Misura di fluttuazioni calcio all'interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging è monitorare le fluttuazioni dei livelli di calcio nel lume del reticolo sarcoplasmatico in risposta ad agenti mobilizzatori del calcio, specificatamente nelle cellule muscolari lisce vascolari. Questo metodo può essere utile per chiarire il ciclo cellulare del calcio in modo più diretto. Ad esempio, è molto importante conoscere la relazione tra il trasporto del calcio nel reticolo sarcoplasmatico e lo stress del reticolo endoplasmatico.

Il vantaggio di questa tecnica è che possiamo misurare direttamente il calcio all'interno della cavità del reticolo sarcoplasmatico, invece di doverlo estrapolare da misurazioni indirette dei cambiamenti nel citoplasma. A dimostrare questa tecnica sarà Gabriela Ziomek, studentessa laureata nel mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare una diluizione da uno a 25 del miscuglio proteico in DMEM.

Successivamente, trasferire 200 microlitri di miscela proteica DMEM in ciascuna piastra da 35 millimetri con fondo in vetro, coprendo completamente il cerchio interno di vetro. Lasciare le piastre a temperatura ambiente all'interno della cappa di sicurezza per almeno 30 minuti. Nel frattempo, riscaldare il DMEM con il 10 percento di siero bovino fetale (NCS) a 37 gradi Celsius in un bagno termico.

In seguito, rimuovere il DMEM dal flask di coltura utilizzando una pipetta di vetro. Successivamente, lavare il fondo del flask con PBS sterile tiepido per rimuovere i residui di DMEM rimanenti. Per staccare le cellule muscolari lisce coltivate dal fondo del flask, lavare rapidamente il flask con un millilitro di tripsina e quindi rimuoverla.

Quindi aggiungere un altro millilitro di tripsina. Agitare il matraccio per circa 30-60 secondi per assicurarsi che l'enzima entri in contatto con tutta la superficie inferiore del matraccio prima di rimuoverlo. Una volta che le cellule sono state staccate con la tripsina, aggiungere al matraccio DMEM fresco con il 10 percento di siero bovino normale (NCS) per arrestare la reazione della tripsina.

Trasferire la soluzione cellulare risultante dal pallone a un tubo conico da 50 millilitri pulito e etichettato. Quindi aggiungere un millilitro di DMEM fresco più il 10 percento di NCS a ciascuna piastra da preparare. Successivamente, capovolgere delicatamente il tubo contenente la soluzione cellulare più volte per rompere qualsiasi pellet che potrebbe essersi formato.

Introdurre con pipetta il volume desiderato di soluzione cellulare delicatamente mescolata in ciascuna piastra. Successivamente, agitare accuratamente ogni piastra in senso orario o antiorario per garantire una distribuzione uniforme delle cellule sulla superficie di vetro sul fondo. È necessario aggiungere un numero sufficiente di cellule alla piastra per assicurare che raggiungano un grado di confluenza adeguato nelle successive 48 ore, necessario per un'efficace acquisizione di immagini.

Dopo l'aggiunta del mezzo e della soluzione cellulare in ogni piastra, incubare le piastre a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica per almeno un'ora per consentire alle cellule di attaccarsi correttamente al fondo in vetro. Controllare le piastre al microscopio a intervalli di quindici minuti finché le cellule non risultano chiaramente attaccate. Successivamente, recuperare l'aliquota di Adenavirus D uno SR dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e trasportarla nell'armadio di sicurezza biologica utilizzando un bagno di ghiaccio mobile.

Pipettare la dose desiderata di D one SR freddo in ogni piastra e incubare le cellule infette a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, rinnovare il mezzo aggiungendo un millilitro di DMEM fresco con il dieci percento di NCS. Successivamente, incubare le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica durante la notte.

Dopo un'incubazione notturna, rimuovere il mezzo di coltura dalla piastra. Lavare la piastra di coltura con un millilitro di tampone fisiologico HEPES-PSS caldo per tre volte. Successivamente, aggiungere immediatamente un millilitro di tampone HEPES-PSS caldo e fresco prima della registrazione.

Eseguire l'acquisizione iniziale mediante l'applicazione FRET SE aprendo il software associato al microscopio confocale. Una volta aperta l'applicazione, fare clic sulla scheda impostazione per regolare le condizioni sperimentali desiderate. Modificare manualmente le impostazioni dei canali in modo che le cellule vengano eccitate in sequenza a 440 nanometri per il donatore e per il FRET e a 513 nanometri per l'accettore.

