Name: Studiare Wnt segnalazione Durante Patterning di condurre Airways (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Scopri le tecniche di colorazione per studiare la segnalazione Wnt nello sviluppo delle vie aeree superiori utilizzando modelli murini geneticamente modificati. Questo metodo consente l'analisi dettagliata della proliferazione cellulare e delle condensazioni mesenchimali nel tessuto embrionale.

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Riconosciamo l&#39;assistenza di Mike Muntifering e Matt Kofron con confocale e Gail Macke con procedure istologiche. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 per DS).

Gli animali sono stati alloggiati in condizioni esenti da organismi patogeni. I topi sono stati trattati secondo protocolli approvati dalla CCHMC Institutional Animal Care e del Comitato Usa (Cincinnati, OH USA). I topi utilizzati nel corso di questi studi sono stati mantenuti in uno sfondo misto. 1. monte intero X-galattosidasi colorazione <ol><li> Euthanize femmina incinta a E11.5 a E14.5, da CO 2 inalazione. Mettere gli animali nella camera di CO 2, caricare la camera con CO 2. Mantenere gli animali in camera per un minimo di 5 min. Eseguire il metodo secondario di eutanasia da dislocazione cervicale. </li><li> Pulire zona addominale con etanolo (EtOH) 70% ed eseguire laparotomia con un&#39;unica incisione mediana addominale. Utilizzare forbici chirurgiche e modello standard (seghettate dritto) pinza. </li><li> Isolare corna uterine con pinze e forbici sottili e collocare immediatamente il tessuto in capsula di Petri contenente raffreddato soluzione PBS. Mantenere il tessuto in ghiaccio fino procedereall&#39;isolamento di embrioni. </li><li> Isolare embrioni da corna uterine. Sezionare il tessuto polmonare tracheale embrionali utilizzando microscopio da dissezione. Utilizzare pinze punta fine e forbici per tenere e forare il tessuto uterino e del concepimento rilasciando gli embrioni. <ol><li> Rimuovere restante membrane embrionali. Con l&#39;aiuto di lame ago tagliare la testa di embrioni e la parte inferiore del corpo sotto il diaframma. Individuare fegato come un punto di riferimento. </li><li> Dopo isolamento della regione toracica dell&#39;embrione, procedere a rimuovere i lati laterali della parete del corpo, della colonna vertebrale e cuore con lame aghi. Fare attenzione durante la rimozione del cuore per evitare lesioni del tessuto tracheale. Infine, attenzione, separare l&#39;esofago dalla trachea tirando l&#39;esofago con l&#39;assistenza di lame aghi. Mantenere il tessuto in soluzione PBS in ghiaccio. </li></ol></li><li> Posizionare il tessuto in 4 ml di vite fiale cappuccio con pipette di vetro o di trasferimento. Fissare tessuto polmonare tracheale in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 30 min. Dopo la fissazione,lavare tessuti con PBS. Mentre il risciacquo, preparare la soluzione X-gal colorazione (aggiungere 5 mm K 3 Fe (CN) 6, (100 ml 0,5 m stock) 5 mm K 4 Fe (CN) 6 (100 l 0,5 m stock) 2 mM MgCl 2, ( 20 l 1 m stock) 0,01% NaDOC (50 ml 2% stock), 0,02% NP 4 O (100 ml 2% stock), 1 mg / ml di X-gal (500 ml di 20 mg / ml di magazzino) e 9.13 ml di acqua distillata per portare a volume finale di 10 ml). </li><li> Rimuovere ogni residuo PBS e aggiungere 2 ml di soluzione di colorazione X-gal per la fiala di vetro. Mettere in fiale vassoio agitatore. tessuti Stain 1 a 2 ore nella soluzione colorante X-gal. Incubare il tessuto in soluzione X-gal per 4 ore per l&#39;ulteriore elaborazione e incorporamento. </li><li> Bloccare la reazione dei tessuti di lavaggio a 3% dimetilsolfossido-PBS. Sciacquare in PBS, 3 volte per 5 minuti ogni lavaggio e conservare in etanolo al 70%. </li><li> Riempire