Name: Misura di fluttuazioni calcio allinterno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Scopri come misurare le fluttuazioni del calcio nel reticolo sarcoplasmatico di cellule muscolari lisce vascolari mediante imaging confocale FRET. Questo metodo permette di studiare direttamente il ciclo del calcio cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Canadian Institutes of Health Research [MOP-1.112.666 per CVB &amp; ME].

dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti e le procedure sono state condotte in accordo con le linee guida Laboratory Biosafety della University of British Columbia, Vancouver, Canada. 1. Preparazione di 35 mm con fondo di vetro piatti della cultura per FRET-based Microscopia confocale <ol><li> Preparare piatti utilizzando la hr seguente procedura 36-48 prima di esperimenti. </li><li> Recupera miscela proteica gelatinosa scelto e lo 0,25% tripsina-EDTA da -20 ° C di stoccaggio e tenerli in bagno di ghiaccio mobili fino al momento dell&#39;uso. NOTA: La miscela di proteine ​​di rivestimento deve essere esposto al RT per un breve periodo di tempo per evitare che il composto solidificazione prima dell&#39;uso. soluzione tripsina dovrebbe anche essere a mantenere refrigerata fino a quando necessario; In alternativa, tripsina può essere recuperato da stoccaggio -20 ° C a seguito del completamento della fase 1.5. </li><li> Preparare una diluizione 1:25 di miscela proteica: DMEM (senza siero aggiunto, refrigerati). Trasferire il volume appropriato di proteine ​​miscela / DMEM ad ogni piatto in fase di preparazione. Per 35 lastre di vetro a fondo mm, aggiungere circa 200 ml di coprire completamente cerchio di vetro interno sulla parte inferiore della piastra. </li><li> Lasciare le piastre a sedere per almeno 30 minuti all&#39;interno della cappa di sicurezza e a temperatura ambiente. DMEM caldo con il 10% NCS a 37 ° C in bagno d&#39;acqua durante questo periodo di tempo. </li><li> tripsina calda in bagno d&#39;acqua a 37 ° C immediatamente prima passaggi successivi. </li><li> Rimuovere DMEM che è attualmente in pallone di coltura utilizzando una pipetta di vetro e di aspirazione. Lavare piano del pallone con caldo PBS sterile per rimuovere i residui rimanenti DMEM. </li><li> Rimuovere le cellule muscolari lisce precedentemente coltivate dal basso pallone: NOTA: Boccetta è stata fondata giorni di tempo per questo passaggio per permettere alle cellule di raggiungere confluenza desiderata (circa l&#39;80%) prima della preparazione piatto. Le cellule sono state inizialmente sospese nel pallone in 20 ml di DMEM con 10% NCS ed incubate a 37 ° C con 5% di CO 2 fornitura per 24 ore, dopo di che fornitura DMEM era riposato e le cellule sono stati restituiti al incubatore. DMEM è stato aggiornato vigiliary 48 ore dopo questi primi passi fino a quando le cellule hanno raggiunto confluenza. <ol><li> Lavare Boccetta rapidamente con 1 ml di tripsina e quindi rimuovere 1 ml tripsina usando aspirazione. </li><li> Aggiungere in altre 1 ml di tripsina e lasciare per lungo periodo (circa 30-60 sec), swishing pallone per garantire l&#39;enzima fa contatto con l&#39;intero fondo del pallone. </li><li> Osservare quanto le cellule hanno staccato al microscopio fino soddisfatto con la separazione dalla boccetta. soluzione fruscio tripsina si alternano e si verifica il distacco delle cellule fino soddisfatti proporzione di cellule separate dalla boccetta. NOTA: Il pallone può essere restituito al incubatore per circa 30-60 secondi per accelerare questo processo a 37 ° C. </li><li> Una volta che le cellule sono state sloggiato con tripsina, aggiungere DMEM fresco con 10% NCS al pallone per fermare la reazione tripsina (volume sufficiente affinché tripsina costituisce 1/8 del volume totale nel pallone). NOTA: per esempio, quando si utilizza un pallone di coltura da 250 ml, questo sarebbeessere 7 ml DMEM aggiunge 1 ml di tripsina comportare 8 ml di soluzione di cellule. </li></ol></li><li> Trasferimento risultante soluzione di cellule dal pallone ad un (etichettati) tubo da 50 ml pulito. </li><li> Aggiungere 1 