Impostare quindi le lunghezze d'onda di emissione a 488 nanometri per il donatore e a 535 nanometri per il FRET e l'accettore. Successivamente, impostare l'intensità della luce al 15 percento di trasmissione con un tempo di eccitazione di 150 millisecondi per le cellule e intervalli di 10 secondi tra un'esposizione e l'altra. Successivamente, stabilizzare la piastra sul palchetto del microscopio.

Utilizzare il pulsante live per verificare la risoluzione dell'immagine. Regolare ulteriormente le impostazioni per ottenere la risoluzione desiderata. Nella scheda setup, acquisire un'immagine del campione utilizzando il pulsante cattura immagine.

Ora passando alla scheda di valutazione, scegliere il metodo appropriato per calcolare le efficienze FRET per gli esperimenti in corso. Si raccomanda il metodo tre, che utilizza il calcolo raziometrico, per esperimenti che coinvolgono Cameleons come l'indicatore D one SR. Successivamente, passare alla scheda grafico per osservare i valori di intensità registrati in un grafico.

Se lo si desidera, disegnare un'area di interesse (ROI) nel visualizzatore di immagini per osservare l'intensità media corrispondente di questa zona sul grafico. Iniziare la registrazione per raccogliere i dati per almeno tre minuti, al fine di garantire un segnale di base stabile prima di introdurre l'agente di interesse. Successivamente, introdurre un agente mobilizzante del calcio come strumento per esaurire il calcio del reticolo sarcoplasmatico, applicandolo direttamente nella piastra vicino alla regione di interesse in registrazione.

Continuare la registrazione per la durata desiderata dopo il trattamento. Successivamente, acquisire le immagini seriali raziometriche FRET mediante un microscopio confocale invertito utilizzando l'applicazione FRET SE. In questo passaggio, per preparare le piastre di coltura di cellule muscolari lisce aortiche di ratto, lavare la piastra di coltura con un millilitro di tampone fisiologico HEPES-PSS tiepido per tre volte.

Quindi, mescolare l'indicatore con un millilitro di HEPES-PSS tiepido e aggiungerlo sulle piastre di coltura. Incubare le cellule muscolari lisce con l'indicatore per un'ora a temperatura ambiente. Trascorsa un'ora, rimuovere l'indicatore dalla piastra di coltura e lavare con un millilitro di tampone fisiologico HEPES-PSS tiepido per tre volte.

Quindi, aggiungere immediatamente prima della registrazione un millilitro di tampone HEPES-PSS fresco e caldo. Acquisire immagini in serie mediante microscopio confocale invertito. Successivamente, introdurre l'agente mobilizzatore del calcio come strumento per esaurire il calcio del reticolo sarcoplasmatico e continuare la registrazione per il tempo desiderato dopo il trattamento.

Qui sono mostrati gli istantanee rappresentativi di una cellula muscolare liscia trasfettata con l'indicatore D one SR utilizzando filtri a banda passante CFP, FRET e YFP. Questa figura mostra gli istantanee in pseudocolore in tempo reale di cellule muscolari lisce aortiche di ratto in coltura, trasfettate con D one SR. Il trattamento con due micromolar di Thapsigargin ha mostrato una diminuzione dell'intensità del segnale, indicante una significativa riduzione del contenuto di calcio nel reticolo sarcoplasmatico dovuta al rilascio di calcio indotto da Thapsigargin. E questo grafico mostra la traccia rappresentativa del rapporto normalizzato di D one SR nelle cellule muscolari lisce in coltura trattate con due micromolar di Thapsigargin, che conferma una significativa diminuzione del calcio nel reticolo sarcoplasmatico.

Di seguito sono mostrate immagini rappresentative di cellule muscolari lisce aortiche di ratto in coltura, caricate con un indicatore citoplasmatico del calcio e trattate con due micromolari di tapsigargina. Come mostrato, la tapsigargina provoca un significativo aumento dell'intensità del segnale all'interno del citoplasma, dovuto al rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico. Questo grafico mostra un tracciato rappresentativo del rapporto normalizzato di Fluo quattro AM nelle cellule muscolari lisce in coltura trattate con due micromolari di tapsigargina. L'aumento del segnale di calcio rappresentato è considerato proporzionale alla quantità di calcio rilasciata dal reticolo sarcoplasmatico. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in circa 48 ore, dalla preparazione alla conclusione, se eseguita correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante mantenere le cellule nelle condizioni descritte per garantire la loro vitalità prima della trasfezione con l'indicatore di calcio. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come preparare cellule in coltura per consentire la misurazione dei livelli di calcio nel reticolo sarcoplasmatico utilizzando l'indicatore D one SR.