Name: Applicazioni del singolo-probe: Mass Spectrometry Imaging e analisi singola cella in condizioni ambientali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Impara l'uso del Single-probe per l'imaging spettrometrico di massa ambientale e l'analisi di singole cellule vive. Questa tecnica consente analisi ad alta risoluzione di tessuti biologici e distribuzione molecolare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Laskin (il Pacific Northwest National Laboratory) per aver condiviso il software di controllo del palco motorizzato e il programma di visualizzazione MSI. Ringraziamo anche il Dr. Mao (Università dell'Oklahoma) per aver fornito campioni di organi di topo e il Sig. Chad E. Cunningham (Università dell'Oklahoma) per l'assistenza nella lavorazione meccanica e nel lavoro elettronico. Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del Research Council dell'Università dell'Oklahoma Norman Campus, dell'American Society for Mass Spectrometry Research Award (sponsorizzato da Waters Corporation), dell'Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (Grant HR 14-152) e del National Institutes of Health (R01GM116116).

uso e benessere degli animali devono aderire alla guida NIH per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio seguendo protocolli esaminato e approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC). campioni di tessuto del mouse sono stati forniti dal collaboratore Dr. Chuanbin Mao. 1. Tessuto mouse sezione Preparazione <ol><li> Collocare un intero organo topo di interesse (cervello, rene, fegato, ecc) nel centro di un piccolo plastica pozzetto (es, 12-pozzetti di coltura cellulare), e immergere nel tessuto incorporamento composto fino a circa 10 mm di altezza. Assicurarsi che non vi è alcuna bolla formata nel composto incorporamento dei tessuti, e l&#39;organo è collocata in posizione desiderata (cioè, sagittale, coronale, etc.). </li><li> Immediatamente posto tessuti in azoto liquido per il flash di congelamento. Per la conservazione a lungo termine, conservare i campioni congelati in un freezer -80 ° C. </li><li> Prendere l&#39;organo congelati mouse e scongelare a -15 ° C in una temperi criomicrotomo controllata. </li><li> tessuto sicura su base in acciaio con circa 500 ml di tessuto composto incorporamento e posto su un criomicrotomo sezionamento supporto in modo che l&#39;orientamento sezionamento desiderati viene presentato al coltello. </li><li> Sezione tessuto ad uno spessore 12 micron. Mettere le fette di tessuto sezionati su vetrini da microscopio in policarbonato e lasciare asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. Per la conservazione a lungo termine, conservare il vetrino congelato in un -80 ° C freezer. </li></ol> Culture 2. cellulare Nota: La coltura cellulare è stata eseguita in cappa di sicurezza biologica (Biosafety livello II) in condizioni sterili. linea cellulare HeLa è stata utilizzata come sistema modello, e le cellule sono state coltivate in mezzo completo di coltura con i seguenti protocolli convenzionali: <ol><li> Reagenti caldi (ad esempio, tripsina, tampone fosfato salino (PBS), e coltura cellulare medie) a 37 ° C. Nota: Il terreno di coltura cellulare contenente sa inorganicoLTS, aminoacidi, vitamine, e altri. Per un elenco completo dei componenti, fare riferimento alla formulazione dal produttore. </li><li> Ottenere campione cellulare (ad esempio, 1 ml di sospensione di cellule HeLa) ed inserirlo in 9 ml di mezzo completo di coltura cellulare in una piastra di coltura cellulare standard 10-cm. Il numero di cellule iniziale è intorno a 0,5 x 10 6 cellule / ml. Mantenere cellule in coltura a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2-3 giorni finché la superficie è coperta crescente a 70-80% sulla piastra di coltura cellulare. numero di cellulare di passaggio record per ogni turno successivo. </li><li> Eseguire passaging cellule (cioè, splitting cella) nella piastra di coltura cellulare. <ol><li> Aspirare mezzo di crescita, e usare 5 ml di PBS 1x per sciacquare le cellule. Rimuovere PBS utilizzando una punta di aspirazione sterile e incubare le cellule con 2,5 ml di tripsina (0,25%) per ~ 5 min a 37 ° C per staccare le cellule dalla piastra di coltura. Nota: è necessario il tempo effettivo trattamento tripsina essere ottimizzata in base alla specifica produ tripsinact ha acquistato dal produttore. tempo di trattamento inadeguata lascia le cellule attaccate alla piastra, mentre il trattamento eccessivo porta alla morte cellulare. </li><li> Interrompere l&#39;attività tripsina aggiungendo 7,5 ml completa mezzo di coltura cellulare, e quindi risospendere uniformemente le cellule (volume totale 10 ml). Utilizzare la sospensione cellulare per la cultura (passo 2.2) o nella preparazione di campioni SCMS (passo 2,4). </li></ol></li><li> Preparare i campioni di cellule per gli esperimenti SCMS. <ol><li> Mettere diapositive singole micro copertura in un 12-pozzetti e aggiungere terreno di coltura 1,8 ml di cellule e 0,2 ml di sospensione cellulare nel pozzo. </li><li> Mescolare delicatamente le cellule con leggera agitazione della piastra e incubare in un ambiente 5% di CO 2 a 37 ° C per ~ 24 ore. Per eseguire il trattamento farmacologico alle cellule in coltura, aggiungere una soluzione composto medicinale (ad esempio, in DMSO (dimetilsolfossido)) nella piastra di coltura cellulare 12 pozzetti. Nota: La concentrazione di farmaco finale (ad esempio, 10 nM, 100 nM, 1 mM e 10 mM) e ttempo RATTAMENTO (ad esempio, 4 ore) sono varie a seconda dello scopo specifico degli studi. Le cellule sono attaccati alle diapositive micro copertura e pronto per gli esperimenti CSMS (passo 6). </li></ol></li></ol> 3. Single-sonda Fabrication <ol><li> Posizionare il dual-bore tubo di quarzo (diametro interno (ID) 127 micron, diametro esterno (OD) a 500 micron) in una micropipetta estrattore laser e tirare un ago al quarzo dual-bore. Utilizzare i seguenti parametri come punti di partenza: Calore = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del = 150, e Pul = 250 (tutte le unità sono unità del produttore). Assicurarsi che l&#39;ago doppio foro di quarzo tirato ha una punta rastremata per le proprietà ottimali sonda. Tagliare la punta tirata in modo che ci sia di ~ 5 mm lungo di unpulled dual-bore capillare quarzo sinistra all&#39;altra estremità. Nota: I parametri attuali del tenditore laser devono essere ottimizzati in funzione delle condizioni specifiche dello strumento. </li><li> Tagliare una sezione ~ 80 mm capillare di silice fusa (ID 40 micron, OD. 105 micron) come solvente fornire capillare, e inserirla in un foro all&#39;estremità piatto dell&#39;ago quarzo dual-bore. </li><li> Tagliare una sezione ~ 40 mm capillare di silice fusa (ID 40 micron, OD 105 micron) e usare un rasoio per radere ~ 5 mm dal rivestimento in poliimmide dal punto centrale. Utilizzare una fiamma di propano per riscaldare e tirare la capillare fusi in un emettitore nano-elettrospray ionizzazione (ESI) con un bel cono in fretta. Tagliare un emettitore nano-ESI (~ lungo 7-10 mm), e inserirlo nel l&#39;altro foro alla fine piatto dell&#39;ago al quarzo dual-bore. In alternativa, utilizzare l&#39;estrattore laser per produrre un bel cono. </li><li> Applicare una quantità minima di (~ 1-2 microlitri) UV resina indurimento sull&#39;estremità piatto dell&#39;ago quarzo dual-bore e solidificare la resina utilizzando una lampada UV a LED per ~ 20 sec per fissare il solvente fornendo capillare e nano ESI emettitore. Le procedure per assemblare le singole parti in un unico sonda sono mostrati in figura 1a. </li><li> Tagliare un gl microscopio di seriescivolo ass (1 &quot;x 3&quot;) nella metà per il lungo. Posizionare la singola sonda sul un&#39;estremità del vetrino in modo che l&#39;emettitore nano-ESI è puntato verso l&#39;esterno. Applicare la resina epossidica regolare al corpo della singola sonda in modo che diventi fissato sul vetrino (Figura 1b). Lasciar riposare per l&#39;indurimento. Coppia il fabbricato single-sonda con la messa a punto integrato single-sonda (Figura 1c), che è attaccato ad uno spettrometro di massa, come illustrato nella figura 1d. </li></ol> 