ml di DMEM fresco più 10% NCS per ogni piatto in preparazione (media sufficiente per durare 24 ore). </li><li> Capovolgere delicatamente provetta contenente soluzione di cellule più volte per rompere qualsiasi pellet che possono essersi formate. </li><li> Pipetta volume di soluzione delle cellule delicatamente mescolato in ciascun piatto desiderato. NOTA: Il numero SMC consigliato placcato per questo protocollo è 0,5-0,8 x 10 6 per 35 piatti della cultura mm. Questi numeri possono variare a seconda del tipo di cellula e dovrebbero essere testato e modificato da ciascun laboratorio. </li><li> Agitare ogni piatto a fondo in senso orario / antiorario per garantire la parità di distribuzione delle cellule attraverso fondo di vetro. </li></ol> 2. Transient trasfezione con adenovirale vettore di trasporto D1SR Ca 2+ Indicatore <ol><li> Dopo aggiunta di medium e la soluzione cellulare per ogni piastra, lasciano piastre ad incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 alimentazione per almeno 1 ora per permettere alle cellule di allegare correttamente vetro sul fondo di piatti. Controllare piastre al microscopio a intervalli di 15 minuti fino a quando le cellule sono chiaramente allegati. </li><li> Recupera adenovirus-D1SR un&#39;aliquota da stoccaggio -80 ° C e tenere in bagno di ghiaccio mobili per il trasporto di cabina di sicurezza biologica. </li><li> Pipetta dose desiderata (molteplicità di infezione di 100) di D1SR refrigerate per ciascuna piastra. NOTA: Il calcolo del volume di soluzione adenovirale necessaria per piastra dipende dal titolo del virus nella soluzione di riserva originale, che si presenta come unità formando la placca (PFU). Sulla base della nostra esperienza, si consiglia una molteplicità di infezione (MOI) di 100, che viene interpretato come le particelle numero o virali necessari per infettare una cellula muscolare liscia (SMC) nella piastra di coltura. </li><li> Incubare le cellule infettate a 37 ° C con 5% di CO 2 di alimentazione O / N. </li><li> Il giorno dopo, ricostituire le cellule con 1 ml di DMEM fresco più 10% NCS. </li><li> Incubare le piastre in un incubatore umidificato a 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li></ol> 3. Misurazione della SR Luminal Ca 2+ Utilizzando FRET-based Imaging confocale <ol><li> Seguendo O / N incubazione, rimuovere il terreno di coltura dalla piastra. </li><li> Lavare la piastra di coltura con 1 ml caldo tampone fisiologici HEPES-PSS contenente (in mmol·L - 1) NaCl 140, glucosio 10, KCl 5, Hepes 5, CaCl 2 1.5 e MgCl 2 1 (pH 7,4) per tre volte. </li><li> Aggiungere 1 ml caldo tampone HEPES-PSS fresco immediatamente prima dell&#39;inizio della registrazione. </li><li> Eseguire l&#39;imaging iniziale utilizzando l&#39;applicazione FRET SE (sensibilizzato Emission) (o una funzione analoga) sul software associato del microscopio confocale. <ol><li> Una volta che l&#39;applicazione è aperta, fare clic nella scheda &quot;Setup&quot; per regolare le impostazioni per ottenere condizioni sperimentali desiderati. </li> &lt;li&gt; cambiare manualmente le impostazioni del canale in modo che le cellule siano eccitati in sequenza a 440 nm (per il donatore e ti agiti canali) e 513 nm (per il canale accettore). Raccogliere le lunghezze d&#39;onda di emissione a 488 nm (per donatore) e 535 nm (per il tasto e accettore). </li><li> Impostare l&#39;intensità della luce in trasmissione il 15%, con 150 ms di eccitazione tempo di esposizione di cellule (tempo di registrazione per tre sequenziale donatore CFP, FRET e canali accettori YFP) e intervalli di 10 sec tra le esposizioni. </li></ol></li><li> Stabilizzare piatto sul palco microscopio. </li><li> Utilizzare il pulsante &quot;Live&quot; per controllare la risoluzione delle immagini. Modificare le impostazioni ulteriormente fino a raggiungere risoluzione desiderata. </li><li> Ancora sotto la scheda &quot;Impostazioni&quot;, scattare una foto del campione utilizzando il pulsante &quot;Cattura immagine&quot;. </li><li> Passando alla scheda &quot;Valutazione&quot;, scegliere il metodo appropriato per calcolare