Name: Misura di fluttuazioni calcio allinterno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Scopri come misurare le fluttuazioni del calcio nel reticolo sarcoplasmatico di cellule muscolari lisce vascolari mediante imaging confocale FRET. Questo metodo permette di studiare direttamente il ciclo del calcio cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Canadian Institutes of Health Research [MOP-1.112.666 per CVB &amp; ME].

dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti e le procedure sono state condotte in accordo con le linee guida Laboratory Biosafety della University of British Columbia, Vancouver, Canada. 1. Preparazione di 35 mm con fondo di vetro piatti della cultura per FRET-based Microscopia confocale <ol><li> Preparare piatti utilizzando la hr seguente procedura 36-48 prima di esperimenti. </li><li> Recupera miscela proteica gelatinosa scelto e lo 0,25% tripsina-EDTA da -20 ° C di stoccaggio e tenerli in bagno di ghiaccio mobili fino al momento dell&#39;uso. NOTA: La miscela di proteine ​​di rivestimento deve essere esposto al RT per un breve periodo di tempo per evitare che il composto solidificazione prima dell&#39;uso. soluzione tripsina dovrebbe anche essere a mantenere refrigerata fino a quando necessario; In alternativa, tripsina può essere recuperato da stoccaggio -20 ° C a seguito del completamento della fase 1.5. </li><li> Preparare una diluizione 1:25 di miscela proteica: DMEM (senza siero aggiunto, refrigerati). Trasferire il volume appropriato di proteine ​​miscela / DMEM ad ogni piatto in fase di preparazione. Per 35 lastre di vetro a fondo mm, aggiungere circa 200 ml di coprire completamente cerchio di vetro interno sulla parte inferiore della piastra. </li><li> Lasciare le piastre a sedere per almeno 30 minuti all&#39;interno della cappa di sicurezza e a temperatura ambiente. DMEM caldo con il 10% NCS a 37 ° C in bagno d&#39;acqua durante questo periodo di tempo. </li><li> tripsina calda in bagno d&#39;acqua a 37 ° C immediatamente prima passaggi successivi. </li><li> Rimuovere DMEM che è attualmente in pallone di coltura utilizzando una pipetta di vetro e di aspirazione. Lavare piano del pallone con caldo PBS sterile per rimuovere i residui rimanenti DMEM. </li><li> Rimuovere le cellule muscolari lisce precedentemente coltivate dal basso pallone: NOTA: Boccetta è stata fondata giorni di tempo per questo passaggio per permettere alle cellule di raggiungere confluenza desiderata (circa l&#39;80%) prima della preparazione piatto. Le cellule sono state inizialmente sospese nel pallone in 20 ml di DMEM con 10% NCS ed incubate a 37 ° C con 5% di CO 2 fornitura per 24 ore, dopo di che fornitura DMEM era riposato e le cellule sono stati restituiti al incubatore. DMEM è stato aggiornato vigiliary 48 ore dopo questi primi passi fino a quando le cellule hanno raggiunto confluenza. <ol><li> Lavare Boccetta rapidamente con 1 ml di tripsina e quindi rimuovere 1 ml tripsina usando aspirazione. </li><li> Aggiungere in altre 1 ml di tripsina e lasciare per lungo periodo (circa 30-60 sec), swishing pallone per garantire l&#39;enzima fa contatto con l&#39;intero fondo del pallone. </li><li> Osservare quanto le cellule hanno staccato al microscopio fino soddisfatto con la separazione dalla boccetta. soluzione fruscio tripsina si alternano e si verifica il distacco delle cellule fino soddisfatti proporzione di cellule separate dalla boccetta. NOTA: Il pallone può essere restituito al incubatore per circa 30-60 secondi per accelerare questo processo a 37 ° C. </li><li> Una volta che le cellule sono state sloggiato con tripsina, aggiungere DMEM fresco con 10% NCS al pallone per fermare la reazione tripsina (volume sufficiente affinché tripsina costituisce 1/8 del volume totale nel pallone). NOTA: per esempio, quando si utilizza un pallone di coltura da 250 ml, questo sarebbeessere 7 ml DMEM aggiunge 1 ml di tripsina comportare 8 ml di soluzione di cellule. </li></ol></li><li> Trasferimento risultante soluzione di cellule dal pallone ad un (etichettati) tubo da 50 ml pulito. </li><li> Aggiungere 1 ml di DMEM fresco più 10% NCS per ogni piatto in preparazione (media sufficiente per durare 24 ore). </li><li> Capovolgere