4. Costruire il programma di installazione di MS integrato Single-sonda <ol><li> Modificare la flangia interfaccia sorgente ionica dello spettrometro di massa e fabbricare il supporto (con posizione regolabile e altezza) dello stereoscopio digitale (figure 1e e 1f). <ol><li> Praticare una flangia di interfaccia sorgente ionica con due fori che consentono il collegamento di una scheda ottica in alluminio. Fare un dispositivo di guida di scorrimento e un asta di regolazione in altezza (allegato aluno stadio XY per controllo fine della posizione), tale che il sistema stereoscopio digitale può essere collegato alla scheda ottica di alluminio (Figura 1e). </li></ol></li><li> Attaccare il microscopio modificato stereo digitale, un microscopio digitale USB, un XYZ fase traslazione manuale miniatura con un supporto morsetto flessibile, il motorizzata sistema fase di traduzione XYZ alla scheda ottica di alluminio, che è montato sull&#39;interfaccia flangia sorgente ionica misura dello spettrometro di massa (figure 1c e 1f). Utilizzare il supporto morsetto flessibile per riparare il vetrino fissato con un single-sonda. </li><li> Fissare la configurazione single-sonda al spettrometro di massa (Figura 1F). Regolare il supporto morsetto flessibile e la fase XYZ miniatura per posizionare l&#39;emettitore del singolo sonda di fronte alla entrata dello spettrometro di massa. Utilizzare il microscopio digitale USB (con angolo di vista registrabile) sul lato della singola sonda per fornire un&#39;immagine zoomata del singolo-ppunta accappatoio o l&#39;emettitore nano-ESI, e lo stereoscopio digitale (regolabile in altezza) al di sopra del singolo-sonda per visualizzare le cellule e la punta della sonda. Nota: Utilizzando la flangia sorgente ionica corrispondente, questo sistema a singolo sonda integrata può essere accoppiato ad altri tipi di spettrometri di massa con sorgente di ionizzazione ambiente. </li></ol> 5. ambiente MSI <ol><li> Scongelare la sezione campione a temperatura ambiente e posizionarlo sulla motorizzata sistema fase di traduzione XYZ sotto il singolo-sonda. Regolare la posizione del campione cambiando le coordinate nel software di controllo. </li><li> Usando la siringa per pompare il solvente di campionamento ad un tasso adeguato (ad esempio, 0,2 ml / min), e applicare la tensione di ionizzazione (ad esempio, 5 kV). La scelta del solvente campionamento è flessibile, e quelli comuni includono MeOH: acqua (9: 1) e acetonitrile. Il volume morto del emettitore nano-ESI è stata stimata essere ~ 3 nl, e il tempo tra la sonda-surfacontatto ce e l&#39;osservazione del segnale di ioni è di solito meno di 1 sec 15. Nota: La flangia di interfaccia sorgente ionica personalizzata permette la tensione di ionizzazione da consegnare dal spettrometro di massa ad una unione conduttivo attraverso un coccodrillo. La tensione di ionizzazione viene poi trasmesso attraverso una unione conduttivo al solvente all&#39;interno del capillare e canali singola sonda, e applicata sulla emettitore nano-ESI per ionizzare gli analiti nel campione. Assicurarsi che la tensione di ionizzazione viene spento quando si collega la clip coccodrillo con l&#39;unione conduttivo. </li><li> Regolare l&#39;altezza della singola sonda in modo che sia appoggiata appena sopra la superficie del campione e in grado di eseguire superficie estrazione di metaboliti. Sollevare attentamente la Z-fase, e quindi utilizzare il microscopio digitale USB (sul lato della singola sonda) per monitorare la variazione della distanza tra la punta singola sonda e superficie del tessuto. Monitorare i cambiamenti nello spettro di massa durante questa regolazione in altezza, e smettere di ascensoreing Z-fase in cui si osserva una variazione del segnale di ioni da sfondo solvente metaboliti tissutali. </li><li> Ripetere il punto 5.3 a tre volte per impostare tre diversi punti all&#39;interno del programma di controllo fase per la regolazione spianatura superficiale automatizzato. Posizionare la punta della singola sonda a tre punti sulla superficie del campione ad una distanza di circa 10 mm l&#39;uno dall&#39;altro. Eseguire la regolazione in altezza premendo su e giù le icone, e bloccare i tre punti in posizione sotto il &quot;metodo Piano&quot;. </li><li> Impostare altri parametri per raster attraverso la sezione di interesse all&#39;interno del campione utilizzando questo programma. Per le sezioni di rene di topo qui presentati, utilizzare un / sec di velocità rastering 10,0 micron e 20 micron distanza tra le linee. Il sistema palco motorizzato ha un movimento di 0,1 micron minimo incremento. La distanza tra la punta singola sonda e tessuti è ottenuta dal passaggio 5.3. </li><li> Impostazione di un metodo per l&#39;acquisizione automatica di MS dalla spettrometro di massa. foR risoluzione di massa ad alta MSI su un campione di rene di topo, utilizzare i seguenti parametri: risoluzione di massa 60.000 (m / Δm), ~ modalità positiva 5 kV, 1 Microscan, tempo di iniezione di 150 msec max, e AGC su. Tutti gli spettri MS acquisiti rappresentano singole linee dell&#39;immagine MS avevano lo stesso numero di scansioni con spaziatura temporale uniforme fra ciascuna scansione, indicando che le dimensioni dei pixel per le immagini prodotte sono stati distribuiti uniformemente. </li><li> Avviare l&#39;acquisizione dei dati MSI. Avviare la sequenza di acquisizione MS per lo spettrometro di massa, e quindi avviare la sequenza di rasterizzazione per il programma di controllo XYZ. <ol><li> Ad esempio, nel programma di acquisizione dati MS utilizzati qui, andare a &quot;setup Sequence&quot;, selezionare &quot;Nuovo sequenza&quot;, generare un insieme di file per una nuova sequenza numerata da 01 a X, dove X è il numero di linee utilizzate per la immagine MS desiderato da prendere, e quindi premere &quot;sequenza di esecuzione&quot;. </li><li> Utilizzare un dispositivo elettronico in casa per consentire al software di produrre una contasegnale di chiusura ct per lo spettrometro di massa per raccogliere i dati. Lo schema elettrico è mostrato nella figura supplementare (Figura S1) come riferimento. </li></ol></li><li> Costruire immagini MS da file RAW MS utilizzando appropriati software di visualizzazione MSI. Ad esempio, quando si utilizza il pacchetto software sviluppato dal gruppo di Laskin a PNNL 17, effettuare le seguenti operazioni. <ol><li> Fai clic su &quot;File sopracciglia.&quot; Selezionare il primo file ottenuto dall&#39;esperimento MSI. Specificare la posizione del file inizia e finisce in &quot;Numero di linee&quot;. Selezionare un intervallo di valori m / z per la gamma immagine MS sotto &quot;Enter MZ Range&quot;. </li><li> Premere il pulsante &quot;Start&quot; per avviare il processo di creazione dell&#39;immagine. Una volta che l&#39;immagine di MS è fatto, fai clic su &quot;Salva immagine&quot; sotto &quot;Barra degli strumenti&quot; per memorizzare le immagini nel computer. </li></ol></li></ol> 6. In-situ dal vivo SCMS <ol><li> Imposta il sistema single-sonda per istruireioni per MSI. Regolare il solvente (ad esempio, MeOH / H 2 O o acetonitrile) Portata (ad esempio, ~ 25 nl / min). </li><li> Lavare le cellule in coltura, che sono attaccati sugli scivoli micro vetro di copertura, con PBS per rimuovere il supporto culturale e componenti di droga extracellulari. Mettere cella contenente vetrino sul motorizzata sistema fase di traduzione XYZ per l&#39;esperimento. Nota: In alternativa, utilizzare il mezzo di coltura cellulare fresca (senza contenente siero fetale bovino) per lavare le cellule in coltura. Meno soppressione ionica è stata osservata. Inoltre, la cella può sopravvivere per più tempo durante l&#39;esperimento in cui la temperatura ambiente (~ 20 ° C) è significativamente inferiore alla temperatura cultura (37 ° C). Il tipo di farmaco, concentrazione della soluzione, e tempo di trattamento variano in diversi studi. </li><li> Primo microscopio stereo digitale (sopra il campione) sulla punta della singola sonda per verificare la penetrazione cellulare durante l&#39;analisi. Utilizzare il microscopio digitale USB (sul side del singolo-sonda) per monitorare le condizioni di