Petri con una soluzione all&#39;1% di agarosio / PBS. Lasciare agarosio solidificare. Usando pipette di vetro, posizionare il tessuto sulla cooperazione agarosiopiastre ATED riempite con soluzione PBS. Fotografare supporti interi usando un microscopio da dissezione. Selezionare il filtro appropriato per campo chiaro. </li><li> Per distinguere meglio i siti di campioni processo di colorazione X-gal per paraffina e sezionamento. I campioni in cassette a maglia fine. <ol><li> Per elaborare i campioni per paraffina utilizzano un processore automatizzato e impostare un breve ciclo come segue: sei cambi di alcol: 5 min prima modifica e 3 minuti per ogni variazione residua. Tre variazioni di xilene: 5 min prima modifica e 3 min prossime due modifiche. I passi precedenti vengono eseguiti a 30 ° C. Infine, eseguire tre cambi di paraffina a 62 ° C: 25 min, 8 min e 5 min. </li></ol></li><li> campioni Orient per l&#39;integrazione con il tessuto disteso sul fondo di incorporare barca. Aggiungere con cautela paraffina a riempire la barca embedding. Raffreddare immediatamente sul piatto freddo di incorporare stazione fino solidifica paraffina. Rimuovere blocco da incorporare barca. Utilizzando un microtomo, generare 6 micron sriflessioni. sezioni Mount su pretrattati-diapositive e diapositive a secco su vetrino più caldo insieme a 42 ° C per 1 ora. </li><li> Cuocere scorre durante la notte in forno a 56 ° C. Collocare i vetrini in rack. Deparaffinare vetrini con tre cambi di 100% xilene, 10 minuti ciascuno. Utilizzare colorazione piatti riempito con 200 ml di xilene. </li><li> Reidratare diapositive utilizzando serie graduata EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 1 min per punti) in PBS prima controcolorazione con rosso nucleare da 10 a 30 sec. Sciacquare i vetrini con acqua di rubinetto tre volte per 5 minuti ogni volta per eliminare l&#39;eccesso di Nuclear Fast Red. </li><li> Disidratare i vetrini in una serie graduata di EtOH (50%, 70% e 100% EtOH) prima del lavaggio in tre cambi di xilene (20 buchi ogni cambio) e coprire scivolare con mezzo di montaggio a base di xilene. </li></ol> 2. lectina colorazione <ol><li> Sezionare E13.5 e E14.5 tracheale tessuto polmonare come descritto nei punti da 1.1 a 1.4. Usando pipette di vetro posto tessuto in flaconcini con tappo a vite. Fissare tessuto polmonare tracheale con 2 ml di2% soluzione PFA notte a 4 ° C. Dopo la fissazione, lavare i campioni in PBS per tre volte per 10 minuti ogni lavaggio. </li><li> Preparare tampone di bloccaggio, solitamente un volume finale di 10 ml di soluzione. Aggiungere 0,1 g di BSA (1%) a 8 ml di PBS. Lasciare BSA per sciogliere. Aggiungere 0,2 ml di siero di capra (2%) 0.03ml di Triton X-100 (0,3%). Portare il volume finale a 10 ml con PBS. campioni del blocco per 1 h in 0,5 ml di tampone di bloccaggio a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere tampone bloccante con una pipetta di trasferimento e sostituirlo con una soluzione lectina composto da 50 mg / mL di lectina, 10% siero di capra e PBS. Utilizzare 250 ml di soluzione di lectina per campione. Incubare per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di coprire la fiala di vetro contenente il tessuto con un foglio di alluminio. Dopo incubazione con soluzione lectina, risciacquare campioni in PBS per tre volte per 10 min. </li><li> Luogo espianti in rivestito agarosio capsule di Petri contenenti abbastanza PBS per coprire i campioni. Fotografare monta interi utilizzando un microscopio a fluorescenza-dissezione. Selezionare il appropFiltro riate per rilevare la fluorescenza. Lectina PNA ben si abbina alla GFP. </li></ol> 3. monte intero Immunofluorescenza e microscopia confocale <ol><li> Isolare tessuto