) cores using gradient ultracentrifugation. It outlines glycerol gradient preparation, ultracentrifugation, and how different pH conditions affect IAV core disassembly.

In Vitro Disassembly of the Influenza A Virus Core Using pH-Controlled Gradient Centrifugation

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Visualizing the Effect of pH on Solubilization of the Influenza A Viral Core

Metodi di rilevazione sistematica che utilizzano amplificazione del genoma virale sono limitati dalla loro incapacità di discriminare infettive da particelle non infettive. Lo scopo di questo articolo è di fornire protocolli dettagliati per metodi alternativi di aiuto nella discriminazione delle particelle infettive norovirus utilizzando l'associazione aptamer, diffusione dinamica della luce e microscopia elettronica di trasmissione.

Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

Integrasi retrovirale recombinante e oligomeri del DNA che imita le estremità del DNA virale possono formare un complesso enzimaticamente attivo conosciuto come un intasome. Intasomes possono essere utilizzati per studi biochimici, strutturali e cinetici. Questo protocollo i dettagli di come assemblare e purificare prototipo schiumoso virus intasomes.

Assemblaggio e purificazione del prototipo Virus schiumoso Intasomes

Il virus adeno-associato viene prodotto in coltura cellulare in sospensione e purificato mediante centrifugazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo. Sono incluse misure per aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione del virus e concentrare ulteriormente il prodotto finale del virus. I titoli finali attesi raggiungono10-12 particelle virali/mL e sono adatti per l'uso preclinico in vivo .

Produzione e purificazione in coltura in sospensione di virus adeno-associati mediante centrifugazione a gradiente di densità di iodixanolo per applicazioni in vivo

Con la continua evoluzione del campo della terapia genica, c'è una crescente necessità di metodi innovativi in grado di affrontare queste sfide. Qui viene presentato un metodo unico, che semplifica il processo di generazione di vettori AAV ad alto rendimento e ad alta purezza utilizzando una piattaforma di fabbrica cellulare, soddisfacendo gli standard di qualità per gli studi in vivo .

Una procedura semplificata e standardizzata per la generazione di vettori virali adeno-associati ad alto titolo e di alta qualità utilizzando una piattaforma di fabbrica cellulare

Impara a smontare i capsidi del virus influenzale A in vitro mediante centrifugazione in gradiente di velocità. Questo metodo consente l'analisi quantitativa del processo di uncoating in condizioni sperimentali definite.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Esplora altri video