lavoro del emettitore nano-ESI sul singolo-sonda. </li><li> Utilizzare il programma di controllo fase XYZ motorizzato e microscopio stereo digitale (sopra celle) per individuare una cella di interesse, e di posizionare con precisione la punta singola sonda al di sopra del campione. Inizia acquisizione dati MS prima della punta singola sonda viene inserita nella cella. <ol><li> Utilizzare i seguenti parametri come riferimento per l&#39;analisi MS con uno spettrometro di massa ad alta risoluzione: risoluzione di massa 100.000 (m / Δm), ~ modalità 3 kV positivo e negativo, 1 Microscan, 150 msec tempo di iniezione massima, la modalità AGC. acquisizione automatica di MS viene fatto clic su &quot;Start&quot; nel programma di acquisizione dati MS. </li><li> Sollevare il motorizzata Z-stage facendo clic sull&#39;icona di penetrare la membrana cellulare e mantenere la registrazione del segnale MS generato dalla cella. Un ritardo di 1-2 secondi è generalmente osservata tra l&#39;inserimento sonda e il rilevamento del segnale MS. Come l&#39;altra confermapenetrazione cellulare, un drastico cambiamento dei segnali MS può essere osservato dopo la penetrazione della membrana cellulare. I segnali MS di composti intracellulari di solito possono durare per ~ 15-20 secondi prima di una significativa diminuzione. </li><li> Più in basso la cella contenente piastra per tirare la punta singola sonda dalla cellula. Richiede solitamente &lt;15 sec per i segnali di ioni dei composti cellulari per avvicinarsi al livello di rumore. Lasciate che il flusso di solvente per ~ 3 min per svuotare completamente il singolo-sonda. Nel frattempo, posizionare il sistema fase XYZ motorizzato per individuare la cella successiva da analizzare. Ogni esperimento cella richiede ~ 3 min per essere realizzato. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Vickerman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+and+depth+profiling+by+mass+spectrometry-SIMS%2C+MALDI+or+DESI%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging and depth profiling by mass spectrometry-SIMS, MALDI or DESI?</a> Analyst. 136 (11), 2199-2217 (2011).</li>
<li>Schwamborn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+in+biomarker+discovery+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry in biomarker discovery and validation.</a> J. Proteomics. 75 (16), 4990-4998 (2012).</li>
<li>Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+-+Painting+Molecular+Pictures%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">MALDI Imaging Mass Spectrometry - Painting Molecular Pictures.</a> Mol Oncol. 4 (6), 529-538 (2010).</li>
<li>Kraft, M. L., Klitzing, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipids+with+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1841 (8), 1108-1119 (2014).</li>
<li>Wiseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry%3A+Imaging+drugs+and+metabolites+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18120-18125 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+small+metabolites+and+lipids+in+rat+brain+tissues+at+atmospheric+pressure+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of small metabolites and lipids in rat brain tissues at atmospheric pressure by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 82 (3), 982-988 (2010).</li>
<li>Laskin, J., Heath, B. S., Roach, P. J., Cazares, L., Semmes, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Imaging+Using+Nanospray+Desorption+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tissue Imaging Using Nanospray Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 84 (1), 141-148 (2012).</li>
<li>Wu, C., Dill, A. L., Eberlin, L. S., Cooks, R. G., Ifa, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+under+ambient+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass.+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging under ambient conditions.</a> Mass. Spectrom. Rev. 32 (3), 218-243 (2013).</li>
<li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity%3A+do+differences+make+a+difference%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity: do differences make a difference?</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li>
<li>Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+MALDI-MS+as+an+Analytical+Tool+for+Studying+Intrapopulation+Metabolic+Heterogeneity+of+Unicellular+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-Cell MALDI-MS as an Analytical Tool for Studying Intrapopulation Metabolic Heterogeneity of Unicellular Organisms.</a> Anal. Chem. 82 (17), 7394-7400 (2010).</li>
<li>Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lipidomics%3A+characterizing+and+imaging+lipids+on+the+surface+of+individual+Aplysia+californica+neurons+with+cluster+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell lipidomics: characterizing and imaging lipids on the surface of individual Aplysia californica neurons with cluster secondary ion mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 85 (4), 2231-2238 (2013).</li>
<li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+metabolite+and+lipid+analysis+of+Xenopus+laevis+eggs+by+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subcellular metabolite and lipid analysis of Xenopus laevis eggs by LAESI mass spectrometry.</a> PLoS One. 9 (12), e115173(2014).</li>
<li>Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+single-cell+video-mass+spectrometry+for+cellular+and+subcellular+molecular+detection+and+cell+classification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+metabolic+analysis+of+single+plant+cells+by+capillary+microsampling+and+electrospray+ionization+mass+spectrometry+with+ion+mobility+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation.</a> Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).</li>
<li>Rao, W., Pan, N., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Tissue+Imaging+Using+the+Single-probe+Mass+Spectrometry+under+Ambient+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 26 (6), 986-993 (2015).</li>
<li>Pan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-probe%3A+a+miniaturized+multifunctional+device+for+single+cell+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis.</a> Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).</li>
<li>Thomas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+High+Resolution+Spatial+Mass+Spectrometric+Data+during+Acquisition%5BTitle%5D)+AND+%222012+Annual+International+Conference+of+the+Ieee+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society+%28Embc%29%22%5BJournal%5D)">Visualization of High Resolution Spatial Mass Spectrometric Data during Acquisition.</a> 2012 Annual International Conference of the Ieee Engineering in Medicine and Biology Society (Embc). , 5545-5548 (2012).</li>
<li>Luxembourg, S. L., Mize, T. H., McDonnell, L. A., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-spatial+resolution+mass+spectrometric+imaging+of+peptide+and+protein+distributions+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-spatial resolution mass spectrometric imaging of peptide and protein distributions on a surface.</a> Anal. Chem. 76 (18), 5339-5344 (2004).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSW-1%3A+a+natural+compound+with+potent+anticancer+activity+and+a+novel+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">OSW-1: a natural compound with potent anticancer activity and a novel mechanism of action.</a> J Natl Cancer Inst. 97 (23), 1781-1785 (2005).</li>
<li>Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Ambient+MS+Imaging+of+Negative+Ions+in+Positive+Ion+Mode%3A+Using+Dicationic+Reagents+with+the+Single-Probe%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 27 (1), 124-134 (2016).</li>
<li>Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+ion+MS+imaging+to+relatively+quantify+cholesterol+in+the+membranes+of+individual+cells+from+differentially+treated+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secondary ion MS imaging to relatively quantify cholesterol in the membranes of individual cells from differentially treated populations.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3554-3560 (2007).</li>
</ol>