polmonare tracheale, trasferimento a 4 ml vite vetro fiale tappo e fissare durante la notte nel 4% PFA. tessuto E11.5 può essere fissato in 2% PFA. Conservare in metanolo 100%. I campioni possono essere conservati fino a diversi mesi a -20 ° C. </li><li> Rimuovere il metanolo con una pipetta di trasferimento e permeabilize campioni utilizzando Bleach di Dent (4 parti Metanolo, 1 parte di DMSO e 1 parte il 30% di H 2 O 2) per 2 ore. tessuto Hydrate in una serie graduata di metanolo diluito in PBS come segue: 100% metanolo, 75% metanolo, 50% metanolo, 25% metanolo, 100% PBS. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente durante ogni fase di idratazione. </li><li> Tessuto Block in 0.5% reagente bloccante diluito in PBS (vedi Materiali particolari) per due ore a temperatura ambiente con agitazione. </li><li> Diluire anticorpo primario nel bloccaresoluzione (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) e incubare campioni notte a 4 ° C. Lavare i campioni con PBS cinque volte a temperatura ambiente. Eseguire ogni lavaggio per 1 ora. </li><li> Applicare anticorpo secondario ad una diluizione 1: 500 in soluzione bloccante 0,5%. selezionare con attenzione anticorpi secondari per evitare legame tra anticorpi secondari. Incubare per una notte a 4 ° C in camera oscura. Lavare i campioni tre volte per 20 minuti a temperatura ambiente. Disidratare campioni in una serie graduata di metanolo diluito in PBS come segue: 25% metanolo, 50% metanolo 75% di metanolo, 100% metanolo, 10 min ogni passo. Nota: Assicurarsi che i campioni rimangono coperte con un foglio di alluminio e ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. Tissue può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane fino fotografato. </li><li> Campioni di trasferimento a su ordine piastre di scena, rimuovere il metanolo e chiaro con circa 200 ml di soluzione chiara di Murray 19,20 (2 parti benzilico benzoato, 1 parte di alcool benzilico) immediatamente BEFl&#39;imaging minerale. Fotografia usando un microscopio confocale. Elaborare e analizzare immagine utilizzando il software di imaging. </li></ol> 4. proliferazione cellulare <ol><li> Iniettare E11.5 topi incinta intra-peritoneally con una soluzione di BrdU ad una concentrazione di 100 ug BrdU / g di peso corporeo. Sacrificio femminile come descritto nella sezione 1 del protocollo e isolare embrioni a E12.5 e E13.5. Usando lame di coltello, teste di consumo e la parte inferiore del corpo al di sotto della cavità toracica. </li><li> Mettere il tessuto toracico in 4 ml di vite fiale tappo e fissare in 1 ml di PFA 4% durante la notte. Lavare i campioni con PBS due volte per 5 min e disidratano campioni attraverso una serie di etanolo diluito in acqua distillata fino al 70% di etanolo come segue: 30%, 50% e 70% di etanolo, per 5 minuti ogni passo. <ol><li> I campioni di medie dimensioni dello schermo cassette. tessuti Processo per incorporamento di paraffina utilizzo e il processore automatizzato. Impostare un ciclo come segue: sei cambi di alcol per 8 minuti ciascuno, tre cambi di xilene per 6 minuti ciascuno, tre cHANGES di paraffina, per 25 minuti, 9 min e 8 min. </li></ol></li><li> Incorpora in paraffina orientare il tessuto nella posizione desiderata per generare 6 trasversali micron o sezioni longitudinali, come descritto nella sezione 1. Posizionare sezioni su vetrini e consentire il tessuto di aderire a scivolare sulla slitta insieme più calda a 42 ° C per 1 ora. </li><li> scivoli cuocere, su un fianco, durante la notte in forno a 56 ° C. Collocare i vetrini in rack di plastica. scivoli Sparaffinare per immersione in tre cambi di 100% xilene, 10 min a cambio. Utilizzare 200 ml di xilene per sommergere completamente