Name: Un metodo per identificare e isolare Airway-innervano neuroni sensoriali nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Scopri un metodo per identificare e isolare i neuroni nodosi che innervano le vie aeree nei topi. Questa tecnica consente l'estrazione di RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica.

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Supportato da NIH concedere R01HL105635 a SEJ. Gli autori desiderano ringraziare Diego V. Bohórquez consulenza tecnica. Ringraziamo anche R. Ian Cumming per l&#39;assistenza tecnica e l&#39;esecuzione della citometria a flusso al Duke Vaccine umana Research Institute citometria a flusso Shared Resource Facility (Durham, NC). La citometria a flusso è stato eseguito nel Laboratorio biocontenimento regionale presso la Duke, che ha ricevuto il supporto parziale per la costruzione dal National Institutes of Health, National Institute of Allergy e Malattie infettive (UC6-AI058607).

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della Duke University. 1. intranasale Amministrazione di Fast Blue Per Fast Blue, amministrare il colorante almeno 2 giorni prima eutanasia il mouse. Il colorante persisterà fino a otto settimane. <ol><li> Anestetizzare il mouse con l&#39;anestesia per inalazione di luce (2,5% sevoflurano) fino a quando inizia a rallentare la respirazione. </li><li> Utilizzare una pipetta 200 ml con punte filtrati per infondere lentamente 40 ml di soluzione colorante (0.4 mm Fast Blue, 1% dimetilsolfossido, saline DMSO, in tampone fosfato, PBS) nella narice, fermandosi di tanto in tanto per garantire il mouse è aspirando la soluzione (Figura 1A). </li><li> Tenere il mouse verticalmente, testa alta, e massaggiare delicatamente il petto per garantire il colorante si diffonde in tutto i polmoni. </li></ol> 2. Preparati sulla dissezione e analisi Giorno <ol><li> Preparare 10 ml0; gangli dissociazione Solution (GADS) mediante la combinazione di ingredienti come specificato nella tabella 1. </li><li> Eseguire l&#39;estrazione di RNA in una zona laboratorio dedicato. Prima di iniziare l&#39;esperimento, superfici pulite con etanolo al 70%, 10% di candeggina, e RNasi reagente decontaminazione. Questo include la centrifuga RNA, eventuali portaprovette e pipette. Assicurarsi che ci sono scatole di punta filtro dedicato per solo uso di RNA. Non utilizzare questa apparecchiatura e l&#39;area per la preparazione del DNA, in modo da contaminare i campioni. </li><li> Mescolare fresco 70%, e l&#39;80% di etanolo con acqua RNase-free. Preparare 1 ml per campione da utilizzare per l&#39;estrazione di RNA. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Avanzate DMEM / F12 </td><td> 9,5 ml </td></tr><tr><td> glutammina </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td> supplemento N2 </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td> B27 (senza vitamina A) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> NGF (50 ug / ml) </td><td> 10 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Miscela reagente per gangli dissociazione Solution (GADS). 3. Procedura Dissection <ol><li> Riempire provette da 1,5 ml con 500 microlitri GADS, uno per ciascun campione sperimentale, uno per un controllo di smistamento positivo, ed uno per un controllo di smistamento negativo. conservare le provette su ghiaccio durante la dissezione. </li><li> Sezionare il ganglio nodoso e fare due tagli parziali per facilitare la dissociazione, poi metterlo nel tubo campione sperimentale. Si prega di fare riferimento al seguente protocollo di Giove per la dissezione dei gangli nodose 16 e 17 DRG. </li><li> Sezionare e parzialmente tagliato gangli-etichettato, come il gangli spinali (DRG), per i controlli di ordinamento. Utilizzare due gangli per il controllo positivo e due gangliuna per il controllo negativo. </li><li> Per ottenere neuroni nodose sufficienti per l&#39;ordinamento di successo, unire gangli da 5 topi in un tubo campione sperimentale contenenti GADS. </li></ol> 4. sensoriale gangli Dissociazione <ol><li> Pipetta fuori 