Non abbiamo alcun conflitto di interessi da dichiarare con il lavoro qui presentato.

Il singolo-sonda è un dispositivo multifunzione che può essere utilizzato per entrambi gli esperimenti MSI e SCMS. La configurazione single-sonda (compresi i sistemi di fase di traduzione, microscopi, flangia interfaccia di origine ionica, ecc) è concepito come un componente aggiuntivo che può essere adattato flessibilmente per lo spettrometro di massa esistente. Un rapido scambio tra la configurazione single-sonda e la fonte di ioni ESI convenzionale può essere eseguita entro un minuto. In linea di principio, con la flangia interfaccia sorgente ionica caso, la configurazione singola sonda può essere adattata alle eventuali altri spettrometri di massa. Inoltre, il solvente campionamento contiene una varietà di reagenti può essere utilizzato con la configurazione single-sonda per esperimenti MSI e SCMS reattivi, che migliora notevolmente il rilevamento di intervalli più ampi di biomolecole. Oltre ai tessuti animali e linee cellulari, la singola sonda è anche in grado di analizzare altri sistemi biologici, come piante. Pertanto, con la stessa configurazione sperimentale eformazione degli utenti simili, diversi studi può essere eseguita utilizzando un unico strumento e dagli utenti stessi, consentendo esperimenti efficiente e versatile da realizzare con il tempo minimo di formazione e di costo strumentazione. La componente chiave della tecnica MS single-sonda è la sonda stessa. La qualità del singolo-sonda ha una notevole influenza sulle sue prestazioni, che determina in larga misura la qualità di entrambi gli esperimenti MSI e SCMS. Quando fabbricazione di singole sonde, assicurarsi che i capillari all&#39;interno del tubo dual-bore sono incollati saldamente per eliminare il rischio di perdita di solvente durante gli esperimenti. È fondamentale utilizzare una quantità minima di UV epossidica induribile, tale che gli orifizi e capillari non siano ostruiti durante la fabbricazione della sonda. Il singolo-probe è stato usato per condurre elevata spaziale e massa risoluzione ambiente MSI su campioni biologici 15. Il principale vantaggio di ambiente MSI soprametodi non-ambiente è che la preparazione del campione è mantenuto al minimo, senza necessità di un ambiente di campionamento sotto vuoto, che consente il campione da analizzare in uno stato quasi nativa 8. Uno dei principali ostacoli per la maggior parte degli altri ambienti tecnica MSI è stata una mancanza di risoluzione spaziale 1. Rispetto al desorbimento basato MSI tecniche (come DESI e LAESI), le piccole dimensioni punta della singola sonda permette una più robusta ed efficiente superficie liquido micro-estrazione da eseguire su una piccola area, portando ad una risoluzione spaziale di 8.5 micron, che è tra i più alti quelli ottenuti utilizzando le tecniche ambientali MSI 15. Inoltre, regolando i componenti del solvente campionamento fornisce flessibilità per condurre gli esperimenti. Ad esempio, il campionamento solventi contenenti reagenti (ad esempio, composti dicationic) sono stati utilizzati per effettuare esperimenti MSI reattive, consentendo un aumento significativo nel numero di metaboliti identificati peR esperimento 20. L&#39;altro vantaggio della singola sonda è la progettazione integrata, che fornisce la facilità di funzionamento durante l&#39;intero processo di acquisizione dei dati. Poiché la distanza tra la punta e la superficie del tessuto è molto sensibile per l&#39;intensità del segnale di ioni e stabilità, ottenendo una sezione di tessuto superficie piana e conducendo appiattimento regolazione per minimizzare la varianza distanza è una chiave per esperimenti MSI alta qualità. Ne consegue che i singoli sonda tecniche MSI non sono adatte per ottenere alte immagini spaziali MS su superfici irregolari. Oltre a fabbricare una sonda di alta qualità, accuratamente accordate lo strumento è essenziale per un esperimento MSI successo. Tra tutti i passi di sintonia, regolando l&#39;altezza della punta singola sonda sopra la superficie della sezione di tessuto è il più critico. Quando si regola l&#39;altezza della sonda, pompare il solvente di campionamento e accendere la tensione di ionizzazione, in modo che solo il solvente sfondo segnali di ioni possono essere osservatied. Poi monitorare la variazione dello spettro di massa, riducendo accuratamente la distanza sonda-superficie sollevando il motorizzata Z-fase fino possono essere osservate forti e stabili segnali ioni da sezione di tessuto; questa altezza della sonda verrà utilizzato per la raccolta dati MSI durante l&#39;esperimento. Inoltre, un tasso di flusso di solvente ottimizzato è essenziale per esperimenti MSI. Regolare la portata con l&#39;altezza della sonda ottimizzato. Assicurarsi che non vi è alcuna diffusione solvente sulla superficie del tessuto (ad esempio, la portata è troppo alto) o la formazione di bolle all&#39;interno del emettitore nano-ESI (vale a dire, portata è troppo bassa). Il singolo-sonda è un dispositivo multifunzionale per analisi biologiche. Oltre agli esperimenti MSI, è in grado di condurre quasi in tempo reale in-situ SCMS per chiarire informazioni chimiche dettagliate da cellule eucariotiche vivi 16, che è un importante vantaggio rispetto ad altre vuoto tecniche SCMS base (come MALDI 10 e SIMS 21 </sup&gt;). La piccola dimensione della punta della sonda fornisce la possibilità di essere inserito in una cellula eucariotica vivo e per estrarre e ionizza composti intracellulari per un&#39;analisi immediata MS. Analogamente, i solventi campionamento contenenti reagenti (ad esempio, composti dicationic) possono essere utilizzati in esperimenti SCMS, ed una più ampia gamma di costituenti cellulari possono essere rilevati in una cella singola vivo che mai (ricerca in corso, i dati non sono visualizzati). Sebbene l&#39;analisi in tempo reale fornirà i profili chimici delle singole cellule vive, a causa della penetrazione cellulare di membrana ed estrazione dei contenuti cellulari, la cella in esame saranno uccisi dopo l&#39;esperimento, implicando che la tecnica SCMS singola sonda è ancora un metodo distruttivo. Inoltre, la punta della sonda e nano-ESI emettitore nella singola sonda può essere facilmente ostruiti per gli utenti inesperti. Per ridurre il rischio di intasamento dispositivo, assicurarsi di evitare di toccare il nucleo quando si inserisce la punta singola sonda in un cell. In caso di intasamento, il dispositivo può essere rigenerato riscaldando la punta della sonda ostruiti o nano-ESI emettitore utilizzando un autocostruito bobina di riscaldamento 16. Un&#39;altra limitazione della tecnica SCMS singola sonda è che solo le cellule adesive (cioè, le cellule sono attaccate alle superfici) possono essere analizzati utilizzando la configurazione corrente. Tuttavia, incorporando il sistema di manipolazione delle cellule nell&#39;apparecchiatura MS singola sonda, ampi tipi di cellule possono essere studiati in futuro. Simile al esperimento MSI, l&#39;ottenimento di una sonda di alta qualità e una portata di solvente ottimizzato è fondamentale per gli studi SCMS. Con l&#39;adattamento del tasso di flusso di solvente, la punta singola sonda è posto sopra il campione (cioè, nessun contatto con il mezzo cella o coltura), e verificare che non vi sia gocciolamento solvente dalla punta della sonda o la formazione di bolle all&#39;interno del nano-ESI emettitore.