l&#39;efficienza FRET per gli esperimenti stato fatto. Metodo 3, utilizzando il calcolo Raziometrico [E A (i) = B / A], È consigliato per gli esperimenti che coinvolgono Cameleons quali l&#39;indicatore D1SR. </li><li> Passare alla scheda &quot;Grafico&quot; per essere in grado di osservare i valori di intensità in fase di registrazione in forma grafica durante l&#39;esperimento. </li><li> Disegnare un ROI nel visualizzatore di immagini per osservare la corrispondente intensità media di questa area di interesse sul grafico con il procedere dell&#39;esperimento. NOTA: Investigator può anche scegliere di disegnare più ROI e hanno corrispondente intensità essere registrati e visualizzati contemporaneamente sul grafico. In alternativa, gli investigatori possono delineare una singola ROI per la registrazione iniziale, e procedere a delineare più ROI in un secondo momento aprendo il file esperimento su una versione di analisi orientata dei dati del software. NOTA: Per ulteriori dettagli sui passi necessari per impostare esperimenti FRET-based si possono trovare nei manuali guidata applicazione FRET. Se il microscopio non è dotato il FRET guidata, il seguente protocollo può essere utilizzato per impostare i parametri permanualmente la registrazione. </li><li> Inizia registrazione e poter rilevare i dati per almeno 3 minuti per assicurare una registrazione basale costante del segnale prima di introdurre l&#39;agente di interesse. </li><li> Introdurre Ca 2+ agente -moving (es 2 mM thapsigargin; 100 nm endotelina-1) come strumento per esaurire SR Ca 2+, pipettando manualmente la dose predeterminata direttamente nella piastra in un posto più vicino alla regione di interesse dell&#39;essere registrata possibile. Continuare la registrazione per un trattamento post tempo desiderato. </li><li> Cattura raziometrico FRET immagini seriali (512 x 512 pixel) con un obiettivo ad immersione in olio 63X del microscopio invertito confocale utilizzando l&#39;applicazione FRET SE. </li><li> Raccogliere i dati risultanti dalle immagini da un gruppo di 5-10 SMC in ciascuna regione di interesse (ROI) e successivamente formattare e analizzare le statistiche utilizzando il software-based. <ol><li> Per salvare i dati per un uso successivo, tasto destro del mouse sopra la traccia registrata e scegliere l&#39;opzione &quot;Esporta&quot; per Save il foglio di calcolo con intensità di segnale registrati medi sul disco scelto dello sperimentatore. </li><li> Normalizzare i dati provenienti da ciascun esperimento dividendo ciascun punto di dati per il valore di intensità partire osservato a punto di tempo 0 sec. </li><li> Importa dati normalizzati da fogli di calcolo in un file di progetto programma statistico copiando e incollando le righe di dati rilevanti dal loro foglio di calcolo / sec originale manualmente. </li><li> Generazione automatica di grafici corrispondenti alle serie di dati incollate nel programma. NOTA: Le impostazioni di default del programma generano grafici lineari da dati importati. Tipo di grafico visualizzato può essere modificata facendo clic sul pulsante &quot;Scegli un altro tipo di grafico&quot; sotto il &quot;Change&quot; Intestazione trovato all&#39;interno della barra degli strumenti principale. </li><li> dati del pool che rappresentano più prove indipendenti all&#39;interno di un gruppo più ampio di esperimenti identici in un unico foglio di dati per produrre una traccia media per il test specifico effettuato. </li></ol></li></ol&gt; 4. Preparazione del citoplasmatica di Ca 2+ Indicatore <ol><li> Sciogliere 0,0125 g Acido Pluronic (PA) in 1 ml di dimetilsolfossido (DMSO) in una provetta nero (può essere necessario riscaldare il tubo in bagnomaria cellulare per aiutare a sciogliere PA). </li><li> Recuperare un tubo (50 ug) del citoplasmatica di Ca 2+ colorante indicatore (Fluo-4 AM) da stoccaggio -20 ° C. </li><li> Avvolgere il tubo di colorante in un foglio di proteggere il più possibile il contatto con la luce. </li><li> Pipettare 45 ml di soluzione di DMSO + PA nella provetta contenente il colorante. Avvolgere soluzione DMSO + PA in un