500 GADS microlitri, lasciando gangli nel tubo. Lavare gangli volta aggiungendo 1 ml di PBS, attendere gangli di depositarsi sul fondo del tubo, poi pipetta su PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml GADS e 22 pl di digestione enzimatica (collagenasi I / II e mix proteasi, 2,5 mg / ml in H 2 O) ad ogni provetta. </li><li> Aggiungere 20 ml Fast Blue (5,26 mm) per la provetta di controllo positivo. </li><li> Mettere le provette a bagnomaria o riscaldamento blocco già a 37 ° C. Nota: Il tempo di digestione gangli dipende dall&#39;età della digestione enzimatica. Entro 1 mese di dissolvere l&#39;enzima digestione, digerire per 30 minuti, entro 2 - 6 mesi digerire per 45 min. Se l&#39;enzima è più di 6 mesi di età, digerire gangli fo 60 min. </li><li> Ogni 15 min tubi Agitare brevemente e flick loro per garantire gangli sono coperti dalla soluzione. </li><li> Mentre gangli vengono digeriti, preparare gradienti di densità utilizzando una soluzione di particelle (particelle di silice colloidale rivestite con polivinilpirrolidone). <ol><li> Mescolare soluzione particella% 12 in GADS, 500 microlitri per campione. </li><li> Mescolare soluzione particella% 28 in GADS, 500 microlitri per campione. </li><li> Lentamente e con attenzione aggiungere 400 microlitri soluzione di densità 12% sulla sommità della soluzione densità 400 microlitri 28% in una provetta da 1,5 ml fresco per ciascun campione. Non permettere che i due strati per mescolare. Due strati distinti devono essere visibili nel tubo; uno più scura dell&#39;altra. </li></ol></li><li> Mentre gangli vengono digeriti, etichettare nuovi tubi da 1,5 ml di raccolta per l&#39;ordinamento (un tubo Fast Blue positivo e uno negativo Fast Blue per campione di ordinamento). A seconda dei requisiti di smistamento impianto, questi tubi devono avere coperchi amovibili in modo da non interferireE Con ​​il cell sorter. </li><li> Dopo il tempo di digestione appropriata, rimuovere GADS con l&#39;enzima digestione e lavare gangli due volte con 1 ml di PBS. Aggiungere 200 ml di GADS freschi ad ogni provetta. </li><li> Utilizzare una pipetta 200 microlitri, impostato a 100 volumi microlitri, e pipetta gangli su e giù parecchie volte per rompere le cellule a parte. Ripetere l&#39;operazione fino a quando si vede nessun pezzo di tessuto intatto. Evitare di creare bolle nella soluzione. </li><li> Passare cellule dissociate attraverso un colino cella di 70 micron. </li><li> Aggiungere altri 100 microlitri GADS al tubo di dissociazione originale per raccogliere tutte le cellule rimanenti randagi a sinistra e passare la soluzione aggiuntiva attraverso il filtro delle cellule. Utilizzando un nuovo puntale, raccogliere qualsiasi liquido cellule contenenti residuo che è passata attraverso il filtro e aggrappato alla maglia. Il volume finale di cellule sospese in GADS è di 300 microlitri. </li><li> strato attentamente le 300 microlitri di cellule sulla parte superiore del gradiente di densità fatta in precedenza. Evitare di bolle e la miscelazione di cells con gli strati densità. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 2.900 xg a temperatura ambiente. </li><li> Mentre le cellule sono nella centrifuga, miscela tampone di lisi (1 ml per campione sperimentale) come segue: 10 microlitri 2-mercaptoetanolo in 1 ml Buffer RLT (dal kit di estrazione di RNA). <ol><li> Aggiungere 300 ml di tampone di lisi tubo di raccolta positivo Blu Veloce e 600 ml di tubo Fast Blue negativo di raccolta (tubi etichettati dal punto 4.7). Questo volume dipende dal numero di celle previste da raccogliere. Per &lt;2.000 cellule, aggiungere 300 ml, per&gt; 7.000 cellule aggiungono 600 ml. Ciò garantirà la selezione fluido di trasporto non diluire in modo significativo il tampone di lisi. </li></ol></li><li> Una volta che la centrifugazione, rimuovere con cautela ed eliminare lo strato superiore ml 700. Questo livello contiene la maggior parte dei detriti cellulari che altrimenti interferire con l&#39;ordinamento delle cellule. </li><li> Aggiungere 700 microlitri GADS freschi alla cella rimanente contenente soluzione e pipettaTE su e giù più volte per mescolare. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 2.900 xg per far sedimentare le cellule. </li><li> Mentre le cellule sono nella centrifuga, mescolare classificare GADS (500 microlitri per campione) aggiungendo 5 microlitri DNasi (10 mg / ml) per 1 ml GADS. </li><li> Una volta che la centrifugazione è fatto, rimuovere con attenzione e scartare il surnatante, lasciando il pellet. </li><li> Risospendere pellet cellulare in 200 - 300 ml di smistamento GADS pipettando su e giù con una pipetta 1000 ml impostata su 200 ml più volte. Mettere i campioni in ghiaccio. Le cellule sono ora pronti per essere ordinati. </li></ol> 5. fluorescenza cellulare attivato (FAC) Ordinamento Nota: questa sezione richiede la conoscenza operativa di un sorter FACS o l&#39;assistenza di personale specializzato. <ol><li> Aggiungere 1 ml soluzione madre ioduro di propidio (PI) (50 mg / ml) per ogni campione per verificare la vitalità cellulare. Split controllo negativo in 2 tubi, uno con e uno senza PI. PI lega il DNA solo nelle cellule morte. Sedopo le prime specie non ci sono le cellule morte per etichetta, non è necessario l&#39;uso di PI. </li><li> Cellule di trasporto di citometria a flusso strumento, ad es., BD FACS AriaII che esegue il software Diva 8, sul ghiaccio. </li><li> Poiché la dimensione della cella è variabile in questa popolazione, utilizzare un ugello grande (100 micron) per l&#39;ordinamento. Per ridurre la quantità di stress dell&#39;esperienza cellule e aumentare la vitalità cellulare utilizzare bassa pressione (20 psi). </li><li> Utilizzare il software selezionatrice FACS per impostare le trame analisi, scatter in avanti, lato scatter (SSC), Fast Blue, e PI, se necessario. </li><li> Per ri-sospendere le cellule, Agitare delicatamente brevemente il campione prima di caricarla nel sorter. </li><li> Iniziare con il controllo negativo, non Fast Blue o PI, per impostare la soglia di gate (Figura 2A). Questo determina la quantità di autofluorescenza nella popolazione di cellule. Opzionale: Eseguire l&#39;esempio negativo con PI per identificare se c&#39;è una popolazione di cellule morte. </li><li> Ordina il campione di controllo positivo (incubated con Fast Blu), per impostare i parametri di compensazione. </li><li> Una volta che i cancelli ed i parametri sono impostati, iniziare l&#39;ordinamento dei campioni sperimentali. I campioni vengono ordinati nei tubi di raccolta preparati contenenti tampone di lisi RNA. </li><li> I campioni ordinati in ghiaccio fino a quando l&#39;ordinamento delle cellule è completa. </li><li> Iniziare fase di estrazione di RNA subito dopo che le cellule sono ordinati. </li></ol> 6. RNA Estrazione <ol><li> Vortex cellule ordinati in tampone di lisi per 1 minuto per omogeneizzare. </li><li> Aggiungere 1 volume di etanolo al 70% e mescolare pipettando su e giù diverse volte. </li><li> Trasferire fino a 700 ml di campione in una colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flow-through. <ol><li> Ripetere finché il volume totale del campione attraverso la colonna di spin. </li></ol></li><li> Aggiungere 350 microlitri Buffer RW1 e continuare il processo di purificazione dell&#39;RNA, comprendente la fase di trattamento DNasi, secondo protoco del produttorel per le cellule. </li><li> Una volta RNA è stato estratto, per verificare la qualità RNA utilizzando un sistema di elettroforesi microfluidica secondo le specifiche del costruttore. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo per indirizzare i neuroni delle vie aeree, che innervano nei gangli nodoso del nervo vago. Una volta etichettato, i gangli vengono delicatamente dissociate per conservare in modo ottimale il numero di cellule e la vitalità. Questi neuroni sono poi FAC allineati direttamente nel tampone di lisi e RNA viene estratto. Il significato di questo protocollo è la possibilità di individuare, isolare e preservare la qualità di una specifica popolazione di cellule sensoriali. L&#39;espressione ...

nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi nervi afferenti si trovano nei gangli sensoriali, come la radice dorsale, trigemino, o gangli nodoso. Ogni ganglion sensoriale innerva regioni specifiche del corpo e contiene cellule che innervano organi e tessuti separati all&#39;interno di tale regione. Per esempio, i gangli delle radici dorsali (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere i processi in tutto il corpo e gli arti, mentre i gangli del trigemino si trova nel cranio, che contiene neuroni che innervano il viso, gli occhi, le meningi e vie aeree superiori 1, 2. Il gangli nodose del nervo vago è situata nel collo sotto il cranio e contiene corpi cellulari che si estendono fibre nervose in tutto il tratto gastrointestinale, cuore e basse vie aeree e dei polmoni 3. Nell&#39;uomo il ganglio nodoso sta da solo, tuttavia, nel topo è fusacon il ganglio giugulare, che innerva anche i polmoni 4. Questo ganglio fuso viene spesso chiamata la giugulare / nodoso complesso, ganglio vagale, o semplicemente nodoso ganglio 5. Qui, viene indicato come il ganglio nodoso. fibre afferenti del nodosi passano informazioni dai visceri al nucleo del tratto solitario (NTS) nel tronco cerebrale. Input sensoriale a questo ganglio unico controlla una gamma diversificata di funzioni, come la motilità intestinale 6, frequenza cardiaca 7, la respirazione 8,9, e le risposte respiratorie irritanti attivato 10,11. Con questa diversità di funzioni e organi innervati, è fondamentale per indirizzare e isolare sottopopolazioni organo-specifiche del ganglio nodoso al fine di studiare percorsi neuronali individuali. Tuttavia, date le dimensioni del nodose e il numero limitato di neuroni che contiene questo non è un compito banale. Ogni topo nodose ganglio contiene circa 5.000 neuroni 12oltre a una vasta popolazione di cellule di supporto satellite. Dei 5.000 neuroni nodose, solo 3-5% innervano le vie respiratorie. Pertanto, eventuali modifiche funzionali, morfologiche o molecolari all&#39;interno dei neuroni delle vie aeree-innervano, grazie alla stimolazione delle vie respiratorie o patologie, andranno perduti nel ganglio nodoso densamente. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un metodo per identificare e isolare i neuroni che innervano le vie respiratorie. Le vie aeree sono stati esposti a un colorante tracciante fluorescente per identificare le successive neuroni innervano nodoso. Fast Blue è stato preso dai neuroni e viaggia rapidamente alle loro corpi cellulari dove viene conservata per un massimo di otto settimane 13 - 15. Una volta identificato, un dolce, ma efficace, il protocollo di dissociazione è stato utilizzato per preservare l&#39;etichettatura tintura e la vitalità delle cellule per cellulare attivato fluorescente (FAC) di smistamento. Cellule separate vengono utilizzati per estrarre l&#39;acido ribonucleico di alta qualità (RNA) per determinare l&#39;espressione genica o Fo altra analisi molecolare valle. Questo protocollo fornisce una tecnica utile e robusto per isolare i neuroni sensoriali che innervano un tessuto di interesse.