delicatamente provetta contenente soluzione di cellule più volte per rompere qualsiasi pellet che possono essersi formate. </li><li> Pipetta volume di soluzione delle cellule delicatamente mescolato in ciascun piatto desiderato. NOTA: Il numero SMC consigliato placcato per questo protocollo è 0,5-0,8 x 10 6 per 35 piatti della cultura mm. Questi numeri possono variare a seconda del tipo di cellula e dovrebbero essere testato e modificato da ciascun laboratorio. </li><li> Agitare ogni piatto a fondo in senso orario / antiorario per garantire la parità di distribuzione delle cellule attraverso fondo di vetro. </li></ol> 2. Transient trasfezione con adenovirale vettore di trasporto D1SR Ca 2+ Indicatore <ol><li> Dopo aggiunta di medium e la soluzione cellulare per ogni piastra, lasciano piastre ad incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 alimentazione per almeno 1 ora per permettere alle cellule di allegare correttamente vetro sul fondo di piatti. Controllare piastre al microscopio a intervalli di 15 minuti fino a quando le cellule sono chiaramente allegati. </li><li> Recupera adenovirus-D1SR un&#39;aliquota da stoccaggio -80 ° C e tenere in bagno di ghiaccio mobili per il trasporto di cabina di sicurezza biologica. </li><li> Pipetta dose desiderata (molteplicità di infezione di 100) di D1SR refrigerate per ciascuna piastra. NOTA: Il calcolo del volume di soluzione adenovirale necessaria per piastra dipende dal titolo del virus nella soluzione di riserva originale, che si presenta come unità formando la placca (PFU). Sulla base della nostra esperienza, si consiglia una molteplicità di infezione (MOI) di 100, che viene interpretato come le particelle numero o virali necessari per infettare una cellula muscolare liscia (SMC) nella piastra di coltura. </li><li> Incubare le cellule infettate a 37 ° C con 5% di CO 2 di alimentazione O / N. </li><li> Il giorno dopo, ricostituire le cellule con 1 ml di DMEM fresco più 10% NCS. </li><li> Incubare le piastre in un incubatore umidificato a 37 ° C in 5% CO 2 O / N. </li></ol> 3. Misurazione della SR Luminal Ca 2+ Utilizzando FRET-based Imaging confocale <ol><li> Seguendo O / N incubazione, rimuovere il terreno di coltura dalla piastra. </li><li> Lavare la piastra di coltura con 1 ml caldo tampone fisiologici HEPES-PSS contenente (in mmol·L - 1) NaCl 140, glucosio 10, KCl 5, Hepes 5, CaCl 2 1.5 e MgCl 2 1 (pH 7,4) per tre volte. </li><li> Aggiungere 1 ml caldo tampone HEPES-PSS fresco immediatamente prima dell&#39;inizio della registrazione. </li><li> Eseguire l&#39;imaging iniziale utilizzando l&#39;applicazione FRET SE (sensibilizzato Emission) (o una funzione analoga) sul software associato del microscopio confocale. <ol><li> Una volta che l&#39;applicazione è aperta, fare clic nella scheda &quot;Setup&quot; per regolare le impostazioni per ottenere condizioni sperimentali desiderati. </li> &lt;li&gt; cambiare manualmente le impostazioni del canale in modo che le cellule siano eccitati in sequenza a 440 nm (per il donatore e ti agiti canali) e 513 nm (per il canale accettore). Raccogliere le lunghezze d&#39;onda di emissione a 488 nm (per donatore) e 535 nm (per il tasto e accettore). </li><li> Impostare l&#39;intensità della luce in trasmissione il 15%, con 150 ms di eccitazione tempo di esposizione di cellule (tempo di registrazione per tre sequenziale donatore CFP, FRET e canali accettori YFP) e intervalli di 10 sec tra le esposizioni. </li></ol></li><li> Stabilizzare piatto sul palco microscopio. </li><li> Utilizzare il pulsante &quot;Live&quot; per controllare la risoluzione delle immagini. Modificare le impostazioni ulteriormente fino a raggiungere risoluzione desiderata. </li><li> Ancora sotto la scheda &quot;Impostazioni&quot;, scattare una foto del campione utilizzando il pulsante &quot;Cattura immagine&quot;. </li><li> Passando alla scheda &quot;Valutazione&quot;, scegliere il metodo appropriato per calcolare l&#39;efficienza FRET per gli esperimenti stato fatto. Metodo 3, utilizzando il calcolo Raziometrico [E A (i) = B / A], È consigliato per gli esperimenti che coinvolgono Cameleons quali l&#39;indicatore D1SR. </li><li> Passare alla scheda &quot;Grafico&quot; per essere in grado