foglio e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare contenuto della provetta accuratamente pipettando soluzione giù più volte su e. In alternativa, il tubo sonicare tintura per 10 min. NOTA: Entrambi i metodi di fondo distribuzione del colorante nella soluzione DMSO + PA sarà sufficiente; si tratta semplicemente di una questione di preferenza del ricercatore. Se investigatore sceglie di sonicare soluzione,dovrebbe essere fatto in un luogo isolato / stanza dove gli altri non saranno interessati dal rumore. Sperimentatore deve inoltre utilizzare silenziatori pesanti per proteggere le orecchie. <ol><li> Se sonicating soluzione, inserire il tubo stagnola avvolto contenente il colorante all&#39;interno di un titolare di tubo di schiuma e posto all&#39;interno del bagno completo sonicatore 2/3 (con dH 2 O). </li><li> Luogo bagno sonicatore in luogo isolato / camera e macchina di potere su (garantire copricapo protettivo è a posto prima di iniziare processo di sonicazione). Lasciare spazio e lasciare macchina in funzione per 10 minuti prima di chiudere fuori e recuperare il tubo (tenere avvolto in un foglio al riparo dalla luce per più a lungo possibile). </li></ol></li><li> Aliquota della soluzione ora accuratamente miscelati in provette da microcentrifuga scuri (5 ml per provetta, dovrebbe essere in grado di fare 10 tubi totale). </li><li> Avvolgere ogni tubo aliquota in un foglio. Etichettare le provette e conservare in essiccante a -20 condizioni ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 5. Misura della citoplasmatica di Ca 2+ <ol><li> Seguire i passaggi a 1,1-1,12 per preparare piastre di coltura di SMC aortico di ratto. </li><li> Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra in cultura post 48 ore. </li><li> Rimuovere l&#39;aliquota precedentemente preparata di citoplasmatica indicatore di Ca 2+ (5 ml) da stoccaggio -20 ° C e mantenere in bagno di ghiaccio mobili fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Lavare la piastra di coltura con 1 ml caldo tampone fisiologici HEPES-PSS contenente (in mmol·L - 1) NaCl 140, glucosio 10, KCl 5, Hepes 5, CaCl 2 1.5 e MgCl 2 1 (pH 7,4) per tre volte. </li><li> Mescolare l&#39;indicatore di 1 ml di HEPES warm-PSS e caricarlo sulla piastra di coltura. </li><li> Incubare SMCs con l&#39;indicatore per 1 ora a RT (24 ° C). </li><li> Rimuovere l&#39;indicatore dalla piastra di coltura e lavare con 1 ml caldi fisiologici HEPES-PSS tampone per tre volte. </li><li> Aggiungere 1 ml caldo tampone HEPES-PSS fresco immediatamente prima dell&#39;inizio della registrazione. </li><li> Cattura immagini seriali (512 x 512 pixel) con un 63X oobiettivo il-immersione del microscopio invertito confocale. <ol><li> Modificare manualmente le impostazioni in modo che le cellule sono eccitati a 488 nm, e le lunghezze d&#39;onda di emissione sono raccolti a 555 nm con una velocità di scansione di 700 Hz. </li><li> Impostare l&#39;intensità della luce di trasmissione 15%, con 150 msec tempo di esposizione eccitazione delle cellule (la quantità di tempo che le cellule sono esposte alla luce ad intervalli di tempo indicati durante la registrazione) e 5 sec intervalli tra le esposizioni. </li></ol></li><li> Stabilizzare piatto sul palco microscopio e avviare la registrazione. </li><li> Record per almeno 3 minuti per assicurare una registrazione basale costante del segnale prima di introdurre l&#39;agente di interesse. </li><li> Introdurre Ca 2+ -moving agente (ad esempio 2μM tapsigargina) come strumento per la deplezione SR Ca 2+ (come descritto al punto 3.16) e continuare la registrazione per quantità desiderata di trattamento post tempo. </li><li> intensità del segnale di registrazione utilizzando il software specifico per microscopio a fluorescenza media sisegnal (F / F 0) da un gruppo di 5-10 SMCs in ciascuna regione di interesse (ROI). Raccogliere, il formato, e analizzare i dati derivanti dalle immagini utilizzando il software di analisi dei dati. Vedere i passaggi 3.18.1-3.18.5 per la descrizione di raccolta e analisi dei dati utilizzando questo software. </li></ol>