L'imaging per spettrometria di massa (MSI) è una tecnica di imaging molecolare relativamente nuova per fornire la distribuzione spaziale dei composti di interesse sulle superfici. Durante l'analisi MSI, le misurazioni della spettrometria di massa (MS) vengono registrate su tutta la superficie su base di singoli pixel per creare un'immagine 2D della specie di interesse 1. Le tecniche MSI hanno la capacità di fornire una distribuzione delle caratteristiche spazialmente risolta per un'ampia gamma di metaboliti, consentendo di ottenere una quantità molto maggiore di informazioni da un campione rispetto all'utilizzo di tecniche di imaging molecolare tradizionali, e hanno il potenziale per migliorare notevolmente l'analisi di campioni biologici per studi biologici e farmacologici 2. L'MSI può essere ampiamente suddiviso in approcci non ambientali e ambientali. Le tecniche di analisi MSI non ambientali, come la ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice (MALDI) MS 3 e lo ione secondario a tempo di volo MS (ToF SIMS) 4, sono in grado di offrire un'elevata risoluzione spaziale (circa 5 μm e 100 nm, rispettivamente) e un'elevata sensibilità. Tuttavia, questi metodi richiedono un'ampia preparazione del campione, come l'applicazione di molecole di matrice sulla superficie del campione, e un ambiente di campionamento sotto vuoto, che potrebbe introdurre artefatti ai dati ottenuti. Le tecniche ambientali come la ionizzazione elettrospray a desorbimento (DESI) MS 5, la ionizzazione elettrospray ad ablazione laser (LAESI) MS 6 e la nano-DESI MS 7 sono in grado di eseguire l'MSI di campioni con poca o nessuna preparazione preliminare nell'ambiente ambientale, che è in grado di produrre immagini MS che potenzialmente riflettono il campione nel suo stato più nativo. Tuttavia, la maggior parte di queste tecniche generalmente manca dell'elevata risoluzione spaziale e sensibilità di rilevamento rispetto alle tecniche non ambientali, con esperimenti tipicamente condotti a circa 150 μm per pixel 8.
L'analisi a singola cellula (SCA) è un campo in crescita che ha la capacità di caratterizzare la composizione chimica di campioni biologici a livello cellulare. La SCA consente l'analisi dei sistemi biologici a un livello più fondamentale rispetto alle tradizionali tecniche di analisi cellulare, che producono un risultato medio di una popolazione di cellule, fornendo potenzialmente informazioni precedentemente intrattabili 9. Le tecniche MS sono state recentemente applicate alla SCA (chiamata spettrometria di massa a singola cellula o SCMS) utilizzando tecniche non ambientali come MALDI MS 10 e ToF SIMS 11 in cui le cellule vengono pretrattate prima dell'analisi, e con tecniche ambientali come LAESI MS 12 e metodi di estrazione diretta, come il video live a singola cellula-MS 13, 14, per analizzare un'ampia varietà di tipi di cellule come uova, piante e cancro. Le tecniche ambientali hanno il vantaggio di essere applicate alle cellule vive, il che riduce al minimo gli artefatti, portando a una migliore rappresentazione dei metaboliti nelle cellule vive. I metodi basati sull'estrazione diretta descritti sopra, tuttavia, eseguono il processo di estrazione e analisi del campione in due fasi diverse, il che si traduce in un intervallo di tempo durante l'analisi che potrebbe potenzialmente alterare i metaboliti presenti all'interno del campione. 
La sonda singola, un dispositivo multifunzionale miniaturizzato in grado di condurre MSI ambientale ad alta risoluzione spaziale su sezioni di tessuto biologico 15 e SCMS in situ quasi in tempo reale su singole cellule vive 16. La sonda singola è dotata di una struttura integrata costituita da un capillare di quarzo a doppio foro accoppiato con un ingresso che fornisce solvente e un emettitore nano-ESI costituito da capillari di silice fusa, che consente di eseguire l'erogazione del solvente e l'estrazione dell'analita da un unico dispositivo. Nella modalità MSI ambientale, la singola sonda viene posizionata sopra il tessuto campione e avviene la microestrazione superficiale, consentendo di creare un'immagine MS rasterizzata ad alta risoluzione spaziale. In particolare, la punta affusolata della singola sonda è abbastanza piccola da poter essere inserita in cellule eucariotiche vive per l'analisi SCMS in situ, in cui il rilevamento dei metaboliti richiede meno di due secondi tra l'inserimento della sonda e il rilevamento della MS, consentendo di acquisire informazioni chimiche quasi in tempo reale. Di seguito sono riportati i protocolli per fabbricare il dispositivo a sonda singola e per condurre entrambe le modalità MSI e SCMS ambientali utilizzando le tecniche MS a sonda singola.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Fabbricazione a sonda singola</td></tr><tr><td>Tubo al quarzo a doppio foro, 1.120' &rsquo; &volte; 0,005 pollici &volte; 12 pollici</td><td>Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ&nbsp;</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore laser per micropipette&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato, CA&nbsp;</td><td>Modello P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in silice fusa, ID: 40&nbsp; &micro; m, OD: 110&nbsp; &micro; m</td><td>Molex, Lisle, IL</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>resina UV</td><td>Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA</td><td>Articolo n. 006.030</td><td></td></tr><tr><td>Lampada UV LED</td><td>Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, Cina</td><td>LY-C240</td><td></td></tr><tr><td>Resina epossidica</td><td>Devcon, Danvers, MA&nbsp;</td><td>Codice 20945</td><td></td></tr><tr><td>Microfiltro in linea&nbsp;</td><td>IDEX Salute & Scienza LLC, Lake Forest, IL</td><td>M-520</td><td></td></tr><tr><td>Microunion&nbsp;</td><td>IDEX Salute & Science LLC, Lake Forest, IL</td><td>M-539</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio (vetro)</td><td>C & A Scientific - Premiere, Manassas, VA&nbsp;</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Siringa&nbsp;</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>1725LTN 250UL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Spettrometro di massa</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Spettrometro di massa</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td>LTQ Orbitrap XL</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 2.1 Software</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td></td><td></td>XCALIBUR21</tr><tr><td>Fance Stage Control</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSI QuickView</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Contact closure device</td></tr><tr><td>USB-6009 DAQ multifunzione</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>779026-01</td><td></td></tr><tr><td>DR-5V SDS Relè</td><td>Panasonic, Kadoma, Giappone&nbsp;</td><td>DR-SDS-5</td><td></td></tr><tr><td>Porte logiche 50 Ohm Line Driver</td><td>Texas Instruments, Dallas, TX&nbsp;</td><td>SN74128N</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Configurazione a sonda singola</td></tr><tr><td>Stadio lineare motorizzato e controller (3 set)</td><td>Newport, Irvine, CA</td> Stadio XYZ in miniatura <td>Conex-MFACC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>MT-XYZ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stadio XY di traslazione</td><td>ThorLab, Newton, NJ</td><td>PT1 e PT102</td><td></td></tr><tr><td>Thermo LTQ XL flangia di interfaccia della sorgente ionica</td><td>Nuovo obiettivo, Woburn, MA&nbsp;</td><td>PV5500</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio digitale, 250X - 2.000X</td><td>Shenzhen D& F Co., Shenzhen, Cina</td> Microscopio per fotografia digitale <td>USB Supereyes T004</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DX.com, Hong Kong, Cina</td><td>S02 25~500X&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Chemyx Inc., Stafford, TX&nbsp;</td><td>Breadboard ottica in alluminio solido Nexus 3000</td><td></td></tr><tr><td>, 8" x 8" x 1/2"</td> <td>Thorlabs, Newton, NJ</td><td>MB810</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per morsetto flessibile</td><td>Siskiyou, Grants Pass, OR&nbsp; &nbsp;</td><td>MXB-3h</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solvents</td></tr><tr><td>Methol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34860 Acqua Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34967 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato termicamente al 10% (FBS)</td><td>Gibco/Life Technologies, Long Island, NY</td><td>10100-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES (pH 7,4)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&nbsp;</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 12 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning Inc., Corning, NY&nbsp;</td><td>Fiaschetta Falcon 351143</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>Corning Inc., Corning, NY&nbsp;</td><td>Falcon 3055</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Occhiali, rotondi, n. 1</td><td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsolfossido)</td><td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Imaging tissutale</td></tr><tr><td>Cyro-Cut Microtome</td><td>American Optical Coporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek, Temperatura di taglio ottimale (OCT)&nbsp;</td><td>Sakura Finetek Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio (policarbonato)</td><td>Soluzioni di approvvigionamento scientifico, Elk Grove Village, IL</td><td>P11011P</td><td></td></tr></tbody></table>

applicazioni del singolo-probe: mass spectrometry imaging e analisi singola cella in condizioni ambientali

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

L'imaging con spettrometria di massa (MSI) e l'analisi in situ con spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) in condizioni ambientali sono due campi emergenti con un grande potenziale per l'analisi dettagliata della spettrometria di massa (MS) di biomolecole da campioni biologici. La sonda singola, un dispositivo miniaturizzato con capacità di campionamento e ionizzazione integrate, è in grado di eseguire sia analisi MSI ambientali che SCMS in situ. Per l'MSI ambientale, la sonda singola utilizza la microestrazione superficiale per condurre continuamente l'analisi MS del campione e questa tecnica consente la creazione di immagini MS con un'alta risoluzione spaziale (8,5 μm) da campioni biologici come sezioni di cervello e rene di topo. L'MSI ambientale ha il vantaggio che è necessaria poca o nessuna preparazione del campione prima dell'analisi, il che riduce la quantità di potenziali artefatti presenti nell'acquisizione dei dati e consente di acquisire un'analisi più rappresentativa del campione. Per l'SCMS in situ, la punta a sonda singola può essere inserita direttamente in cellule eucariotiche vive come le cellule HeLa, a causa delle piccole dimensioni della punta di campionamento (< 10 μm) e questa tecnica è in grado di rilevare un'ampia gamma di metaboliti all'interno di singole cellule quasi in tempo reale. L'SCMS consente di acquisire una maggiore sensibilità e accuratezza delle informazioni chimiche a livello di singola cellula, il che potrebbe migliorare la nostra comprensione dei processi biologici a un livello più fondamentale di quanto fosse possibile in precedenza. Il dispositivo a sonda singola può essere potenzialmente accoppiato con una varietà di spettrometri di massa per un'ampia gamma di studi MSI e SCMS.