di osservare i valori di intensità in fase di registrazione in forma grafica durante l&#39;esperimento. </li><li> Disegnare un ROI nel visualizzatore di immagini per osservare la corrispondente intensità media di questa area di interesse sul grafico con il procedere dell&#39;esperimento. NOTA: Investigator può anche scegliere di disegnare più ROI e hanno corrispondente intensità essere registrati e visualizzati contemporaneamente sul grafico. In alternativa, gli investigatori possono delineare una singola ROI per la registrazione iniziale, e procedere a delineare più ROI in un secondo momento aprendo il file esperimento su una versione di analisi orientata dei dati del software. NOTA: Per ulteriori dettagli sui passi necessari per impostare esperimenti FRET-based si possono trovare nei manuali guidata applicazione FRET. Se il microscopio non è dotato il FRET guidata, il seguente protocollo può essere utilizzato per impostare i parametri permanualmente la registrazione. </li><li> Inizia registrazione e poter rilevare i dati per almeno 3 minuti per assicurare una registrazione basale costante del segnale prima di introdurre l&#39;agente di interesse. </li><li> Introdurre Ca 2+ agente -moving (es 2 mM thapsigargin; 100 nm endotelina-1) come strumento per esaurire SR Ca 2+, pipettando manualmente la dose predeterminata direttamente nella piastra in un posto più vicino alla regione di interesse dell&#39;essere registrata possibile. Continuare la registrazione per un trattamento post tempo desiderato. </li><li> Cattura raziometrico FRET immagini seriali (512 x 512 pixel) con un obiettivo ad immersione in olio 63X del microscopio invertito confocale utilizzando l&#39;applicazione FRET SE. </li><li> Raccogliere i dati risultanti dalle immagini da un gruppo di 5-10 SMC in ciascuna regione di interesse (ROI) e successivamente formattare e analizzare le statistiche utilizzando il software-based. <ol><li> Per salvare i dati per un uso successivo, tasto destro del mouse sopra la traccia registrata e scegliere l&#39;opzione &quot;Esporta&quot; per Save il foglio di calcolo con intensità di segnale registrati medi sul disco scelto dello sperimentatore. </li><li> Normalizzare i dati provenienti da ciascun esperimento dividendo ciascun punto di dati per il valore di intensità partire osservato a punto di tempo 0 sec. </li><li> Importa dati normalizzati da fogli di calcolo in un file di progetto programma statistico copiando e incollando le righe di dati rilevanti dal loro foglio di calcolo / sec originale manualmente. </li><li> Generazione automatica di grafici corrispondenti alle serie di dati incollate nel programma. NOTA: Le impostazioni di default del programma generano grafici lineari da dati importati. Tipo di grafico visualizzato può essere modificata facendo clic sul pulsante &quot;Scegli un altro tipo di grafico&quot; sotto il &quot;Change&quot; Intestazione trovato all&#39;interno della barra degli strumenti principale. </li><li> dati del pool che rappresentano più prove indipendenti all&#39;interno di un gruppo più ampio di esperimenti identici in un unico foglio di dati per produrre una traccia media per il test specifico effettuato. </li></ol></li></ol&gt; 4. Preparazione del citoplasmatica di Ca 2+ Indicatore <ol><li> Sciogliere 0,0125 g Acido Pluronic (PA) in 1 ml di dimetilsolfossido (DMSO) in una provetta nero (può essere necessario riscaldare il tubo in bagnomaria cellulare per aiutare a sciogliere PA). </li><li> Recuperare un tubo (50 ug) del citoplasmatica di Ca 2+ colorante indicatore (Fluo-4 AM) da stoccaggio -20 ° C. </li><li> Avvolgere il tubo di colorante in un foglio di proteggere il più possibile il contatto con la luce. </li><li> Pipettare 45 ml di soluzione di DMSO + PA nella provetta contenente il colorante. Avvolgere soluzione DMSO + PA in un foglio e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare contenuto della provetta accuratamente pipettando soluzione giù più volte su e. In alternativa, il tubo sonicare tintura per 10 min. NOTA: Entrambi i metodi di fondo distribuzione del colorante nella soluzione DMSO + PA sarà sufficiente; si tratta semplicemente di una questione di preferenza del ricercatore. Se investigatore