<ol><li>Hennings, H., Michael, D., Cheng, C., Steinert, P., Holbrook, K., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Whitfield, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+calcium+and+cyclic+AMP+in+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of calcium and cyclic AMP in cell proliferation.</a> Ann N Y Acad Sci. 339 (1), 216-240 (1980).</li>
<li>Nicotera, P., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in apoptosis.</a> Cell Calcium. 23 (2-3), 173-180 (1998).</li>
<li>Wei, C., Wang, X., Chen, M., Ouyang, K., Song, L. S., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+flickers+steer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium flickers steer cell migration.</a> Nature. 457 (7231), 901-905 (2009).</li>
<li>Ashby, M. C., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+calcium+and+the+functions+of+intracellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER calcium and the functions of intracellular organelles.</a> Sem Cell Dev Biol. 12 (1), 11-17 (2001).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+calcium+and+Alzheimer%27s+disease%3A+in+a+state+of+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+signal%22%5BJournal%5D)">ER calcium and Alzheimer's disease: in a state of flux.</a> Sci signal. 3 (114), (2010).</li>
<li>Rutkowski, D. T., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trip+to+the+ER%3A+coping+with+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A trip to the ER: coping with stress.</a> Trends Cell Biol. 14 (1), (2004).</li>
<li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">ER stress and the unfolded protein response.</a> Mutat Res. 569 (1-2), 29-63 (2005).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Poburko, D., Liao, C. H., van Breemen, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in vascular smooth muscle cells.</a> Circ Res. 104 (1), 104-112 (2009).</li>
<li>Esfandiarei, M., Fameli, N., Choi, Y. Y., Tehrani, A. Y., Hoskins, J. G., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waves+of+calcium+depletion+in+the+sarcoplasmic+reticulum+of+vascular+smooth+muscle+cells%3A+an+inside+view+of+spatiotemporal+Ca2%2B+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Waves of calcium depletion in the sarcoplasmic reticulum of vascular smooth muscle cells: an inside view of spatiotemporal Ca2+ regulation.</a> PloS one. 8 (2), e55333(2013).</li>
<li>Cobbold, P. H., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+bioluminescence+measurement+of+cytoplasmic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and bioluminescence measurement of cytoplasmic free calcium.</a> Biochem J. 248 (2), 313-328 (1987).</li>
<li>Park, M. K., Ashby, M. C., Erdemli, G., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear%2C+perigranular+and+sub-plasmalemmal+mitochondria+have+distinct+functions+in+the+regulation+of+cellular+calcium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear, perigranular and sub-plasmalemmal mitochondria have distinct functions in the regulation of cellular calcium transport.</a> The EMBO journal. 20 (8), 1863-1874 (2001).</li>
<li>Lovett, J. L., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+stores+in+Toxoplasma+gondii+govern+invasion+of+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium stores in Toxoplasma gondii govern invasion of host cells.</a> J Cell Sci. 116 (14), 3009-3016 (2003).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Palmer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+indicators+based+on+computationally+redesigned+calmodulin-peptide+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs.</a> Chem Biol. 13 (5), 521-530 (2006).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive la transfezione di VSMCs con l&#39;adenovirus D1SR per studiare Ca 2+ concentrazioni all&#39;interno del lume del SR. Questo metodo consente la misura diretta di Ca 2+ all&#39;interno di questo organello nonché il suo movimento in / out della SR in conseguenza dell&#39;applicazione di diversi agenti calcio-movimento. Questo metodo ha molti vantaggi per gli investigatori che lavorano per una comprensione completa di come i cambiamenti a SR e citoplasmatici di Ca 2+</s...

