Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di manipolare l'impatto degli input sinaptici dell'elaborazione neuronale utilizzando iniezioni di microiontoforesi di sostanze neuroattive in animali svegli. Questo metodo può aiutare a districare le funzionalità chiave utilizzando sistemi sensoriali come il ruolo dei neurotrasmettitori e la loro interazione sugli stimoli sensoriali e sulla codifica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la manipolazione degli input sinatici locali alla scheda e lo studio dei sistemi modulatori neuronali senza essere influenzati dall'anestesia.

Sebbene questo prodigo fosse qui nei topi trattenuti, può essere utilizzato anche in altri mammiferi come pipistrelli, ratti o porcellini d'India. Per iniziare questa procedura, posizionare i fili di tungsteno in uno strumento di allineamento personalizzato per il taglio. Fissare con cura le estremità libere dei fili con del nastro adesivo e tagliarle alla lunghezza desiderata.

Quindi, tirare delicatamente il nastro per rimuovere i fili di tungsteno dallo strumento di allineamento. Assicurarsi che tutti i fili rimangano attaccati al nastro. Quindi, arrotolare il nastro su un perno di ottone lucido e tenere saldamente i fili contro il mandrino in modo che ci sia un buon collegamento elettrico.

Successivamente, collegare il mandrino a un motore a 5 giri/min nella stazione di lavoro. L'accesso al mandrino è angolato di 45 gradi rispetto alla superficie della soluzione di mordenzatura. Successivamente, immergere un terzo dei fili nella soluzione.

Quindi, immergere un elettrodo a barra di carbonio nel bagno di incisione per chiudere il circuito. Accendere la stazione di lavoro in modo che il mandrino inizi a ruotare, quindi regolare la corrente che passa attraverso gli elettrodi e la soluzione di mordenzatura a 250 milliampere. Interrompere l'incisione della punta quando la corrente scende a 200 milliampere per incidere le punte del filo in punti molto sottili.

Ora, posiziona un filo in un capillare di vetro borosilicato con l'estremità inferiore bloccata con l'argilla da modellare. Tenere la pipetta utilizzando una serpentina di riscaldamento e uno stantuffo sospeso. Fissare il filo coperto di vetro a un vetrino prima di metterlo sotto il microscopio.

Metti a fuoco la punta e tocca la perlina borica. Quindi scaldare la perlina fino a quando non si scioglie leggermente. Successivamente, inserire circa 10-15 micron della punta del filo e spegnere i potenziometri di riscaldamento.

Quando il cordone si raffredda, rimuovere il vetro dalla punta dell'elettrodo per esporre il tungsteno. Per ottenere una punta di circa 15 millimetri, impostare la polare sui parametri appropriati. Tirare il capillare per ottenere due pipette con il puntale isolato.

Monta una pipetta ad asta su un vetrino usando l'argilla da modellare e rompi la punta usando forbici sottili, pinze o il lato piatto di un bisturi. Regolare leggermente l'angolo tra l'elettrodo e il multi-cilindro per ottenere un migliore legame e un insieme più sottile. Al microscopio, allineare con cura l'elettrodo di tungsteno sulla punta multi-barrel.

Una volta allineato, abbassare l'elettrodo fino a quando non tocca il multi-cilindro. Inserendo la scanalatura tra i due cilindri superiori, far scorrere la punta dell'elettrodo fino a quando non sporge di 15-20 micrometri dalla punta del multicilindro. Ora applica una piccola goccia di adesivo fotopolimerizzabile sul tungsteno e sull'insieme multi-barilotto a circa 5 millimetri di distanza dalle loro punte.

Evita che la colla raggiunga le punte per evitare di bloccare i canali multi-barile e polimerizza la colla usando una lampada a LED a luce blu Ora, posiziona l'animale anestetizzato su una coperta riscaldante per mantenere la sua temperatura a 38 gradi Celsius e stabilizzare la testa dell'animale in una cornice stereotassica con due barre auricolari e una barra per morso, quindi applicare il gel oftalmico per proteggere gli occhi. Successivamente, radere il cuoio capelluto e applicare lo iodio povidone per disinfettare la pelle. Utilizzando un bisturi, praticare un'incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritrarre il perastium che copre la parte peridale e la parte più rostrale delle ossa occipitali.

Quindi, applica un sottile strato di adesivo fotopolimerizzabile sul cranio e sulla base del palo della testa. Attendi 10 secondi e posiziona il palo della testa sopra l'area rostrale delle ossa parietali lungo la linea mediana. Utilizzare una fonte di luce blu per polimerizzare l'adesivo per 20 secondi per un'efficace forza di adesione.