sceglie di sonicare soluzione,dovrebbe essere fatto in un luogo isolato / stanza dove gli altri non saranno interessati dal rumore. Sperimentatore deve inoltre utilizzare silenziatori pesanti per proteggere le orecchie. <ol><li> Se sonicating soluzione, inserire il tubo stagnola avvolto contenente il colorante all&#39;interno di un titolare di tubo di schiuma e posto all&#39;interno del bagno completo sonicatore 2/3 (con dH 2 O). </li><li> Luogo bagno sonicatore in luogo isolato / camera e macchina di potere su (garantire copricapo protettivo è a posto prima di iniziare processo di sonicazione). Lasciare spazio e lasciare macchina in funzione per 10 minuti prima di chiudere fuori e recuperare il tubo (tenere avvolto in un foglio al riparo dalla luce per più a lungo possibile). </li></ol></li><li> Aliquota della soluzione ora accuratamente miscelati in provette da microcentrifuga scuri (5 ml per provetta, dovrebbe essere in grado di fare 10 tubi totale). </li><li> Avvolgere ogni tubo aliquota in un foglio. Etichettare le provette e conservare in essiccante a -20 condizioni ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 5. Misura della citoplasmatica di Ca 2+ <ol><li> Seguire i passaggi a 1,1-1,12 per preparare piastre di coltura di SMC aortico di ratto. </li><li> Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra in cultura post 48 ore. </li><li> Rimuovere l&#39;aliquota precedentemente preparata di citoplasmatica indicatore di Ca 2+ (5 ml) da stoccaggio -20 ° C e mantenere in bagno di ghiaccio mobili fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Lavare la piastra di coltura con 1 ml caldo tampone fisiologici HEPES-PSS contenente (in mmol·L - 1) NaCl 140, glucosio 10, KCl 5, Hepes 5, CaCl 2 1.5 e MgCl 2 1 (pH 7,4) per tre volte. </li><li> Mescolare l&#39;indicatore di 1 ml di HEPES warm-PSS e caricarlo sulla piastra di coltura. </li><li> Incubare SMCs con l&#39;indicatore per 1 ora a RT (24 ° C). </li><li> Rimuovere l&#39;indicatore dalla piastra di coltura e lavare con 1 ml caldi fisiologici HEPES-PSS tampone per tre volte. </li><li> Aggiungere 1 ml caldo tampone HEPES-PSS fresco immediatamente prima dell&#39;inizio della registrazione. </li><li> Cattura immagini seriali (512 x 512 pixel) con un 63X oobiettivo il-immersione del microscopio invertito confocale. <ol><li> Modificare manualmente le impostazioni in modo che le cellule sono eccitati a 488 nm, e le lunghezze d&#39;onda di emissione sono raccolti a 555 nm con una velocità di scansione di 700 Hz. </li><li> Impostare l&#39;intensità della luce di trasmissione 15%, con 150 msec tempo di esposizione eccitazione delle cellule (la quantità di tempo che le cellule sono esposte alla luce ad intervalli di tempo indicati durante la registrazione) e 5 sec intervalli tra le esposizioni. </li></ol></li><li> Stabilizzare piatto sul palco microscopio e avviare la registrazione. </li><li> Record per almeno 3 minuti per assicurare una registrazione basale costante del segnale prima di introdurre l&#39;agente di interesse. </li><li> Introdurre Ca 2+ -moving agente (ad esempio 2μM tapsigargina) come strumento per la deplezione SR Ca 2+ (come descritto al punto 3.16) e continuare la registrazione per quantità desiderata di trattamento post tempo. </li><li> intensità del segnale di registrazione utilizzando il software specifico per microscopio a fluorescenza media sisegnal (F / F 0) da un gruppo di 5-10 SMCs in ciascuna regione di interesse (ROI). Raccogliere, il formato, e analizzare i dati derivanti dalle immagini utilizzando il software di analisi dei dati. Vedere i passaggi 3.18.1-3.18.5 per la descrizione di raccolta e analisi dei dati utilizzando questo software. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive la transfezione di VSMCs con l&#39;adenovirus D1SR per studiare Ca 2+ concentrazioni all&#39;interno del lume del SR. Questo metodo consente la misura diretta di Ca 2+ all&#39;interno di questo organello nonché il suo movimento in / out della SR in conseguenza dell&#39;applicazione di diversi agenti calcio-movimento. Questo metodo ha molti vantaggi per gli investigatori che lavorano per una comprensione completa di come i cambiamenti a SR e citoplasmatici di Ca 2+</s...