diapositive. Reidratare diapositive utilizzando serie graduata EtOH (100%, 70%, 50% e 30%, 5 min per passo con agitazione) di PBS (5 min). </li><li> Eseguire recupero dell&#39;antigene utilizzando 10 mM tampone citrato, pH 6. Per preparare 100 ml di miscela di tampone citrato 18 ml di 0,1 M di acido citrico monoidrato e 82 ml di 0,1 M citrato di sodio. <ol><li> I campioni in vasi Coplin di plastica pieni di soluzione di antigene recupero e forno a microonde per 6,5 minuti ad alta potenza. Aggiungere disacqua distillata a vaschetta Coplin per compensare evaporata-citrato buffer e riscaldare alla potenza del 40% per 6 min. </li><li> Riempire vaschetta Coplin verso l&#39;alto con l&#39;acqua, e riscaldare di nuovo al potere il 40% per 6 min. volte a microonde possono variare in base a microonde utilizzata. </li><li> Lasciare vetrini raffreddare per 20 minuti a temperatura ambiente prima vetrini lavaggio in acqua distillata per 1 min, seguito da PBS per 5 min. Dopo il PBS lavare, vetrini blocco per 2 ore in una soluzione bloccante contenente TBS (2.425 g di Tris base e 8,765 g di NaCl diluito in 1 L di acqua distillata) 10% di siero asino e 1% BSA. </li></ol></li><li> Aggiungere anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante (TBS contenente 10% di siero Ciuchino e 1% BSA). BrdU (marcatore mitosi), Nkx2.1 (epitelio delle vie respiratorie), Sox9 (cellule che daranno luogo alla cartilagine) e αSMA (cellule muscolari lisce). Incubare i vetrini durante la notte, a 4 ° C. Utilizzare il metodo di sovrapposizione per conservare gli anticorpi. Applicare 180 ml di anticorpi di una guarnizione e quindi collegare slitta come se la copertura antiscivoloping. </li><li> Staccare la guarnizione immergendo i vetrini in acqua distillata. Dopo la rimozione della guarnizione, lavare anticorpo primario non legato eseguendo sei 5 min lavaggi con TBS contenente 0,1% Tween-20. <ol><li> Incubare i vetrini con anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante alla diluizione di 1: 200, per 1 ora a temperatura ambiente. Selezionare accuratamente anticorpi secondari per evitare indesiderate legame tra di loro. Rimuovere l&#39;anticorpo secondario non legato eseguendo tre a cinque lavaggi minuti con TBS contenente 0,1% di Tween. </li><li> Lavare i vetrini in 0,1 M di base Tris due volte per 5 minuti e poi 0,05 di base M Tris due volte per 5 min. I vetrini possono essere lasciato in 0,05 di base M Tris mentre coversliping utilizzo dei supporti di montaggio con o senza DAPI (1,5 mg / ml). Conservare i vetrini nella cartella di diapositive a 4 ° C e al riparo dalla luce coprendo cartella con un foglio di alluminio. </li></ol></li><li> Visualizza colorazione e fotografia utilizzando un microscopio a fluorescenza automatizzato. Contare etichettati cellule e cellule totali per campo fotografato al20X e 40X per determinare i rapporti di cellule proliferanti di cellule totali. </li></ol>

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<li>Boucherat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+functional+redundancy+between+Hoxa5+and+Hoxb5+paralog+genes+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).</li>
</ol>

&quot;Gli autori non hanno nulla da rivelare.&quot;

Eventi sottostanti morfogenesi del tratto respiratorio sono state comprese, in particolare i processi necessari per il patterning delle vie aeree di conduzione. Studi precedenti hanno utilizzato ex vivo le tecniche di cui espianti in via di sviluppo sono coltivate all&#39;interfase aria-liquido o incorporato in matrigel 21,22. Questi studi hanno dimostrato come fattori di crescita influenzano il patterning della trachea sviluppo e la formazione di tracheale cartilagine. Una limitazione a questi studi...