Ca 2+ è uno ione molto importante si trova in abbondanza all&#39;interno di ogni singola cellula del corpo. Ha ruoli significativi in molte funzioni cellulari diverse, tra cui la crescita, la proliferazione, la migrazione e l&#39;apoptosi 1-4. E &#39;ben noto che la Ca 2+ può influenzare questi processi attraverso azioni dirette e indirette, e di conseguenza, le modifiche ai normali concentrazioni intracellulari di questo ione può facilmente portare a risultati negativi per le cellule colpite. Il SR è considerato come il più grande intracellulare Ca 2+ negozio all&#39;interno della cella 5. I livelli di stato stazionario di Ca 2+ sia nel SR e nel citoplasma sono normalmente mantenuti attraverso il flusso costante dentro e fuori le Ca 2+ -transporting canali di questo organello. Le condizioni di stress imposte sulle cellule a causa di qualsiasi forma di lesioni o malattie sono comunemente associati con cambiamenti significativi nella SR Ca 2+ che andare avanti per avere effetti duraturi sulla eglialth della cella. Nel più grave dei casi, l&#39;incapacità di una cellula stressata per recuperare e mantenere lo stato stazionario SR Ca 2 + livelli possono anche culminare nella morte per apoptosi 6-8. La ricerca attuale in cellulari Ca 2+ dinamica è limitata dal fatto che pochi studi di prova organello Ca 2+ contenuto negozio direttamente 9-11. La pratica più comune prevede invece la misura di citoplasmatici di Ca 2+ livelli come misure indirette dei cambiamenti in SR Ca 2+ contenuti 12-14. In questi esperimenti, Ca 2+ viene indotto ad essere rilasciato dalla SR attraverso l&#39;uso di agenti farmacologici che causano deplezione del organello (es thapsigargin). Le conclusioni sono poi disegnati in relazione alle modifiche SR Ca 2+ sulla base fluttuazioni dei citoplasmatici di Ca 2+ concentrazioni. Nonostante la capacità residua per gli investigatori di trarre tali conclusioni in una rotonda manner, questo metodo di SR Ca 2+ misura è chiaramente un modo indiretto per raccogliere tali informazioni, con molte limitazioni relative all&#39;interpretazione dei dati raccolti. Per aggirare questo chiaro restrizione, è necessario misurare la quantità di Ca 2+ trovato direttamente all&#39;interno della rete luminale SR. Vitale per il risultato finale di essere in grado di registrare direttamente endoluminali SR livelli di Ca 2+ sono gli strumenti di coltura cellulare e l&#39;indicatore di Ca 2+ utilizzato. Per i dati di riferimento nel manoscritto attuale, è importante notare che VSMC utilizzati provenivano da una linea cellulare congelati. Le cellule sono state coltivate in terreno Dulbecco Modified Eagle (DMEM) + 10% di siero di vitello neonato (NCS) su passaggi 22-26 per gli esperimenti descritti, incubate a una costante 37 ° C con 5% di CO 2 di alimentazione. Utilizzando il metodo attuale, per esempio, le cellule sono state coltivate con successo su una miscela di proteine ​​che simula il extracellulareambiente di molti diversi tipi di tessuto 15. Importante per il successo lungo la vena della SR Ca 2+ ricerca è il tipo di miscela proteina utilizzata; in questo caso, una varietà a basso fattore di crescita era necessario evitare componenti di questo strumento comprometta il regolare Ca 2+ segnalamento e movimenti costantemente avvenuto nelle cellule testate. Dopo crescita di successo di celle di prova, l&#39;indicatore Ca 2+ deve essere effettivamente introdotto a queste cellule in coltura. Questo è diventato possibile utilizzando un vettore adenovirale che porta il SR-residente Ca 2+ indicatore D1SR. Per ottenere una elevata efficienza di trasfezione, le cellule devono essere incubate con vettori virali per almeno 36-48 ore prima di imaging. Questa preparazione fornisce uno strumento affidabile per misurare Ca 2+ transitori all&#39;interno del lume SR con elevata precisione e riproducibilità. Indicatore D1SR utilizzato in questo protocollo è una variante modificata del D1ER Ca 2+ indicator che è stato originariamente creato dal laboratorio del Dr. Roger Tsien presso l&#39;Università della California, San Diego, USA 9,16. Il D1ER originale appartiene a una seconda generazione di geneticamente codificati Ca 2+ indicatori chiamati Cameleons che visualizzano Ca 2+ sensibilità su una gamma molto più ampia (0,5-160 micron) rispetto ai precedenti Ca 2+ indicatori 9,16. Il nuovo D1SR variante, un gentile dono del Dr. Wayne Chen (Università di Alberta, Canada), tuttavia, comporta una sequenza calsequestrina mutante (invece di una sequenza calreticulin come nel D1ER originale). Il calsequestrina mutante ha una ridotta vincolante per Ca 2+ che elimina il problema di competere con calsequestrina endogena nel legame di Ca 2+ all&#39;interno della SR lume 11. L&#39;indicatore D1SR trasporta una proteina fluorescente troncata migliorato ciano (PCP) e di proteine ​​di colore giallo fluorescente (YFP) che si legano da una proteina linker contenente calmodulina modificato (CAM) e M13 (tegli peptide di 26 residui di miosina chinasi luce-catena che lega a camma) sequenze. La sequenza CAM-M13 è stato modificato per evitare M13 di legarsi a calmodulin endogena. Inoltre, per evitare la fuoriuscita SR, una sequenza calsequestrina è stato aggiunto all&#39;estremità 5&#39;della PCP 11. Quando è legato al Ca 2+, il dominio CaM-M13 passa attraverso cambiamenti conformazionali che provocano un aumento del trasferimento di energia tra la PCP accompagnamento e YFP, che viene registrato come un aumento dell&#39;intensità del segnale FRET. D&#39;altra parte, quando la concentrazione di SR luminale Ca 2+ gocce, il dominio CaM-M13 passa attraverso cambiamenti conformazionali inversa, con una conseguente diminuzione del trasferimento di energia tra la PCP accompagnamento e YFP, e un calo significativo dell&#39;intensità del segnale FRET .