Ca 2+ è uno ione molto importante si trova in abbondanza all&#39;interno di ogni singola cellula del corpo. Ha ruoli significativi in molte funzioni cellulari diverse, tra cui la crescita, la proliferazione, la migrazione e l&#39;apoptosi 1-4. E &#39;ben noto che la Ca 2+ può influenzare questi processi attraverso azioni dirette e indirette, e di conseguenza, le modifiche ai normali concentrazioni intracellulari di questo ione può facilmente portare a risultati negativi per le cellule colpite. Il SR è considerato come il più grande intracellulare Ca 2+ negozio all&#39;interno della cella 5. I livelli di stato stazionario di Ca 2+ sia nel SR e nel citoplasma sono normalmente mantenuti attraverso il flusso costante dentro e fuori le Ca 2+ -transporting canali di questo organello. Le condizioni di stress imposte sulle cellule a causa di qualsiasi forma di lesioni o malattie sono comunemente associati con cambiamenti significativi nella SR Ca 2+ che andare avanti per avere effetti duraturi sulla eglialth della cella. Nel più grave dei casi, l&#39;incapacità di una cellula stressata per recuperare e mantenere lo stato stazionario SR Ca 2 + livelli possono anche culminare nella morte per apoptosi 6-8. La ricerca attuale in cellulari Ca 2+ dinamica è limitata dal fatto che pochi studi di prova organello Ca 2+ contenuto negozio direttamente 9-11. La pratica più comune prevede invece la misura di citoplasmatici di Ca 2+ livelli come misure indirette dei cambiamenti in SR Ca 2+ contenuti 12-14. In questi esperimenti, Ca 2+ viene indotto ad essere rilasciato dalla SR attraverso l&#39;uso di agenti farmacologici che causano deplezione del organello (es thapsigargin). Le conclusioni sono poi disegnati in relazione alle modifiche SR Ca 2+ sulla base fluttuazioni dei citoplasmatici di Ca 2+ concentrazioni. Nonostante la capacità residua per gli investigatori di trarre tali conclusioni in una rotonda manner, questo metodo di SR Ca 2+ misura è chiaramente un modo indiretto per raccogliere tali informazioni, con molte limitazioni relative all&#39;interpretazione dei dati raccolti. Per aggirare questo chiaro restrizione, è necessario misurare la quantità di Ca 2+ trovato direttamente all&#39;interno della rete luminale SR. Vitale per il risultato finale di essere in grado di registrare direttamente endoluminali SR livelli di Ca 2+ sono gli strumenti di coltura cellulare e l&#39;indicatore di Ca 2+ utilizzato. Per i dati di riferimento nel manoscritto attuale, è importante notare che VSMC utilizzati provenivano da una linea cellulare congelati. Le cellule sono state coltivate in terreno Dulbecco Modified Eagle (DMEM) + 10% di siero di vitello neonato (NCS) su passaggi 22-26 per gli esperimenti descritti, incubate a una costante 37 ° C con 5% di CO 2 di alimentazione. Utilizzando il metodo attuale, per esempio, le cellule sono state coltivate con successo su una miscela di proteine ​​che simula il extracellulareambiente di molti diversi tipi di tessuto 15. Importante per il successo lungo la vena della SR Ca 2+ ricerca è il tipo di miscela proteina utilizzata; in questo caso, una varietà a basso fattore di crescita era necessario evitare componenti di questo strumento comprometta il regolare Ca 2+ segnalamento e movimenti costantemente avvenuto nelle cellule testate. Dopo crescita di successo di celle di prova, l&#39;indicatore Ca 2+ deve essere effettivamente introdotto a queste cellule in coltura. Questo è diventato possibile utilizzando un vettore adenovirale che porta il SR-residente Ca 2+ indicatore D1SR. Per ottenere una elevata efficienza di trasfezione, le cellule devono essere incubate con vettori virali per almeno 36-48 ore prima di imaging. Questa preparazione fornisce uno strumento affidabile per misurare Ca 2+ transitori all&#39;interno del lume SR con elevata precisione e riproducibilità. Indicatore D1SR utilizzato in questo protocollo è una variante modificata del D1ER Ca 2+ indicator che è stato originariamente creato dal laboratorio del Dr. Roger Tsien presso l&#39;Università della California, San Diego, USA 9,16. Il D1ER originale appartiene a una seconda generazione di geneticamente codificati Ca 2+ indicatori chiamati Cameleons che visualizzano Ca 2+ sensibilità su una gamma molto più ampia (0,5-160 micron) rispetto ai precedenti Ca 2+ indicatori 9,16. Il nuovo D1SR variante, un gentile dono del Dr. Wayne Chen (Università di Alberta, Canada), tuttavia, comporta una sequenza calsequestrina mutante (invece di una sequenza calreticulin come nel D1ER originale). Il calsequestrina mutante ha una ridotta vincolante per Ca 2+ che elimina il problema di competere con calsequestrina endogena nel legame di Ca 2+ all&#39;interno della SR lume 11. L&#39;indicatore D1SR trasporta una proteina fluorescente troncata migliorato ciano (PCP) e di proteine ​​di colore giallo fluorescente (YFP) che si legano da una proteina linker contenente calmodulina modificato (CAM) e M13 (tegli peptide di 26 residui di miosina chinasi luce-catena che lega a camma) sequenze. La sequenza CAM-M13 è stato modificato per evitare M13 di legarsi a calmodulin endogena. Inoltre, per evitare la fuoriuscita SR, una sequenza calsequestrina è stato aggiunto all&#39;estremità 5&#39;della PCP 11. Quando è legato al Ca 2+, il dominio CaM-M13 passa attraverso cambiamenti conformazionali che provocano un aumento del trasferimento di energia tra la PCP accompagnamento e YFP, che viene registrato come un aumento dell&#39;intensità del segnale FRET. D&#39;altra parte, quando la concentrazione di SR luminale Ca 2+ gocce, il dominio CaM-M13 passa attraverso cambiamenti conformazionali inversa, con una conseguente diminuzione del trasferimento di energia tra la PCP accompagnamento e YFP, e un calo significativo dell&#39;intensità del segnale FRET .