Lo sviluppo delle vie respiratorie è avviata da embrionali giorno 9 (E9) con la comparsa di cellule positive Nkx2.1 nel endodermico ventrale foregut 1,2. Esofago-tracheale separazione tubo si risolverà da E11.5 quando i tubi possono essere distinte come entità distinte, ognuna circondata dal tessuto mesenchimale 3. Wnt svolge un ruolo chiave nella specifica delle vie respiratorie come l&#39;eliminazione di Wnt2 e Wnt2b, espressa dal mesenchima splancnico e la cancellazione di β-catenina dal epitelio respiratorio endodermico si tradurrà in agenesia del polmone 4,5. I nostri studi precedenti hanno stabilito che la cancellazione di WLS, un recettore carico mediazione secrezione di tutti i ligandi Wnt, dai risultati del tratto respiratorio endodermico a ipoplasia polmonare, difetti di sviluppo vascolare polmonare e mis-patterning del tracheale mesenchima 6,7. Questi dati supportano l&#39;importanza del cro epitelio-mesenchimaless parlare nel differenziamento cellulare e specifica, come è stato mostrato anche in altri studi 8,9. Lo studio delle prime fasi di sviluppo del polmone si basa su genetica, in vitro ed ex vivo tecniche che hanno permesso di comprendere meglio i meccanismi di guida identità respiratoria 10-16. Intere culture espianto polmone all&#39;interfase liquido dell&#39;aria sono stati ampiamente utilizzati per studiare gli effetti di fattori di crescita nelle prime fasi di polmonare branching morfogenesi 10,17,18. Mentre questo metodo è usato come lettura dei cambiamenti morfologici, come morfogenesi di ramificazione, e la modulazione dell&#39;espressione genica, è limitato allo studio delle prime fasi del processo di sviluppo, la cultura stessa non supporta lo sviluppo di vascolarizzazione 17. Sviluppo di tracheale cartilagine richiede tempi di incubazione più lunghi che possono essere non compatibili con questa tecnica di coltura. per Analyze il ruolo di segnalazione Wnt durante la formazione del tratto respiratorio, abbiamo adattato le tecniche standard per soddisfare le esigenze dei nostri studi embrionali. Abbiamo modificato i volumi, i tempi di colorazione, trattamento ciclismo per paraffina e la tempistica per la compensazione del tessuto tracheale-polmonare. L&#39;obiettivo principale di ottimizzare le tecniche descritte nel presente studio è stato quello di analizzare le prime fasi di sviluppo tracheale nei topi che si svolgono da E11 a E14.5. Utilizzando il topo giornalista linea Axin2LacZ noi siti precisamente determinati di attività / β-catenina Wnt in via di sviluppo mesenchima tracheale. Abbiamo anche adattato procedura di colorazione lectina per tutto il tessuto tracheale monte. Così, siamo stati in grado di visualizzare condensazioni mesenchimali e prevedere siti dove chondrogenesis avrà luogo. La colorazione di tutto il monte e sezioni di tessuto embrionale ottenuti da topi WlsShhCre, insieme con tecniche di microscopia avanzate, ci ha permesso di svelare il ruolo di ligandi Wnt prodotte dal TRAepitelio endotracheale nella trachea patterning.

<table><tbody><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400 , coniglio</td></tr><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-20095</td><td>1:50, coniglio</td></tr><tr><td>Anti Muscoli Lisci Actina ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, mouse</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:100, cavia</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Sette Colli</td><td>n/a</td><td>1:400, topo</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, pecora</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, topo</td></tr><tr><td>PNA Lectina</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi secondari</td><td>Tecnologie</td><td></td> di vita <td>Alexa fluor Sonde molecolari</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP4O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Fisher marca super-frost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Componente del kit TSA #2&nbsp; &nbsp; &nbsp; ( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Vectashield</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Cassette Tissue-loc Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>Cassette per biopsia</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>Disponibile in diversi colori</td></tr><tr><td>Nuclear fast red&nbsp; Kernechtrot 0,1%</td> <td>Sigma</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio tribasico diidrato</td><td>Sigma</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Trizma cloridrato</td><td>Sigma</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Micro coltelli</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 rivestito in ceramica</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td>Microscopio a</td><td>campo largo</td>NikonA1Rsi<td></td></tr><tr><td>,</td><td>Microscopia</td> confocale Nikon<td></td><td>. Impostazioni: fotocamera NikonA1 plus, scanner: Galvano, rilevatore: DU4. Ottica Plan Apo lambda 10X. Modalità: laser a fluorescenza a campo largo confocale.</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Microscopio da dissezione a fluorescenza</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopio a fluorescenza automatizzato</td></tr><tr><td>Suite di applicazioni Leica Software</td><td>di imaging</td><td></td> Leica <td></td></tr><tr><td>NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software di imaging Nikon</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Software di elaborazione dell'imaging</td></tr></tbody></table>

studiare wnt segnalazione durante patterning di condurre airways

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Le vie di segnalazione Wnt svolgono un ruolo critico durante lo sviluppo delle vie respiratorie. La definizione di precisi meccanismi di differenziazione e morfogenesi controllati dalla segnalazione Wnt è necessaria per comprendere come i tessuti sono modellati durante il normale sviluppo. Questa conoscenza è fondamentale anche per determinare l'eziologia di difetti alla nascita come l'ipoplasia polmonare e la tracheobroncomalacia. L'analisi delle prime fasi di sviluppo delle vie respiratorie pone delle sfide, poiché la quantità limitata di tessuto impedisce l'esecuzione dei protocolli standard più adatti agli studi postnatali. In questo articolo, discutiamo le metodologie per studiare il differenziamento e la proliferazione cellulare nel tratto respiratorio. Descriviamo tecniche come la colorazione dell'intera montatura, il processamento del tessuto per la microscopia confocale e l'immunofluorescenza in sezioni di paraffina applicate allo sviluppo del polmone tracheale. Discutiamo anche le metodologie per lo studio del differenziamento del mesenchima tracheale, in particolare la formazione della cartilagine. Gli approcci e le tecniche discussi nel presente articolo aggirano la limitazione del materiale durante il lavoro con il tessuto embrionale, consentendo una migliore comprensione del processo di patterning dello sviluppo delle vie aeree conduttrici.

