Un metodo per identificare e isolare Airway-innervano neuroni sensoriali nei topi

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di etichettare e isolare i neuroni nodosi del nervo vago che innervano le vie aeree. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia periferica. Ad esempio, quali proprietà identificative possiedono i neuroni che innervano le vie aeree?

Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo robusto e ad alto rendimento per il targeting e l'isolamento di specifiche popolazioni neuronali. Dopo aver raccolto i gangli sensoriali, aspirare 500 microlitri di soluzione di dissociazione dei gangli da ciascun tubo, senza disturbare i gangli. Quindi, aggiungere un millilitro di PBS a ciascun campione e attendere che i gangli si depositino sul fondo delle provette.

Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere ai neuroni un millilitro di soluzione di dissociazione dei gangli integrata con enzima di digestione, seguito dall'aggiunta di 20 microlitri di Fast Blue al tubo di controllo positivo. Incubare le provette a 37 gradi Celsius per il tempo appropriato in base all'età dell'enzima di digestione. Agitare e muovere brevemente i tubi ogni 15 minuti, per assicurarsi che i gangli siano coperti dalla soluzione digestiva.

Mentre le cellule nervose vengono digerite, aggiungere lentamente e con attenzione 400 microlitri di soluzione di densità al 12% appena preparata su 400 microlitri di soluzione di densità al 28% in una provetta da 1,5 millilitri per campione. Dovrebbero essere visibili due strati distinti, uno più scuro dell'altro. Successivamente, etichettare le provette di raccolta da 1,5 millilitri per lo smistamento, tra cui una provetta Fast Blue positiva e una provetta Fast Blue negativa per campione di smistamento.

Al termine del periodo di digestione, scartare l'enzima di digestione e lavare i gangli due volte con un millilitro di PBS come appena dimostrato. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 200 microlitri di soluzione fresca per la dissociazione dei gangli in ogni tubo. Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri impostata su un volume di 100 microlitri, pipettare i gangli su e giù più volte per dissociare le cellule in una singola sospensione cellulare, facendo attenzione a evitare bolle.

Quando non sono visibili pezzi di tessuto intatti, tenendo saldamente in una mano un colino cellulare da 70 micron, pipettare la soluzione cellulare dissociata al centro del colino. Quindi lavare la provetta di dissociazione con 100 microlitri di soluzione di dissociazione dei gangli freschi per raccogliere eventuali cellule aggiuntive. Filtrare il lavaggio attraverso il filtro e utilizzare una nuova punta della pipetta per aspirare le cellule rimanenti contenenti la soluzione sul lato inferiore del filtro, aggiungendola alla sospensione cellulare.

Ora sovrapponi con cura tutti i 300 microlitri di cellule sopra il gradiente di densità precedentemente preparato. E raccogliere le cellule dei gangli mediante centrifugazione. Mentre le cellule girano, aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi appena preparato alla provetta di raccolta positiva Fast Blue e 600 microlitri di tampone di lisi alla provetta di raccolta negativa per garantire che il fluido della guaina di selezione non diluisca significativamente il tampone di lisi.

Al termine della centrifugazione, rimuovere con cura i 700 microlitri superiori di soluzione contenenti la maggior parte dei detriti cellulari. Quindi mescolare 700 microlitri di soluzione fresca di dissociazione dei gangli con le cellule rimanenti. Pellettare le celle mediante centrifugazione e scartare con cura il surnatante.

Quindi risospendere le cellule in 200-300 microlitri di soluzione di dissociazione dei gangli di smistamento con una pipetta da 1.000 microlitri impostata a 200 microlitri. E posizionare le celle sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per la cernita. Dopo aver purificato le cellule dei gangli mediante FACS, omogeneizzare i neuroni nel tampone di lisi per un minuto con vortex.

Successivamente, mescolare più volte le cellule con un volume di etanolo al 70% e trasferire fino a 700 microlitri di campione in una colonna di rotazione. Centrifugare la colonna per 15 secondi a 8.000 x g in una microcentrifuga ed eliminare il flusso. Quando l'intero campione è stato fatto passare attraverso la colonna di rotazione, estrarre l'RNA secondo i protocolli standard di purificazione dell'RNA.

Quindi utilizzare un sistema di elettroforesi microfluidica per testare la qualità dell'RNA secondo le specifiche del produttore. In questi grafici sono mostrati i controlli Fast Blue negativi e positivi utilizzati per impostare i gate di smistamento. Le cellule dissociate Fast Blue Labeled Nodose possono quindi essere classificate in popolazioni Fast Blue positive e Fast Blue negative.

L'efficienza di smistamento per questo metodo è compresa tra il 73 e l'85% con circa 1.500 o meno celle Fast Blue positive e quasi 60.000 Fast Blue negative raccolte in media. Come osservato per questo campione rappresentativo, i picchi 18S e 28S raggiunti dall'elettroforesi microfluidica possono quindi essere utilizzati per calcolare il numero di integrità dell'RNA per determinare la qualità dell'RNA estratto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore e mezza se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di passare rapidamente attraverso i passaggi e di utilizzare soluzioni appena preparate per l'estrazione dell'RNA. Seguendo questa procedura, altri metodi come la coltura neuronale possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali proprietà funzionali sono uniche per i neuroni che innervano le vie aeree? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia periferica per esplorare le proprietà uniche di una specifica popolazione di neuroni che innervano le vie aeree nei gangli nodossi del nervo vago.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e dissociare neuroni specifici dei gangli nodosi che possono poi essere utilizzati per il sequenziamento dell'RNA o piastrati per studi funzionali. Non dimenticare che lavorare con il 2-mercaptoetanolo può essere estremamente pericoloso e che quando si utilizza questo composto dovrebbero sempre essere prese precauzioni come indossare guanti e lavorare in una cappa chimica.