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (alto glucosio, piruvato)</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Conservare a -20 &deg; C fino a poco prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero per vitelli neonati</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Conservare a -20 gradi C fino a destra prima dell'uso</td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro da 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 0.2 &mu; Pallone con tappo di tenuta blu ventilato M</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution</td><td>Life technologies</td><td>25200056</td><td>Mantenere a -20 &deg; C fino a poco prima dell'uso</td></tr><tr><td>50 ml Tubo conico in polipropilene</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Regalo</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Life technologies</td><td>F-23917</td><td>Tenere a -20 &deg; C fino a subito prima dell'uso</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga nere da 1,5 ml</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 Microscopio confocale</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 2.6.3 (con applicazione FRET SE Wizard)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce uso fret-based imaging confocale

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Il mantenimento dei livelli di calcio (Ca2+) allo stato stazionario nel reticolo sarcoplasmatico (SR) delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) è vitale per la loro salute generale. Una parte significativa del contenuto intracellulare di Ca2+ si trova all'interno dei depositi SR nelle VSMC. Essendo l'unico organello intracellulare con una stretta associazione con lo spazio extracellulare circostante attraverso le giunzioni membrana plasmatica-SR, si può considerare che la SR costituisca la prima linea di risposta a qualsiasi irregolarità nei transitori di Ca2+ o stress sperimentato dalla cellula. Tra le sue numerose funzioni, una delle più importanti è il suo ruolo nella trasmissione di segnali regolati dal Ca2+ in tutta la cellula per indurre ulteriori reazioni a valle a livello cellulare. L'uso più comune di indicatori citoplasmatici di Ca2+ a questo proposito è nel complesso insufficiente per la ricerca sui cambiamenti altamente dinamici della riserva intraluminale di Ca2+ SR che devono ancora essere completamente caratterizzati. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la misurazione diretta e chiara di SR luminale Ca2+. Questo strumento è utile per indagare sui cambiamenti sfumati in SR Ca2+ che hanno effetti successivi significativi sulla normale funzione e sulla salute della cellula. Le fluttuazioni del contenuto di SR Ca2+ in particolare possono fornirci una quantità significativa di informazioni relative alle risposte cellulari alla malattia o alle condizioni di stress vissute dalla cellula. In questo metodo, una versione modificata di un indicatore di Ca2+ mirato a SR, D1SR, viene utilizzata per rilevare le fluttuazioni di Ca2+ in risposta all'introduzione di agenti in cellule muscolari lisce (SMC) dell'aorta di ratto in coltura. Dopo l'incubazione con l'indicatore D1SR, la microscopia a fluorescenza confocale e l'imaging basato sul trasferimento di energia per risonanza a fluorescenza (FRET) vengono utilizzate per osservare direttamente le variazioni dei livelli intraluminali di SR Ca2+ in condizioni di controllo e con l'aggiunta di agenti agonisti che funzionano per indurre il movimento intracellulare del Ca2+.

Questa sezione fornisce esempi dei risultati che si possono ottenere con il metodo descritto per acquisire dati di concentrazione SR luminali di Ca 2+, rispetto al modo comunemente impiegato per misurare indirettamente modifiche organelli concentrazioni negozio Ca 2+ osservando fluttuazioni citoplasmatica di Ca 2+ . La figura 1A mostra un&#39;istantanea di una regione di intere...

Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging è monitorare le fluttuazioni dei livelli di calcio nel lume del reticolo sarcoplasmatico in risposta ad agenti mobilizzatori del calcio, specificatamente nelle cellule muscolari lisce vascolari. Questo metodo può essere utile per chiarire il ciclo cellulare del calcio in modo più diretto. Ad esempio, è molto importante conoscere la relazione tra il trasporto del calcio nel reticolo sarcoplasmatico e lo stress del reticolo endoplasmatico.Il vantaggio di questa tecnica è che possiamo misurare direttamente il calcio all'interno della cavità del reticolo sarcoplasmatico, invece di doverlo estrapolare da misurazioni indirette dei cambiamenti nel citoplasma. A dimostrare questa tecnica sarà Gabriela Ziomek, studentessa laureata nel mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare una diluizione da uno a 25 del miscuglio proteico in DMEM.Successivamente, trasferire 200 microlitri di miscela proteica DMEM in ciascuna piastra da 35 millimetri con fondo in vetro, coprendo completamente il cerchio interno di vetro. Lasciare le piastre a temperatura ambiente all'interno della cappa di sicurezza per almeno 30 minuti. Nel frattempo, riscaldare il DMEM con il 10 percento di siero bovino fetale (NCS) a 37 gradi Celsius in un bagno termico.In seguito, rimuovere il DMEM dal flask di coltura utilizzando una pipetta di vetro. Successivamente, lavare il fondo del flask con PBS sterile tiepido per rimuovere i residui di DMEM rimanenti. Per staccare le cellule muscolari lisce coltivate dal fondo del flask, lavare rapidamente il flask con un millilitro di tripsina e quindi rimuoverla.Quindi aggiungere un altro millilitro di tripsina. Agitare il matraccio per circa 30-60 secondi per assicurarsi che l'enzima entri in contatto con tutta la superficie inferiore del matraccio prima di rimuoverlo. Una volta che le cellule sono state staccate con la tripsina, aggiungere al matraccio DMEM fresco con il 10 percento di siero bovino normale (NCS) per arrestare la reazione della tripsina.Trasferire la soluzione cellulare risultante dal pallone a un tubo conico da 50 millilitri pulito e etichettato. Quindi aggiungere un millilitro di DMEM fresco più il 10 percento di NCS a ciascuna piastra da preparare. Successivamente, capovolgere delicatamente il tubo contenente la soluzione cellulare più volte per rompere qualsiasi pellet che potrebbe essersi formato.Introdurre con pipetta il volume desiderato di soluzione cellulare delicatamente mescolata in ciascuna piastra. Successivamente, agitare accuratamente ogni piastra in senso orario o antiorario per garantire una distribuzione uniforme delle cellule sulla superficie di vetro sul fondo. È necessario aggiungere un numero sufficiente di cellule alla piastra per assicurare che raggiungano un grado di confluenza adeguato nelle successive 48 ore, necessario per un'efficace acquisizione di immagini.Dopo l'aggiunta del mezzo e della soluzione cellulare in ogni piastra, incubare le piastre a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica per almeno un'ora per consentire alle cellule di attaccarsi correttamente al fondo in vetro. Controllare le piastre al microscopio a intervalli di quindici minuti finché le cellule non risultano chiaramente attaccate. Successivamente, recuperare l'aliquota di Adenavirus D uno SR dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e trasportarla nell'armadio di sicurezza biologica utilizzando un bagno di ghiaccio mobile.Pipettare la dose desiderata di D one SR freddo in ogni piastra e incubare le cellule infette a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, rinnovare il mezzo aggiungendo un millilitro di DMEM fresco con il dieci percento di NCS. Successivamente, incubare le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica durante la notte.Dopo un'incubazione notturna, rimuovere il mezzo di coltura dalla piastra. Lavare la piastra di coltura con un millilitro di tampone fisiologico HEPES-PSS caldo per tre volte. Successivamente, aggiungere immediatamente un millilitro di tampone HEPES-PSS caldo e fresco prima della registrazione.Eseguire l'acquisizione iniziale mediante l'applicazione FRET SE aprendo il software associato al microscopio confocale. Una volta aperta l'applicazione, fare clic sulla scheda impostazione per regolare le condizioni sperimentali desiderate. Modificare manualmente le impostazioni dei canali in modo che le cellule vengano eccitate in sequenza a 440 nanometri per il donatore e per il FRET e a 513 nanometri per l'accettore.Impostare quindi le lunghezze d'onda di emissione a 488 nanometri per il donatore e a 535 nanometri per il FRET e l'accettore. Successivamente, impostare l'intensità della luce al 15 percento di trasmissione con un tempo di eccitazione di 150 millisecondi per le cellule e intervalli di 10 secondi tra un'esposizione e l'altra. Successivamente, stabilizzare la piastra sul palchetto del microscopio.Utilizzare il pulsante live per verificare la risoluzione dell'immagine. Regolare ulteriormente le