attività / β-catenina Wnt Tutta la colorazione monte Lac-Z è stato rilevato nel tessuto tracheale-polmonare di embrioni isolati da giornalista Axin2 Lac Z topi 11. Siti di colorazione indicano l&#39;attività / β-catenina Wnt. Analisi di sezioni di montare tutto colorazione determinato che Wnt attività / β-catenina era presente nel mesenchima della trachea e mesenchima delle regioni per...

L&#39;uso di topi reporter accoppiati a tutto il monte e sezione colorazione, microscopia e in vivo facilita l&#39;analisi dei meccanismi alla base della normale patterning del tratto respiratorio. Qui si descrive come queste tecniche hanno contribuito all&#39;analisi di segnalazione Wnt durante lo sviluppo tracheale.

Studiare Wnt segnalazione Durante Patterning di condurre Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

L'obiettivo generale delle procedure di colorazione è dimostrare il ruolo della via di segnalazione Wnt nelle prime fasi dello sviluppo delle vie aeree superiori, utilizzando tessuto embrionale proveniente da modelli murini geneticamente modificati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia polmonare, come ad esempio in che modo vengono organizzate le strutture di sostegno delle vie aeree conduttive.Le tecniche che presenteremo qui ci permetteranno di studiare la proliferazione cellulare o il processo di condensazioni mesenchimali, eventi chiave nella formazione della cartilagine tracheale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzata su piccole quantità di tessuto. Questo include espianti polmonari e trachee isolate da embrioni E11.In generale, le persone nuove a questa procedura potrebbero incontrare difficoltà a causa delle piccole dimensioni del campione e della limitata quantità di tessuto disponibile. È necessario sentirsi a proprio agio nel manipolare tessuti embrionali, prestando attenzione durante tutti i passaggi e assicurandosi che la quantità di tessuto rimanga costante da un passaggio all'altro. Dopo l'eutanasia di un topo femmina gravida tra E11,5 ed E14,5 e l'esecuzione di una laparotomia secondo il protocollo descritto, utilizzare pinze e forbici fini per isolare le corna uterine e posizionare immediatamente il tessuto in una piastra di Petri contenente soluzione di PBS fredda.Quindi posizionare la piastra su ghiaccio. Per isolare gli embrioni dalle corna uterine, utilizzare pinzette fini per tenere il tessuto uterino. E con le forbici, perforare il tessuto uterino e il concetto, liberando gli embrioni.Successivamente, rimuovere eventuali membrane embrionali residue. Quindi, sotto un microscopio stereoscopico e utilizzando lame a ago, asportare la testa e la parte inferiore del corpo, al di sotto del diaframma, e individuare il fegato come punto di riferimento. Utilizzare le lame a ago per rimuovere i lati laterali della parete corporea, la spina dorsale e il cuore.Avendo cura di non danneggiare il tessuto tracheale. Per dissezionare il tessuto polmonare tracheale embrionale, separare con attenzione l'esofago dalla trachea utilizzando lame di ago per tirare l'esofago. Posizionare il tessuto in PBS su ghiaccio prima di utilizzare pipette di vetro o pipette di trasferimento per trasferire il tessuto in vial di vetro con tappo a vite da quattro millimetri.Aggiungere il 4% di paraformaldeide, o PFA, in PBS e incubare per 30 minuti. Quindi risciacquare il tessuto con PBS. Dopo aver rimosso il PBS dai campioni, aggiungere due millimetri di soluzione di colorazione X-gal e incubare per uno o due ore, oppure per quattro ore se necessario un ulteriore trattamento e inclusione.Interrompere la reazione utilizzando PBS con 3% DMSO per lavare il tessuto tre volte, per cinque minuti ciascuna. Successivamente, conservare il tessuto in etanolo al 70%. Dopo aver processato i campioni con un apparecchio automatico per l'inclusione in paraffina seguendo il protocollo indicato, orientare i campioni con il tessuto appiattito sul fondo di una barchetta per inclusione.Aggiungere con attenzione la paraffina per riempire la