Applicazioni del singolo-probe: Mass Spectrometry Imaging e analisi singola cella in condizioni ambientali

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di creare un dispositivo di campionamento su microscala, il Single-probe, per analizzare singole cellule vive utilizzando la spettrometria di massa in condizioni ambientali. E per eseguire l'imaging con spettrometria di massa ambientale di tessuti biologici con alta risoluzione spaziale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave negli studi biologici e farmaceutici.

Ad esempio, quali sono le molecole presenti nelle singole cellule vive e come sono distribuite nei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la singola sonda è un dispositivo multifunzionale che può essere utilizzato sia per l'analisi di singole cellule vive che per gli esperimenti di imaging di spettrometria di massa ambientale ad alta risoluzione. Sebbene questo metodo possa analizzare singole cellule e tessuti, può essere applicato anche ad altri sistemi in cui è auspicabile il campionamento su microscala, come l'analisi spar di sostanze chimiche e microcolonie vive e biofilm.

A dimostrare la procedura con me sarà Wei Rao, un postdoc del mio laboratorio. Posiziona un intero organo di topo di interesse al centro di un piccolo pozzetto di plastica. Immergere l'organo in un composto che incorpora i tessuti fino a un'altezza di circa 10 mm.

Immergere immediatamente i fazzoletti nell'azoto liquido per il congelamento rapido. Per preparare la sezione di tessuto di topo, prendere l'organo di topo congelato e scongelarlo a 15 gradi Celsius in un crio-microtomo a temperatura controllata. Fissare il tessuto su una base d'acciaio con circa 500 microlitri di composto per l'inclusione dei tessuti e posizionarlo su un supporto di sezionamento crio-microtomo in modo che l'orientamento di sezionamento desiderato venga presentato al coltello.

Sezionare il tessuto a uno spessore di 12 micron. Quindi, posizionare le fette di tessuto sezionate su vetrini da microscopio in policarbonato e lasciarle asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. Ottenere un campione di cellule, come 1 millilitro di sospensione cellulare HeLa, e aggiungerlo a 9 ml di terreno di coltura cellulare completo in una piastra di coltura cellulare standard da 10 cm.

Mantenere le cellule in coltura a 37 gradi Celsius, con il 5% di CO2 per due o tre giorni, fino a quando la superficie di crescita non è coperta al 70-80% sulla piastra di coltura cellulare. Eseguire il passaggio delle cellule nella piastra di coltura cellulare. Per fare ciò, aspirare il terreno di coltura e sciacquare le cellule con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato 1x.

Rimuovere il PBS utilizzando una punta di aspirazione sterile e incubare le cellule con 2,5 ml di tripsina per circa 5 minuti a 37 gradi Celsius per staccare le cellule dalla piastra di coltura. Arrestare l'attività della tripsina aggiungendo 7,5 ml di terreno di coltura cellulare completo e quindi risospendere uniformemente le cellule. Per preparare i campioni di cellule per una spettrometria di massa a singola cellula, o esperimento SCMS, posizionare prima i singoli vetrini di micro-copertura nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti.

Quindi, aggiungere 1,8 ml di terreno di coltura cellulare e 0,2 ml di sospensione cellulare nel pozzetto. Mescolare delicatamente le cellule con una leggera agitazione della piastra prima di incubare in un ambiente al 5% di CO2 a 37 gradi Celsius, per circa 24 ore. Per eseguire il trattamento farmacologico delle cellule in coltura, aggiungere una soluzione di composto farmacologico nella piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti.

Posizionare il tubo di quarzo a doppio foro in un estrattore laser per micropipette ed estrarre un ago di quarzo a doppio foro. Come punti di partenza, imposta il calore a 400, il filamento a tre, la velocità a 80, il ritardo a 150 e l'attrazione a 250. Tagliare la punta di trazione in modo che rimangano circa 5 mm di capillare di quarzo a doppio foro non estratto all'altra estremità.

Tagliare una sezione di 80 mm di capillare di silice fusa come capillare che fornisce solvente. Quindi inserire il capillare in un foro all'estremità piatta dell'ago di quarzo a doppio foro. Usando la fiamma per tirare un capillare di silice fusa come emettitore nanoESI, tagliarlo a 7-10 mm di lunghezza e inserirlo nell'altro foro all'estremità piatta dell'ago di quarzo a doppio foro.

Applicare una quantità minima di resina a polimerizzazione UV sull'estremità piatta dell'ago al quarzo a doppio foro. Solidificare la resina utilizzando una lampada UV a LED per circa 20 secondi, per fissare il capillare che fornisce il solvente e l'emettitore nanoESI. Quindi, tagliare un vetrino da microscopio standard a metà nel senso della lunghezza.

Quindi, posizionare la sonda singola su un'estremità del vetrino, in modo che l'emettitore nanoESI sia puntato verso l'esterno. Applicare la normale resina epossidica sul corpo della sonda singola in modo che si fissi sul vetrino prima di lasciarla per una notte per l'indurimento. Questo sistema include una flangia di interfaccia della sorgente ionica personalizzata dello spettrometro di massa e una scheda ottica in alluminio collegata con un microscopio digitale USB, uno stadio di traslazione XYZ manuale in miniatura e il sistema di stadio di traslazione XYZ motorizzato.

Modificare la flangia dell'interfaccia della sorgente ionica dello spettrometro di massa e fabbricare il supporto dello stereomicroscopio digitale come descritto nel protocollo di testo. Alla scheda ottica in alluminio è possibile collegare lo stereomicroscopio digitale modificato, un microscopio digitale USB, un tavolino di traslazione manuale in miniatura con un supporto flessibile e il sistema di traslazione motorizzato XYZ. Utilizzare il supporto flessibile per fissare il vetrino fissato con una sonda singola.