Successivamente, praticare due fori attorno e dietro la base del palo della testata utilizzando una piccola punta da trapano. Posizionare una vite dell'orologio in un foro praticato che funga da punto di contatto aggiuntivo tra il teschio e il palco della testa. Fai un giro e mezzo per inserire le viti e prova con una pinza per assicurarti che non siano allentate.

Quindi, inserire la punta del filo di terra argentato nel terzo foro e assicurarsi che tocchi la dura. Applicare una piccola goccia di colla cianoacrilica resistente all'acqua per legare il filo al cranio. Successivamente, applicare un composito fotopolimerizzabile per rafforzare il legame del palo della testa con il cranio coprendo la base del palo della testa, la parte inferiore del filo d'argento e le viti.

Fare attenzione a non estendersi oltre la lambda per consentire l'accesso durante la registrazione e polimerizzare il composito utilizzando una sorgente di luce blu. Quindi, ritrarre il muscolo nella parte posteriore del collo vicino al suo inserimento sul cranio. Usando una piccola trefina, praticare una finestra rotonda appena sotto la sutura lambda e lateralmente alla linea mediana per esporre il collicolo inferiore.

In questa procedura, posizionare il corpo dell'animale in un sistema di ritenuta imbottito in schiuma su misura. Fissare il palo della testa a un supporto fissato al telaio stereotassico. Questo è un buon momento per dare all'animale una ricompensa liquida.

Quindi, copri il corpo dell'animale con una coperta di cotone e fissalo senza stringere usando un emicilindro di plastica e del nastro adesivo. Utilizzare una siringa con punta flessibile per riempire i fusti con i farmaci scelti. Utilizzando il micromanipolatore, posizionare l'elettrodo multi-barilotto sul suo supporto.

Quindi, posiziona un filo d'argento non codificato all'interno di ciascun barilotto in modo che un'estremità entri in contatto con la soluzione e l'altra estremità sia accessibile. Quindi collegare quelle estremità al dispositivo di microionoforesi. Successivamente, collegare il terminale positivo all'estremità dell'elettrodo di tungsteno e il terminale di terra al filo d'argento che entra in contatto con la dura.

Successivamente, spostare l'elettrodo multi-barilotto fino a quando la punta non tocca la superficie del cervello. Applicare soluzione fisiologica sterile calda per prevenire l'essiccazione del tessuto cerebrale. A quel punto, applicare la corrente di ritenzione per evitare perdite di farmaco dalla punta del cilindro durante la ricerca dell'attività di una singola unità.

Registrare l'attività neurale e l'applicazione ionoforetica della gabazina. Qui è mostrata l'area di risposta in frequenza di quattro neuroni registrati nel collicolo inferiore prima e durante l'iniezione microiontoforetica di gabazina. Le croci nere indicano che le frequenze scelte per essere presentate come suoni rari e ripetitivi.

Qui, sono gli istogrammi del tempo di peristimolo accumulati della risposta neurale a tutte le frequenze e intensità presentate per costruire l'area di risposta prima e durante l'iniezione di gabazina. Le barre nere indicano la durata del suono. Ecco i raster scalari della risposta al picco a una coppia di frequenze presentate come rare in rosso e stimoli ripetitivi in blu prima e durante l'applicazione della gabazina.

Lo sfondo ombreggiato indica la durata dello stimolo. Questi raster di punti mostrano le risposte quando le probabilità relative delle parafrequenze sono state invertite. Questo grafico mostra le risposte dei singoli neuroni a sette coppie di frequenze presentate come il suono raro e ripetitivo prima e durante l'applicazione della gabazina.

E questo grafico, mostra gli indici SSA della risposta neurale a suoni rari e ripetitivi misurati prima e durante l'applicazione della gabazina. Una volta padroneggiata, la procedura descritta consente la regolazione dei parametri specifici in base alla struttura neurale e al tipo di neurone di interesse. Quando si tenta di registrare gli animali con il poggiatesta, è fondamentale ricordare che i tempi di registrazione sono determinati e limitati dal livello di assuefazione dell'animale, ma un vantaggio importante è che è possibile eseguire più incisioni di registrazione sullo stesso animale per diversi giorni, riducendo al minimo il numero di animali utilizzati.

Eseguendo il microiontoforetico utilizzando elettrodi piggy back, è possibile combinare altre procedure, come le iniezioni di transistor neurali, al fine di rispondere a ulteriori domande, come la fonte degli input e il target di proiezione dei neuroni all'interno del sito di registrazione. Un problema critico quando si lavora con gli animali svegli è il loro benessere, quindi non superare mai la quantità di tempo di richiamo approvata nel protocollo e si prega di monitorare costantemente per verificare qualsiasi segno di disagio. In tal caso, è necessario interrompere immediatamente la registrazione.