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (alto glucosio, piruvato)</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Conservare a -20 &deg; C fino a poco prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero per vitelli neonati</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Conservare a -20 gradi C fino a destra prima dell'uso</td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro da 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 0.2 &mu; Pallone con tappo di tenuta blu ventilato M</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution</td><td>Life technologies</td><td>25200056</td><td>Mantenere a -20 &deg; C fino a poco prima dell'uso</td></tr><tr><td>50 ml Tubo conico in polipropilene</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Regalo</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Life technologies</td><td>F-23917</td><td>Tenere a -20 &deg; C fino a subito prima dell'uso</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga nere da 1,5 ml</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 Microscopio confocale</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 2.6.3 (con applicazione FRET SE Wizard)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce uso fret-based imaging confocale

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Il mantenimento dei livelli di calcio (Ca2+) allo stato stazionario nel reticolo sarcoplasmatico (SR) delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) è vitale per la loro salute generale. Una parte significativa del contenuto intracellulare di Ca2+ si trova all'interno dei depositi SR nelle VSMC. Essendo l'unico organello intracellulare con una stretta associazione con lo spazio extracellulare circostante attraverso le giunzioni membrana plasmatica-SR, si può considerare che la SR costituisca la prima linea di risposta a qualsiasi irregolarità nei transitori di Ca2+ o stress sperimentato dalla cellula. Tra le sue numerose funzioni, una delle più importanti è il suo ruolo nella trasmissione di segnali regolati dal Ca2+ in tutta la cellula per indurre ulteriori reazioni a valle a livello cellulare. L'uso più comune di indicatori citoplasmatici di Ca2+ a questo proposito è nel complesso insufficiente per la ricerca sui cambiamenti altamente dinamici della riserva intraluminale di Ca2+ SR che devono ancora essere completamente caratterizzati. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la misurazione diretta e chiara di SR luminale Ca2+. Questo strumento è utile per indagare sui cambiamenti sfumati in SR Ca2+ che hanno effetti successivi significativi sulla normale funzione e sulla salute della cellula. Le fluttuazioni del contenuto di SR Ca2+ in particolare possono fornirci una quantità significativa di informazioni relative alle risposte cellulari alla malattia o alle condizioni di stress vissute dalla cellula. In questo metodo, una versione modificata di un indicatore di Ca2+ mirato a SR, D1SR, viene utilizzata per rilevare le fluttuazioni di Ca2+ in risposta all'introduzione di agenti in cellule muscolari lisce (SMC) dell'aorta di ratto in coltura. Dopo l'incubazione con l'indicatore D1SR, la microscopia a fluorescenza confocale e l'imaging basato sul trasferimento di energia per risonanza a fluorescenza (FRET) vengono utilizzate per osservare direttamente le variazioni dei livelli intraluminali di SR Ca2+ in condizioni di controllo e con l'aggiunta di agenti agonisti che funzionano per indurre il movimento intracellulare del Ca2+.