Quindi, collegare la configurazione a sonda singola allo spettrometro di massa. Regolare il supporto del morsetto flessibile e lo stadio XYZ in miniatura per posizionare l'emettitore della sonda singola davanti all'ingresso dello spettrometro di massa. Scongelare la sezione del campione a temperatura ambiente e posizionarla sul sistema motorizzato dello stadio di traslazione XYZ sotto la sonda singola.

Regolare la posizione del campione modificando le coordinate nel software di controllo. Utilizzare una siringa per pompare il solvente di campionamento a una velocità appropriata. E poi, applicare la tensione di ionizzazione.

Regolare l'altezza della sonda singola in modo che poggi appena sopra la superficie del campione e sia in grado di eseguire l'estrazione superficiale dei metaboliti. Sollevare con cautela il tavolino Z, quindi utilizzare il microscopio digitale USB per monitorare la variazione di distanza tra la punta a sonda singola e la superficie del tessuto. Impostate i parametri per l'rasterizzazione nella sezione di interesse all'interno del campione.

Per le sezioni del rene di topo qui presentate, utilizzare una velocità di rastering di 10 micrometri al secondo e una distanza tra le linee di 20 micrometri. Impostate i parametri per l'rasterizzazione nella sezione di interesse all'interno del campione. Per le sezioni del rene di topo qui presentate, utilizzare una velocità di rastering di 10,0 micrometri al secondo e una distanza tra le linee di 20 micrometri.

Messa a punto di un metodo per l'acquisizione automatizzata di spettri MS dallo spettrometro di massa. Per un'elevata risoluzione di massa MSI su un campione di rene di topo, utilizzare una risoluzione di massa di 60.000, una modalità positiva di 5 kV, 1 microscansione, un tempo di iniezione massimo di 150 millisecondi e il controllo automatico del guadagno attivato. Avviare l'acquisizione dei dati MSI, quindi costruire immagini MS da file MS non elaborati come descritto nel protocollo di testo.

Configurare il sistema a sonda singola secondo le istruzioni per MSI e regolare la portata del solvente. Lavare le cellule coltivate attaccate ai vetrini microcover con PBS per rimuovere i terreni colturali e i componenti extracellulari del farmaco. Quindi posizionare il vetrino contenente la cella sul sistema motorizzato dello stadio di traslazione XYZ per l'esperimento.

Focalizzare lo stereomicroscopio digitale sopra il campione, sulla punta della sonda singola per monitorare la penetrazione cellulare durante l'analisi. Utilizzare il microscopio digitale USB sul lato della sonda singola per monitorare le condizioni di lavoro dell'emettitore nanoESI sulla sonda singola. Utilizzate il programma di controllo del tavolino motorizzato XYZ e lo stereomicroscopio digitale per localizzare una cellula di interesse e posizionare con precisione la punta a sonda singola sopra il campione.

Avviare l'acquisizione dei dati MS prima che la punta a sonda singola venga inserita nella cella. Abbassare la piastra contenente la cella per estrarre la punta della sonda singola dalla cella. Infine, lasciare scorrere il solvente per circa tre minuti, per lavare completamente la sonda singola.

È stata eseguita la spettrometria di massa ambientale di sezioni renali di topo ed è possibile rilevare un gran numero di molecole presenti sulla superficie del tessuto. Sono state tracciate la distribuzione spaziale e l'abbondanza relativa di più molecole sulla superficie del tessuto. Una risoluzione spaziale di 8,5 micron è stata raggiunta attraverso l'osservazione di transizioni nette di caratteristiche presenti all'interno dei dati di spettrometria di massa.

La fabbricazione della sonda singola con una punta affilata e canali aperti è fondamentale per l'analisi di singole cellule. I microscopi sono necessari per localizzare le cellule bersaglio e monitorare il processo di penetrazione cellulare. La variazione del segnale dagli spettri di massa fornisce anche informazioni aggiuntive per confermare la penetrazione cellulare.

Un gran numero di molecole è stato rilevato da singole cellule vive. Quando vengono utilizzati per studi sui farmaci antitumorali, gli esperimenti sulle cellule di controllo vengono utilizzati per mostrare la differenza del trattamento farmacologico antitumorale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come viene fabbricata la sonda singola e di come questo dispositivo viene utilizzato per l'analisi della spettrometria di massa di singole cellule e l'imaging della spettrometria di massa ambientale di tessuti biologici.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo potrebbero avere difficoltà perché sono necessarie istruzioni dettagliate per fabbricare il dispositivo a sonda singola, configurare l'intero sistema e far funzionare gli strumenti. Una volta padroneggiata, l'analisi di singole cellule può essere eseguita continuamente per molte cellule. E ogni analisi richiede meno di tre minuti.

La conclusione di un esperimento di imaging MS ambientale può richiedere alcune ore, a seconda delle dimensioni del campione, della risoluzione spaziale e dello spettrometro di massa utilizzato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la fabbricazione di una singola sonda di alta qualità è il passaggio chiave. Inoltre, l'accordatura e il funzionamento dello strumento sono fondamentali per condurre con successo un esperimento.

Altri metodi possono essere sviluppati seguendo procedure simili a quelle qui presentate. Ad esempio, i reagenti possono essere aggiunti al solvente del campione e l'analisi reattiva di singole cellule e l'MSI ambientale possono essere eseguiti per migliorare la rilevazione delle molecole dai campioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori sia nell'analisi di singole cellule che negli studi di imaging con spettrometria di massa in condizioni ambientali.

Questa tecnica può essere potenzialmente utilizzata per la ricerca di biologia cellulare, studi farmacologici e test clinici. Non dimenticare che lavorare con capillari di quarzo affilati e resina epossidica a polimerizzazione UV può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e occhiali di sicurezza UV.