Il singolo-sonda è stata utilizzata con successo per l&#39;ambiente analisi MSI di topo sezionato tessuto renale 15. Il dispositivo utilizza il meccanismo di liquido superficie micro-estrazione (Figura 1a), che fornisce altamente efficiente estrazione analita da una piccola area, portando ad abbondanti segnali ioni intensità nei risultati MSI. Ad esempio, le intensità di oltre 10 7 segnale siano stati raggiunti per alcuni metaboliti abbondanti (Figura 2a). Un gran numero di metaboliti sono stati rilevati in questo modo, compreso un certo numero di sfingomielina (SM) e fosfatidilcolina (PC) specie come [SM (34: 1) + Na] + (725,5575 m / z), [PC (32: 0) + H] + (734,5700 m / z), [PC (34: 1) + Na] + (782,5696 m / z), e [PC (38: 5 + Na)] + (814,5726 m / z). Questi composti sono stati identificati con alta risoluzione di massa e accuratezza di massa quando accoppiato tspettrometro di massa ad alta risoluzione OA. Per esempio, l&#39;identificazione è stato ottenuto con meno di 4 ppm m / z accuratezza di massa (cioè, la differenza tra i valori osservati e teorici) per ciascun metabolita (Figura 2b) nei risultati qui presentati. Inoltre, tandem MS analisi (ad esempio, MS / MS) sono stati anche condotti per l&#39;identificazione più sicuri di specie di interesse. 15 Grazie alla capacità di eseguire efficiente liquido micro-estrazione in una piccola area, il dispositivo singola sonda può essere utilizzato per eseguire esperimenti elevati risoluzione MSI spaziali in condizioni ambientali 15. Ad esempio, immagini dettagliate MS di sezioni di rene di topo sono stati ottenuti illustrante la distribuzione spaziale dei metaboliti selezionati (figura 2c). La risoluzione spaziale dell&#39;immagine MS è stata determinata da 8,5 micron, seguendo la metrica diffuso di avere il transiti. il punto di un elemento tagliente determinata entro una variazione di intensità 20-80% del segnale MS 18 Nel caso di fosfolipide [PC (38: 5 + Na)] + sulla sezione renale mouse, la transizione tra funzionalità midollare interna e il midollo esterna avviene attraverso un ciclo di scansione nel cronogramma, con un cambiamento di intensità gamma maggiore di 20-80%. Sulla base della velocità di campionamento in movimento (10,0 micron / sec) e MS velocità di acquisizione dati (0,85 sec / spettro), il campione muove distanza in una MS di ciclo (8,5 micron), cioè, la risoluzione spaziale MSI, può essere calcolata (Figura 2d). Questa risoluzione spaziale è tra i più alti ancora raggiunto per le tecniche di MSI ambientali condotte su campioni biologici. Per SCMS singola sonda era in grado di realizzare l&#39;analisi delle singole cellule vive HeLa 16. La dimensione punta del singolo-sonda è in genere inferiore a 10 micron (Figure 3a), che è abbastanza piccolo da essere inserito direttamente in molti tipi di cellule eucariotiche, il cui diametro è ~ 10 micron, per l&#39;estrazione e l&#39;analisi MS. Il processo di inserimento della punta singola sonda in una cella può essere monitorato visivamente utilizzando un microscopio stereo digitale (Figura 3b), e la penetrazione della membrana cellulare può essere confermata mediante la rapida e significativo cambiamento di spettri di massa da PBS (o coltura cellulare fresca medio) ai composti intracellulari (figure 3C e 3D). Gli esperimenti possono essere condotti in entrambe le modalità di ioni positivi e negativi per rilevare ampi tipi di specie molecolari. Ad esempio, 18 specie diverse di lipidi sono stati identificati in modalità positiva, compresi sphingomyelins (SM) e fosfatidilcolina (PC), considerando fosfati dell&#39;adenosina (AMP, ADP e ATP) sono stati rilevati in modalità ioni negativi (figure 3c e d). Il ritardo di tempo tra l&#39;inserimento i single-sondanto una cella e il rilevamento del segnale era tipicamente meno di due secondi, consentendo un rilevamento quasi in tempo reale di metaboliti cellulari. SCMS è stato applicato anche per esperimenti in cui cellule sono state trattate con farmaci antitumorali (es OSW-1, paclitaxel e doxorubicina) 19]. I farmaci corrispondenti possono essere rilevati nelle cellule HeLa dopo il trattamento di 4 ore ad una serie di concentrazioni (cioè, 10 nM, 100 nM, 1 mM e 10 mM) in DMSO (dimetilsolfossido), utilizzando le cellule non trattate (solo aggiungere DMSO ) come i controlli. I segnali MS di farmaci non erano presenti nella extracellulare PBS o il controllo (figura 3e), ma sono stati individuati all&#39;interno delle singole celle utilizzando la tecnica MS singola sonda (solo 100 risultati di trattamento nM sono mostrati nella Figura 3f). Poiché le cellule sono state lavate con PBS (o terreno di coltura cellulare fresca) per rimuovere composti extracellulari e contaminazioni, la rilevazione di metaboliti endogeni (ad esempio, lipidi cellulari and fosfati dell&#39;adenosina) ei composti esogeni (ad esempio, farmaci antitumorali) indica che la tecnica MS singola sonda può essere utilizzato per analizzare composti intracellulari. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig1.jpg" /> Figura 1. Realizzazione e messa a punto del singolo-sonda per ambiente analisi MSI e SCMS. A) le procedure di fabbricazione del singolo-sonda. B) fotografia di un fabbricato singolo sonda collegata ad un vetrino. C) la fotografia del singolo installazione sonda collegata ad una massa spettrometro. d) Diagramma della configurazione single-probe accoppiato con uno spettrometro di massa. Durante un esperimento, il solvente campionamento viene continuamente fornita dalla siringa, la tensione di ionizzazione viene applicata al raccordo conduttivo dal spettrometro di massa, due microscopi digitali sono utilizzati per monitorare il posizionamento del campione, la fase XYZ motorizzatosistema è utilizzato per controllare il movimento del campione, e uno spettrometro di massa viene usato per l&#39;analisi. e) fotografia del sistema stereoscopio digitale personalizzato. f) fotografia che mostra stereoscopio digitale collegato all&#39;interfaccia flangia sorgente ionica attraverso una scheda ottica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig1large.jpg" target="_blank">Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig2.jpg" /> Figura 2. I risultati di uno studio MSI ambiente di una sezione di rene di topo con elevata risoluzione spaziale e la massa. A) Un spettro di massa rappresentante della singola sonda MSI. L&#39;intensità massima di metaboliti rilevati può raggiungere 3,39 x 10 7 (unità arbitrarie). B) Una selezione dei metaboliti rilevati presentati con la loro precisione di massa. C)Immagini MS di [PC (32: 0) + H] + e [PC (34: 1) + Na] + tratti da una sezione di rene di topo a 8.5 micron risoluzione spaziale. PC: fosfatidilcolina. Barra di scala: 2 mm; 0,20 millimetri (nel riquadro) d) Determinazione della risoluzione spaziale dell&#39;immagine MS per. [PC (38: 5) + Na] + (adattato con il permesso di riferimento 15). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig3.jpg" /> Figura 3. I risultati di una analisi ambientale SCMS dei trattati con farmaci cellule HeLa con una risoluzione elevata massa. A) zoom in fotografia della punta single-sonda che mostra una dimensione tipica di &lt;10 micron di diametro. B) Fotografia presa al punto di inserimento di una singola sonda in una cellula HeLa. barra della scala: 50 micron.c) Un tipico spettro positivo massa modalità ioni con le identificazioni di un numero di PC (fosfatidilcolina) specie. d) Un elenco rappresentativo dei metaboliti identificati dall&#39;analisi SCMS di cellule HeLa sia nelle modalità di ioni positivi e negativi. ef) Mass spettri per il controllo e trattati (100 nM OSW-1) cellule (adattato con il permesso di riferimento 16). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura S1. Schema elettrico del dispositivo elettronico utilizzato per produrre il segnale di chiusura contatto per spettrometro di massa per raccogliere i dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911figS1.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare o scaricare questa cifra.</a>

Qui, presentiamo i protocolli per eseguire sia l'imaging con spettrometria di massa ambientale (MSI) dei tessuti che l'analisi in situ di MS a singola cellula viva (SCMS) utilizzando la sonda singola, che è un dispositivo multifunzionale miniaturizzato per l'analisi MS.