Questa sezione fornisce esempi dei risultati che si possono ottenere con il metodo descritto per acquisire dati di concentrazione SR luminali di Ca 2+, rispetto al modo comunemente impiegato per misurare indirettamente modifiche organelli concentrazioni negozio Ca 2+ osservando fluttuazioni citoplasmatica di Ca 2+ . La figura 1A mostra un&#39;istantanea di una regione di intere...

Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging è monitorare le fluttuazioni dei livelli di calcio nel lume del reticolo sarcoplasmatico in risposta ad agenti mobilizzatori del calcio, specificatamente nelle cellule muscolari lisce vascolari. Questo metodo può essere utile per chiarire il ciclo cellulare del calcio in modo più diretto. Ad esempio, è molto importante conoscere la relazione tra il trasporto del calcio nel reticolo sarcoplasmatico e lo stress del reticolo endoplasmatico.Il vantaggio di questa tecnica è che possiamo misurare direttamente il calcio all'interno della cavità del reticolo sarcoplasmatico, invece di doverlo estrapolare da misurazioni indirette dei cambiamenti nel citoplasma. A dimostrare questa tecnica sarà Gabriela Ziomek, studentessa laureata nel mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare una diluizione da uno a 25 del miscuglio proteico in DMEM.Successivamente, trasferire 200 microlitri di miscela proteica DMEM in ciascuna piastra da 35 millimetri con fondo in vetro, coprendo completamente il cerchio interno di vetro. Lasciare le piastre a temperatura ambiente all'interno della cappa di sicurezza per almeno 30 minuti. Nel frattempo, risc

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Focale Ca 2 + Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Vi presentiamo un metodo per isolare rapido (microsecondi) eventi di calcio da più lenti flussi nelle cellule viventi mediante microscopia confocale a scansione laser. Il metodo di misura fluttuazioni di intensità di fluorescenza di indicatori di calcio da scansioni di registrazione linea di diverse centinaia di pixel in una cella. Analisi istogramma permette di isolare la scale temporali dei flussi di calcio diverse.

Misurare flussi di calcio veloce in cardiomiociti

Qui descritto è un metodo per misurare direttamente scintille di calcio, le unità elementari di Ca 2 + liberano dal reticolo sarcoplasmatico in fibre muscolari scheletriche intatte. Questo metodo utilizza osmotico stress-mediata attivazione di Ca 2 + liberazione dal recettore della rianodina nelle fibre muscolari isolate. La dinamica e la capacità omeostatica di intracellulare di Ca 2 + segnalazione possono essere utilizzati per valutare la funzione muscolare in salute e malattia.

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Il calcio è coinvolto in numerose vie di segnalazione fisiologici e fisiopatologici. Imaging cellulare dal vivo richiede attrezzature specializzate e può richiedere molto tempo. Un rapido, metodo semplice usando un citometro di flusso per determinare variazioni relative del calcio citosolico nelle cellule epiteliali aderenti portati in sospensione è stata ottimizzata.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

Qui presentiamo tecniche per l'imaging di eventi locali di Ca2+ mediati da IP3 utilizzando la microscopia a fluorescenza in cellule di mammifero intatte caricate con indicatori di Ca2+ insieme a un algoritmo che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi eventi.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione del reticolo sarcoplasmico Ca2 + riserva e funzione di rimozione del calcio diastolica in cardiomiociti da un sistema di imaging di calcio.

Valutazione del reticolo sarcoplasmico calcio intracellulare e riserva diastolica calcio rimozione nei cardiomiociti ventricolari isolati

Presentiamo protocolli per l'applicazione del nostro indicatore di calcio (GECI) CatchER + per il monitoraggio dei rapidi transitori di calcio nel reticolo endoplasmatico / sarcoplasmatico (ER / SR) di HEK293 e delle cellule del muscolo scheletrico C2C12 utilizzando microscopia a fluorescenza in tempo reale. Viene inoltre discusso un protocollo per la misura e la calibrazione in K d in situ .

Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

Qui descriviamo una metodologia per ottenere una popolazione pura di mioblasti umani dal tessuto muscolare adulto. Queste cellule sono utilizzate per studiare la differenziazione muscolare scheletrica in vitro e, in particolare, per studiare le proteine ​​coinvolte nella segnalazione Ca 2+ .

Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell&#39;entrata del calcio a livello di deposito

Il protocollo descrive il metodo di caricamento di un colorante di calcio fluorescente attraverso il nervo tagliato nei terminali nervosi motori del topo. Inoltre, viene presentato un metodo unico per registrare i transitori di calcio veloci nelle terminazioni nervose periferiche utilizzando la microscopia confocale.

Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

Il presente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di fette polmonari tagliate con precisione dal topo per valutare la contrattilità delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare in un ambiente quasi in vivo .

Utilizzo della fetta polmonare tagliata con precisione per studiare la regolazione contrattile delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare

Scopri come misurare le fluttuazioni del calcio nel reticolo sarcoplasmatico di cellule muscolari lisce vascolari mediante imaging confocale FRET. Questo metodo permette di studiare direttamente il ciclo del calcio cellulare.

Misura di fluttuazioni calcio allinterno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale (Video) | JoVE Journal

Misura di fluttuazioni calcio all'interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

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