barchetta di inclusione e posizionarla immediatamente sulla piastra fredda della stazione di inclusione fino a quando la paraffina non si solidifica. Successivamente, rimuovere il blocco dalla barchetta di inclusione e, mediante microtomo, tagliare sezioni di sei micrometri. Montare quindi le sezioni sui vetrini.E posizionare le sezioni su un termopiatto a 42 gradi Celsius per un'ora. Incubare i vetrini in un forno a 56 gradi Celsius per tutta la notte. Successivamente, per deparaffinizzare i campioni, posizionare i vetrini cotti in portavetrini e trasferirli in vaschette di colorazione contenenti 200 millilitri di xilolo al 100%, tre volte per 10 minuti ciascuna.Utilizzare una serie di etanolo in gradazione per riallontanare i vetrini, un minuto per ogni soluzione. Quindi usare il Rosso Fast Nucleare per la controcolorazione dei campioni da 10 a 30 secondi. Risciacquare i vetrini con acqua corrente tre volte, per cinque minuti ciascuna.Per disidratare i vetrini, utilizzare una serie di etanolo in graduazione prima di lavare i campioni in tre cambi di xilene. Quindi utilizzare un mezzo di montaggio a base di xilene e coprioggetti per montare i campioni. Per eseguire la colorazione con lectine, dopo aver fissato il tessuto polmonare tracheale e preparato il buffer di blocco secondo il protocollo descritto, trasferire i campioni in 0,5 millilitri di buffer di blocco e incubare a temperatura ambiente per un'ora.Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere il buffer di blocco e sostituirlo con 250 microlitri di soluzione di lectina per ogni campione. Quindi, coprire i vial di vetro con carta d'alluminio e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, dopo aver lavato i campioni con PBS, posizionare gli espianti in piastre di Petri rivestite con agarosio contenenti PBS in quantità sufficiente a coprire i campioni.Quindi utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per fotografare i preparati interi. Per eseguire la colorazione immunofluorescente su preparati interi, dopo aver fissato i campioni secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere il metanolo, quindi aggiungere una soluzione concentrata di ipoclorito e incubare il tessuto per due ore per rendere i campioni permeabili. Idratare il tessuto mediante una serie progressiva di metanolo diluito in PBS, incubando a temperatura ambiente per 10 minuti a ogni passaggio.Dopo aver bloccato il tessuto secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere gli anticorpi primari e la soluzione di blocco, quindi incubare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte. Una volta lavati i campioni in PBS, aggiungere una diluizione da uno a 500 di anticorpi secondari in PBS ed incubare al buio a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, dopo aver lavato i campioni tre volte per 20 minuti ciascuno in PBS, utilizzare una serie graduata di metanolo in PBS per disidratare i campioni per 10 minuti a ogni passaggio.Trasferire i campioni su piastre di supporto su misura. Rimuovere il metanolo. Quindi utilizzare 200 microlitri di soluzione chiara di Murray per chiarire i campioni.Acquisire immediatamente l'immagine utilizzando un microscopio confocale. Dopo aver iniettato topi gravidi E11.5 con BrdU ed aver isolato gli embrioni a E12.5 o E13.5 secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare lame per asportare le teste embrionali e le parti inferiori del corpo, al di sotto delle cavità toraciche. Posizionare il tessuto toracico in vial con tappo a vite da quattro millilitri e aggiungere un millilitro di PFA al 4%.Dopo l'inclusione, la sezionatura e la reidratazione dei campioni secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare i vetrini in barattoli Coplin e riempirli con tampone citrato 10 millimolare, pH 6. Sottoporre i campioni a microonde ad alta potenza per sei minuti e mezzo, quindi utilizzare acqua distillata per rimpiazzare il tampone citrato evaporato e riscaldare nuovamente. Dopo il raffreddamento, il lavaggio e il blocco dei