Applicazioni del singolo-probe: Mass Spectrometry Imaging e analisi singola cella in condizioni ambientali

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

L'obiettivo generale di questo metodo è creare un dispositivo microscopico per il campionamento, chiamato Single-probe, per analizzare singole cellule vive mediante spettrometria di massa in condizioni ambientali. E per eseguire l'imaging mediante spettrometria di massa in condizioni ambientali di tessuti biologici con elevata risoluzione spaziale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali negli studi biologici e farmaceutici.Ad esempio, quali sono le molecole presenti in singole cellule vive e come sono distribuite nei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la sonda singola è un dispositivo multifunzionale che può essere utilizzato sia per l'analisi di singole cellule vive sia per esperimenti di imaging mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione in condizioni ambientali. Sebbene questo metodo possa analizzare singole cellule e tessuti, può essere applicato anche ad altri sistemi in cui è auspicabile un campionamento su scala microscopica, come l'analisi puntuale di sostanze chimiche e microcoloni e biofilm vivi.Insieme a me, dimostrerà la procedura Wei Rao, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Posizionare un intero organo di topo di interesse al centro di una piccola cavità di plastica. Immergere l'organo in un composto di inclusione tissutale fino a un'altezza di circa 10 mm.Posizionare immediatamente i tessuti in azoto liquido per la congelazione rapida. Per preparare la sezione di tessuto murino, prendere l'organo murino congelato e scongelarlo fino a 15 gradi Celsius in un criomicrotomo a temperatura controllata. Fissare il tessuto su una base di acciaio con circa 500 microlitri di composto per inclusione di tessuti, quindi posizionarlo su un supporto di sezionamento del criomicrotomo in modo che l'orientamento desiderato della sezione sia rivolto verso la lama.Tagliare il tessuto in sezioni di spessore pari a 12 micron. Successivamente, posizionare le fette di tessuto tagliate su vetrini microscopici in policarbonato e lasciarle asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. Ottenere un campione cellulare, ad esempio 1 millilitro di sospensione di cellule HeLa, e aggiungerlo a 9 mL di mezzo completo per colture cellulari in una piastra standard per colture cellulari da 10 cm.Mantenere le cellule in coltura a 37 gradi Celsius, con 5%CO2 per due o tre giorni, fino a quando la superficie di crescita &egrave; ricoperta al 70-80% nella piastra per colture cellulari. Eseguire il passaggio cellulare nella piastra per colture cellulari. A tale scopo, aspirare il mezzo di crescita e risciacquare le cellule con 5 mL di soluzione salina tamponata al fosfato 1x.Rimuovere il PBS utilizzando una punta sterile per aspirazione e incubare le cellule con 2,5 mL di tripsina per circa 5 minuti a 37 gradi Celsius per staccare le cellule dalla piastra di coltura. Arrestare l'attività della tripsina aggiungendo 7,5 mL di mezzo completo per coltura cellulare e quindi risospendere uniformemente le cellule. Per preparare i campioni cellulari per un esperimento di spettrometria di massa a singola cellula, o SCMS, posizionare innanzitutto singole lamelle microscopiche nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti.Quindi, aggiungere 1,8 mL di mezzo di coltura cellulare e 0,2 mL di sospensione cellulare nel pozzetto. Mescolare delicatamente le cellule con una lieve agitazione della piastra prima di incubare in un ambiente con 5% di CO2 a 37 gradi Celsius per circa 24 ore. Per effettuare il trattamento farmacologico delle cellule coltivate, aggiungere una soluzione del composto farmacologico nella piastra per coltura cellulare a 12 pozzetti.Posizionare il tubo di quarzo con doppio foro in un estrattore laser per micropipette e realizzare un ago di quarzo con doppio foro. Come valori iniziali, impostare il riscaldamento a 400, il filamento a tre, la velocità a 80, il ritardo a 150 e la trazione a 250. Tagliare la punta dell'estrazione in modo che rimangano circa 5 mm di capillare di quarzo con doppio foro non estratto all'altra estremità.Tagliare una sezione di 80 mm di capillare in silice fusa da utilizzare come capillare fornitore di solvente. Inserire quindi il capillare in uno dei fori all'estremità piana dell'ago di quarzo a doppio foro. Utilizzando una fiamma, tirare un capillare in silice fusa per formare un elettrospruzzo nanoESI, tagliarlo in un tratto lungo 7-10 mm e inserirlo nell'altro foro all'estremità piana dell'ago di quarzo a doppio foro.Applicare una minima quantità di resina fotopolimerizzabile UV sulla estremità piana dell'ago di quarzo con doppio foro. Solidificare la resina utilizzando una lampada UV a LED per circa 20 secondi, al fine di fissare il capillare erogatore di solvente e l'emettitore nanoESI. Successivamente, tagliare in due longitudinalmente un normale vetrino da microscopio.Quindi, posizionare la singola sonda su una estremit&agrave; del vetrino, in modo che l'emettitore nanoESI sia rivolto verso l'esterno. Applicare l'epossidico standard sul corpo della singola sonda, in modo che venga fissata saldamente al vetrino prima di lasciarla a riposo tutta la notte per l'indurimento. Questo sistema comprende una flangia personalizzata per l'interfaccia della sorgente ionica dello spettrometro di massa e una basetta ottica in alluminio dotata di microscopio digitale USB, una piattaforma manuale miniaturizzata per traslazioni XYZ e un sistema motorizzato per traslazioni XYZ.Modificare la flangia dell'interfaccia della sorgente ionica dello spettrometro di massa e realizzare il supporto del microscopio stereoscopico digitale come descritto nel protocollo testuale. Fissare al piano ottico in alluminio il microscopio stereoscopico digitale modificato, un microscopio digitale USB, un piccolo stage manuale di traslazione XYZ con un supporto a morsetto flessibile e il sistema motorizzato di traslazione XYZ. Utilizzare il supporto a morsetto flessibile per fissare il vetrino collegato a una singola sonda.Quindi, collegare la configurazione con la singola sonda allo spettrometro di massa. Regolare il supporto con morsetto flessibile e la minipiattoforma XYZ per posizionare l'emettitore della singola sonda davanti all'ingresso dello spettrometro di massa. Scongelare la sezione del campione a temperatura ambiente e posizionarla sul sistema della piattaforma di traslazione XYZ motorizzata situato al di sotto della singola sonda.Regolare la posizione del campione modificando le coordinate nel software di controllo. Utilizzare una siringa per pompare il solvente di campionamento a una velocità appropriata. Quindi, applicare la tensione di ionizzazione.Regolare l'altezza della singola sonda in modo che si trovi appena sopra la superficie del campione e sia in grado di eseguire l'estrazione dei metaboliti dalla superficie. Sollevare con attenzione lo stadio Z, quindi utilizzare il microscopio digitale USB per monitorare la variazione della distanza tra la punta della singola sonda e la superficie del tessuto. Impostare i parametri per la scansione rasterizzata della sezione di interesse all'interno del campione.Per le sezioni di rene di topo presentate qui, utilizzare una velocità di rasterizzazione di 10 micrometri al secondo e una distanza di 20 micrometri tra le linee. Impostare i parametri per la rasterizzazione attraverso la sezione di interesse all'interno del campione. Per le sezioni di rene di topo presentate qui, utilizzare una velocità di rasterizzazione di 10,0 micrometri al secondo e una distanza di 20 micrometri tra le linee.Impostare un metodo per l'acquisizione automatizzata di spettri MS dallo spettrometro di massa. Per l'MSI ad alta risoluzione di massa su un campione di rene di topo, utilizzare una risoluzione di massa di 60.000, una modalità positiva a 5 kV, 1 microscansione, un tempo massimo di iniezione di 150 millisecondi e il controllo automatico del guadagno attivato. Avviare l'acquisizione dei dati MSI, quindi costruire le immagini MS a partire dai file MS grezzi come descritto nel protocollo testuale.Configurare il sistema a singola sonda seguendo le istruzioni per la MSI e regolare la portata del solvente. Lavare le cellule coltivate aderenti ai vetrini microcopertura con PBS per rimuovere il mezzo di coltura e i componenti extracellulari del farmaco. Successivamente, posizionare il vetrino contenente le cellule sul sistema motorizzato di traslazione XYZ per l'esperimento.Posizionare lo stereomicroscopio digitale sopra il campione, focalizzandolo sulla punta della sonda singola per monitorare la penetrazione cellulare durante l'analisi. Utilizzare il microscopio digitale USB posizionato lateralmente rispetto alla sonda singola per monitorare le condizioni operative dell'emettitore nanoESI sulla sonda singola. Utilizzare il programma di controllo del palchetto motorizzato XYZ e lo stereomicroscopio digitale per individuare una cellula di interesse e posizionare con precisione la punta della sonda singola sopra il campione.Avviare l'acquisizione dei dati MS prima che la punta della sonda singola venga inserita nella cellula. Abbassare la piastra contenente la cellula per estrarre la punta della sonda singola dalla cellula. Infine, lasciare scorrere il solvente per circa tre minuti, in modo da lavare completamente la sonda singola.È stata eseguita l'analisi spettrometrica di massa ambientale di sezioni di rene di topo e un elevato numero di molecole presenti sulla superficie del tessuto può essere rilevato. Sono state rappresentate la distribuzione spaziale e l'abbondanza relativa di molteplici molecole sulla superficie del tessuto. Una risoluzione spaziale di 8,5 micron è stata ottenuta osservando transizioni nette di caratteristiche presenti all'interno dei dati di spettrometria di massa.La fabbricazione della sonda singola con una punta affilata e canali aperti è fondamentale per l'analisi di singole cellule. Sono necessari microscopi per individuare le cellule bersaglio e monitorare il processo di penetrazione cellulare. Anche la variazione del segnale negli spettri di massa fornisce informazioni aggiuntive per confermare la penetrazione nella cellula.Un gran numero di molecole è stato rilevato da singole cellule vive. Quando viene utilizzato per studi su farmaci antitumorali, si effettuano esperimenti su cellule di controllo per mostrare le differenze indotte dal trattamento con farmaci antitumorali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come viene fabbricata la singola sonda e di come questo dispositivo viene utilizzato per l'analisi mediante spettrometria di massa di singole cellule e per l'imaging mediante spettrometria di massa in condizioni ambientali di tessuti biologici.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché sono necessarie istruzioni dettagliate per realizzare il dispositivo a singola sonda, configurare l'intero sistema e utilizzare gli strumenti. Una volta acquisita padronanza, l'analisi di singole cellule può essere eseguita in modo continuativo su numerose cellule. Ogni analisi richiede meno di tre minuti.Il completamento di un'esperimento di imaging MS in condizioni ambiente può richiedere alcune ore, a seconda delle dimensioni del campione, della risoluzione spaziale e dello spettrometro di massa utilizzato. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che la fabbricazione di una sonda singola di alta qualità rappresenta il passaggio fondamentale. Inoltre, la taratura e il funzionamento dello strumento sono essenziali per condurre con successo un esperimento.Possono essere sviluppati altri metodi seguendo procedure simili a quelle presentate qui. Ad esempio, i reagenti possono essere aggiunti al solvente del campione e possono essere eseguite analisi reattive a singola cellula e MSI ambientale per migliorare il rilevamento di molecole dai campioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori sia nello studio dell'analisi a singola cellula che nell'imaging mediante spettrometria di massa in condizioni ambientali.Questa tecnica potrebbe essere utilizzata per la ricerca in biologia cellulare, studi di farmacologia e test clinici. Non dimenticare che lavorare con capillari di quarzo appuntiti e resina epossidica polimerizzabile con raggi UV può essere pericoloso, e precauzioni come indossare guanti e occhiali di protezione contro i raggi UV devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