impostazioni per ottenere la risoluzione desiderata. Nella scheda setup, acquisire un'immagine del campione utilizzando il pulsante cattura immagine.Ora passando alla scheda di valutazione, scegliere il metodo appropriato per calcolare le efficienze FRET per gli esperimenti in corso. Si raccomanda il metodo tre, che utilizza il calcolo raziometrico, per esperimenti che coinvolgono Cameleons come l'indicatore D one SR. Successivamente, passare alla scheda grafico per osservare i valori di intensità registrati in un grafico.Se lo si desidera, disegnare un'area di interesse (ROI) nel visualizzatore di immagini per osservare l'intensità media corrispondente di questa zona sul grafico. Iniziare la registrazione per raccogliere i dati per almeno tre minuti, al fine di garantire un segnale di base stabile prima di introdurre l'agente di interesse. Successivamente, introdurre un agente mobilizzante del calcio come strumento per esaurire il calcio del reticolo sarcoplasmatico, applicandolo direttamente nella piastra vicino alla regione di interesse in registrazione.Continuare la registrazione per la durata desiderata dopo il trattamento. Successivamente, acquisire le immagini seriali raziometriche FRET mediante un microscopio confocale invertito utilizzando l'applicazione FRET SE. In questo passaggio, per preparare le piastre di coltura di cellule muscolari lisce aortiche di ratto, lavare la piastra di coltura con un millilitro di tampone fisiologico HEPES-PSS tiepido per tre volte.Quindi, mescolare l'indicatore con un millilitro di HEPES-PSS tiepido e aggiungerlo sulle piastre di coltura. Incubare le cellule muscolari lisce con l'indicatore per un'ora a temperatura ambiente. Trascorsa un'ora, rimuovere l'indicatore dalla piastra di coltura e lavare con un millilitro di tampone fisiologico HEPES-PSS tiepido per tre volte.Quindi, aggiungere immediatamente prima della registrazione un millilitro di tampone HEPES-PSS fresco e caldo. Acquisire immagini in serie mediante microscopio confocale invertito. Successivamente, introdurre l'agente mobilizzatore del calcio come strumento per esaurire il calcio del reticolo sarcoplasmatico e continuare la registrazione per il tempo desiderato dopo il trattamento.Qui sono mostrati gli istantanee rappresentativi di una cellula muscolare liscia trasfettata con l'indicatore D one SR utilizzando filtri a banda passante CFP, FRET e YFP. Questa figura mostra gli istantanee in pseudocolore in tempo reale di cellule muscolari lisce aortiche di ratto in coltura, trasfettate con D one SR. Il trattamento con due micromolar di Thapsigargin ha mostrato una diminuzione dell'intensità del segnale, indicante una significativa riduzione del contenuto di calcio nel reticolo sarcoplasmatico dovuta al rilascio di calcio indotto da Thapsigargin. E questo grafico mostra la traccia rappresentativa del rapporto normalizzato di D one SR nelle cellule muscolari lisce in coltura trattate con due micromolar di Thapsigargin, che conferma una significativa diminuzione del calcio nel reticolo sarcoplasmatico.Di seguito sono mostrate immagini rappresentative di cellule muscolari lisce aortiche di ratto in coltura, caricate con un indicatore citoplasmatico del calcio e trattate con due micromolari di tapsigargina. Come mostrato, la tapsigargina provoca un significativo aumento dell'intensità del segnale all'interno del citoplasma, dovuto al rilascio di calcio dal reticolo sarcoplasmatico. Questo grafico mostra un tracciato rappresentativo del rapporto normalizzato di Fluo quattro AM nelle cellule muscolari lisce in coltura trattate con due micromolari di tapsigargina. L'aumento del segnale di calcio rappresentato è considerato proporzionale alla quantità di calcio rilasciata dal reticolo sarcoplasmatico. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in circa 48 ore, dalla preparazione alla conclusione, se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante mantenere le cellule nelle condizioni descritte per garantire la loro vitalità prima della trasfezione con l'indicatore di calcio. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come preparare cellule in coltura per consentire la misurazione dei livelli di calcio nel reticolo sarcoplasmatico utilizzando l'indicatore D one SR.

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Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

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Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

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Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell&#39;entrata del calcio a livello di deposito

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Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

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Misura di fluttuazioni calcio allinterno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale (Video) | JoVE Journal

Misura di fluttuazioni calcio all'interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

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