vetrini secondo il protocollo descritto nel testo, applicare 180 microlitri di anticorpi primari, diluiti nella soluzione di blocco, su una guarnizione e attaccare il vetrino come se si stesse applicando un coprioggetto.Il giorno seguente, immergere i vetrini in acqua distillata per rimuovere la guarnizione. Quindi lavare i vetrini sei volte per cinque minuti ciascuna con TBS contenente 0,1% di Tween 20. Dopo l'incubazione con gli anticorpi secondari, lavare i vetrini due volte per cinque minuti ciascuna con Tris Base 0,1 molare, prima di lavarli due volte con Tris Base 0,5 molare.Mantenere i vetrini in Tris Base 0,05 M mentre si aggiunge il mezzo di montaggio, con o senza DAPI, quindi applicare un coprioggetto. Infine, utilizzare un microscopio a fluorescenza automatico per acquisire le immagini dei campioni ed eseguire l'analisi seguendo il protocollo descritto nel testo. In questa figura di tessuto polmonare traqueale in preparato intero, isolato da topi Reporter e da due topi lacZ, la colorazione lacZ è stata rilevata nel mesenchima della trachea e nelle regioni periferiche dei polmoni in via di sviluppo, indicando l'attività di Wnt beta catenina.In questo esperimento, tessuti polmonari tracheali da E12,5 a E14,5 sono stati colorati con la lectina PNA. Negli animali di controllo, la fluorescenza è stata rilevata come bande periodiche nel mesenchima in cui si forma la cartilagine. Tuttavia, l'assenza di colorazione negli embrioni Wntless sonic hedgehog Cree indica che il segnale Wnt è necessario per le condensazioni mesenchimali.In preparati interi di tessuto tracheale di embrioni E11,5, l'espressione di SOX9 è limitata al mesenchima sotto forma di una striscia continua, mentre nel polmone in via di sviluppo SOX9 è osservato alla periferia dell'epitelio respiratorio. Come mostrato qui, NKX2.1 è confinato all'epitelio della trachea. L'inibizione della secrezione di ligandi Wnt da parte dell'epitelio riduce l'espressione di SOX9 nel mesenchima, ma non influenza l'espressione di SOX9 nell'epitelio polmonare periferico.La colorazione per l'actina alfa del muscolo liscio è rilevata a livelli bassi nel tessuto tracheale, ma è chiaramente osservabile nel tessuto del laringe e dello stomaco. Infine, come indicato in questa figura, la marcatura in vivo del tessuto tracheale con BrdU, SOX9 e actina alfa del muscolo liscio dimostra che le cellule positive per SOX9 proliferano a un livello maggiore rispetto alle cellule positive per l'actina alfa del muscolo liscio. Questo schema di proliferazione si inverte nel tessuto tracheale di Wntless sonic hedgehog Cree.Una volta acquisite, la maggior parte di queste tecniche può essere eseguita in due giorni se svolta correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare la provenienza dell'anticorpo primario quando si sceglie l'anticorpo secondario. Questo aspetto è importante per tutte le immunomarcature, ma assume particolare rilevanza quando si utilizzano più anticorpi primari.Dopo la colorazione con X-galattosidasi, possono essere eseguite ulteriori tecniche come l'ibridazione in situ per ottenere informazioni aggiuntive e rispondere a ulteriori domande, ad esempio se un particolare gene di interesse verrà espresso durante la segnalazione Wnt. Le tecniche presentate in questo video saranno utili per i ricercatori interessati ai meccanismi di patterning silente mediati dalla segnalazione Wnt o ad altri importanti percorsi di segnalazione nello sviluppo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare il processo di differenziazione durante lo sviluppo dell'apparato respiratorio.E acquisire anche una migliore comprensione del ruolo della segnalazione Wnt nel patterning delle vie aeree conduttive. Non dimenticare, quando si lavora con paraformaldeide e benzoato di benzile, di adottare le opportune precauzioni, come indossare guanti, preparare le soluzioni sotto cappa e smaltire le soluzioni di scarto in conformità alle leggi e ai regolamenti locali.

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