applications-single-probe-mass-spectrometry-imaging-single-cell

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analisi di singola cellula viene effettuata mediante spettrometria di massa su cellule animali e vegetali a pressione atmosferica, utilizzando una fibra ottica affilato per assaggiare le cellule per la ionizzazione elettrospray ablazione laser (LAESI) spettrometria di massa.

Analisi diretta di singole cellule mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica

Linee cellulari di cancro immortalato può essere coltivata come colture cellulari in 3D, un modello importante per la ricerca biologica. Questo protocollo descrive massa spettrometria di imaging di colture cellulari 3D, tra cui il miglioramento della piattaforma di preparazione del campione. L'obiettivo di questo protocollo è quello di istruire gli utenti a preparare colture cellulari in 3D per l'analisi di imaging spettrometria di massa.

Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare

Descriviamo i passaggi che permettono il campionamento veloce in situ di una piccola parte di una singola cella con alta precisione e l'invasione minima utilizzando micro-campionamento basato sul capillare, per facilitare la caratterizzazione chimica di uno snapshot di attività metabolica in vivere gli embrioni utilizzando una piattaforma di spettrometria di massa e di elettroforesi capillare su misura singola cella.

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

Un nuovo metodo di preparazione del campione è stato sviluppato per ospitare coculture delle cellule e del tessuto per rilevare cambio piccola molecola usando la spettrometria totale imaging.

Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging

Una piattaforma di manipolazione cellulare integrata è sviluppata per l'uso in combinazione con una configurazione di spettrometria di massa a singola sonda per l'analisi on-line delle singole cellule delle sospensioni in condizioni ambientali.

Piattaforma di manipolazione cellulare integrata accoppiata con la sonda singola per l'analisi della spettrometria di massa di farmaci e metaboliti in singole cellule di sospensione

Questo articolo introduce metodi di preparazione di esempio per un metodo analitico unico in tempo reale basato sulla spettrometria di massa ambientale. Questo metodo ci permette di eseguire analisi in tempo reale delle molecole biologiche in vivo senza particolari pretrattamenti.

Preparazione del campione per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray sonda

Questo protocollo presenta una piattaforma integrata di spettroscopia-massa spectromo (MS) in grado di raggiungere la risoluzione a cella singola. La spettroscopia raman può essere utilizzata per studiare la risposta cellulare ai farmaci, mentre la SM può essere utilizzata per l'analisi mirata e quantitativa dell'assorbimento e del metabolismo dei farmaci.

Una spettroscopia Raman integrata e una piattaforma di spettrometria di massa per studiare l'assorbimento di farmaci a singola cellula, il metabolismo e gli effetti

In questo protocollo, descriviamo come preparare le cellule di mammifero per l'analisi proteomica a singola cellula tramite spettrometria di massa utilizzando reagenti e apparecchiature disponibili in commercio, con opzioni per il pipettaggio manuale e automatico.

Preparazione di proteomica a cella singola per analisi di spettrometria di massa mediante lisi a calore freddo e un vettore isobarico

Questo protocollo delinea l'uso della microMS per la spettrometria di massa MALDI-2 a cellula singola guidata dalla fluorescenza, consentendo una migliore profilazione molecolare delle cellule neuronali primarie di ratto.

Desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice guidata da fluorescenza con spettrometria di massa di postionizzazione indotta da laser di singole cellule neurali di ratto

Questo protocollo mira a preservare i metaboliti cellulari per la spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) combinando il lavaggio con soluzione salina volatile, l'estinzione rapida dell'azoto liquido, la liofilizzazione e lo stoccaggio a -8 °C. Dimostra che l'estinzione dell'azoto liquido è essenziale per mantenere i profili dei metaboliti, mentre la conservazione prolungata del freddo dovrebbe essere ridotta al minimo per prevenire alterazioni metaboliche.

Preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula Studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule

Questo protocollo descrive l'imaging di spettrometria di massa a singola cella delle celle OVCAR-8 utilizzando ionizzazione elettrospray a desorbo accoppiata a spettrometri di massa Orbitrap per analisi metabolomiche ad alta risoluzione spaziale.

Imaging con spettrometria di massa a singola cella utilizzando ionizzazione elettrospray da desorbiamento accortata agli spettrometri di massa Orbitrap

Impara l'uso del Single-probe per l'imaging spettrometrico di massa ambientale e l'analisi di singole cellule vive. Questa tecnica consente analisi ad alta risoluzione di tessuti biologici e distribuzione molecolare.

Applicazioni del singolo-probe: Mass Spectrometry Imaging e analisi singola cella in condizioni ambientali

Esplora altri video