<table><tbody><tr><td>Veloce Blu</td><td>Poliscienze, Inc.</td><td>17740-2</td><td>stock 2 mg/ml in acqua</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 rosso Nissle colorante</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS) Ca e Mg free</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>glutammina ( Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (senza vitamina A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>stock 50 &; g/ml in PBS/10% FBS</td></tr><tr><td>enzima di digestione, Liberase DH Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>stock 2,5 mg/ml in soluzione di particelle d'acqua</td></tr><tr><td>(Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &; filtro cellulare m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di RNasi</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di decontaminazione con RNasi, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione dell'RNA, RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Kit DNasi, senza RNasi DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNasi</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>stock 10 mg/ml in 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Propidio Ioduro</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>stock 10 &; g/ml in PBS</td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi microfluidica (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo per identificare e isolare airway-innervano neuroni sensoriali nei topi

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi neuroni afferenti si trovano all&#39;interno dei gangli sensoriali. gangli sensoriale innervano un organo specifico o porzione del corpo. Per esempio, i gangli della radice dorsale (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere processi in tutto il corpo e degli arti. I gangli del trigemino si trovano nel cranio e innervano la faccia, e le vie respiratorie superiori. afferenze vagali dei gangli nodose si estendono per tutto l&#39;intestino, cuore e polmoni. I neuroni nodose controllano una gamma diversificata di funzioni quali: frequenza respiratoria, irritazione delle vie respiratorie, tosse e riflessi. Così, per capire e manipolare la loro funzione, è fondamentale per identificare e isolare vie aeree specifiche sotto-popolazioni neuronali. Nel topo, le vie aeree sono esposti a un colorante tracciante fluorescente, Fast Blue, per il tracciamento retrograda di specifiche vie aeree nodose neuroneS. I gangli nodose sono dissociate e la fluorescenza delle cellule attivate (FAC) l&#39;ordinamento viene utilizzato per raccogliere le cellule positive colorante. Successivamente, l&#39;acido ribonucleico di alta qualità (RNA) viene estratto dalle cellule positive dye per la prossima generazione di sequenziamento. Utilizzando questo metodo vie aeree specifica espressione genica neuronale è determinata.

Utilizzando questo metodo, i neuroni delle vie respiratorie-innervano sono etichettati per via intranasale instillando Fast Blue (Figura 1A). Dopo due giorni, veloci cellule blu marcate appaiono nei gangli nodoso (Figura 1C). Queste cellule formano 3 - 5% della popolazione totale neuronale dei gangli nodose. Altri coloranti retrogrado che sono stati usati per questo scopo comprendono DII (1,1&#39;-diottadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-perclorato tetramethylind...

I neuroni sensoriali specifici per organo sono difficili da identificare. Il tracciamento Fast Blue viene utilizzato per identificare i neuroni nodosi che innervano le vie aeree per lo smistamento cellulare. I neuroni nodose ordinati vengono utilizzati per estrarre acido ribonucleico (RNA) di alta qualità per il sequenziamento. Utilizzando questo protocollo, viene determinata l'espressione genica dei neuroni specifici delle vie aeree.

Un metodo per identificare e isolare Airway-innervano neuroni sensoriali nei topi

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è etichettare e isolare i neuroni nodosi del nervo vago che innervano le vie aeree. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia periferica, ad esempio: quali proprietà identificative possiedono i neuroni che innervano le vie aeree?Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un metodo robusto e ad alto rendimento per indirizzare e isolare specifiche popolazioni neuronali. Dopo aver raccolto i gangli sensitivi, aspirare 500 microlitri di soluzione di dissociazione dei gangli da ogni tubo, senza disturbare i gangli. Successivamente, aggiungere un millilitro di PBS a ogni campione e attendere che i gangli si depositino sul fondo dei tubi.Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere un millilitro di soluzione di dissociazione dei gangli, integrata con enzima di digestione, ai neuroni, seguito dall'aggiunta di 20 microlitri di Fast Blue al tubo di controllo positivo. Incubare i tubi a 37 gradi Celsius per il tempo appropriato in base all'età dell'enzima di digestione. Agitare e scuotere brevemente i tubi ogni 15 minuti per assicurare che i gangli siano completamente ricoperti dalla soluzione di digestione.Mentre le cellule nervose vengono digerite, aggiungere lentamente e con attenzione 400 microlitri di soluzione al 12% di densità appena preparata su 400 microlitri di soluzione al 28% di densità in un tubo da 1,5 millilitro per campione. Dovrebbero essere visibili due strati distinti, uno più scuro dell'altro. Successivamente, etichettare i tubi da 1,5 millilitro per il sorting, includendo un tubo positivo per Fast Blue e un tubo negativo per Fast Blue per ogni campione da ordinare.Al termine del periodo di digestione, scartare l'enzima di digestione e lavare i gangli due volte con un millilitro di PBS come appena dimostrato. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 200 microlitri di soluzione fresca di dissociazione dei gangli in ogni provetta. Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri impostata su un volume di 100 microlitri, aspirare e dispensare i gangli su e giù per diverse volte per dissociare le cellule in una sospensione monocellulare, avendo cura di evitare la formazione di bolle.Quando non sono visibili frammenti di tessuto integro, tenendo saldamente in una mano un filtro cellulare da 70 micron, pipettare la soluzione cellulare dissociata al centro del filtro. Quindi lavare il tubo di dissociazione con 100 microlitri di soluzione fresca di dissociazione dei gangli per raccogliere eventuali cellule rimanenti. Filtrare il lavaggio attraverso il filtro e utilizzare una nuova punta di pipetta per aspirare qualsiasi soluzione residua contenente cellule presente sulla faccia inferiore del filtro, aggiungendola alla sospensione cellulare.Ora stratificare con attenzione tutti i 300 microlitri di cellule sulla parte superiore del gradiente di densità precedentemente preparato. Raccogliere le cellule gangliari mediante centrifugazione. Mentre le cellule sono in rotazione, aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi appena preparato al tubo di raccolta Fast Blue positivo e 600 microlitri di tampone di lisi al tubo di raccolta negativo, in modo da garantire che il fluido del fascio di ordinamento non diluisca in modo significativo il tampone di lisi.Al termine della centrifugazione, rimuovere con attenzione i 700 microlitri superiori di soluzione contenenti la maggior parte dei detriti cellulari. Quindi mescolare 700 microlitri di soluzione fresca di dissociazione dei gangli con le cellule rimanenti. Centrifugare per raccogliere le cellule in pellet e scartare con attenzione il sopranatante.Sospendere quindi le cellule in 200-300 microlitri di soluzione di dissociazione per il sorting dei gangli utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri impostata a 200 microlitri. Mantenere le cellule sul ghiaccio fino al momento del sorting. Dopo aver purificato le cellule gangliari mediante FACS, omogeneizzare i neuroni nel buffer di lisi per un minuto mediante vortexaggio.Successivamente, mescolare le cellule diverse volte con un volume di etanolo al 70% e trasferire fino a 700 microlitri del campione in una colonna da centrifuga. Centrifugare la colonna per 15 secondi a 8.000 x g in una microcentrifuga e scartare il flusso passante. Una volta che l'intero campione è passato attraverso la colonna da centrifuga, estrarre l'RNA seguendo protocolli standard di purificazione dell'RNA.Quindi utilizzare un sistema di elettroforesi microfluidico per verificare la qualità dell'RNA secondo le specifiche del produttore. In questi grafici, vengono mostrati i controlli negativi e positivi con Fast Blue utilizzati per impostare le porte di selezione. Le cellule del ganglio nodoso dissociate e marcate con Fast Blue possono quindi essere separate in popolazioni positive e negative al Fast Blue.L'efficienza di separazione per questo metodo è compresa tra il 73% e l'85%, con circa 1.500 o meno cellule positive al Fast Blue e quasi 60.000 cellule negative al Fast Blue raccolte in media. Come osservato per questo campione rappresentativo, i picchi dell'18S e del 28S ottenuti mediante elettroforesi microfluidica possono quindi essere utilizzati per calcolare il numero di integrità dell'RNA al fine di determinare la qualità dell'RNA estratto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore e mezza se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di procedere rapidamente attraverso i passaggi e di utilizzare soluzioni appena preparate per l'estrazione dell'RNA. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la coltura di neuroni, per rispondere a ulteriori domande, ad esempio quali proprietà funzionali sono uniche per i neuroni che innervano le vie aeree? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della Neurobiologia Periferica per esplorare le proprietà uniche di una specifica popolazione di neuroni, che innervano le vie aeree, nei gangli nodosi del nervo vago.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e dissociare specifici neuroni dei gangli nodosi, che possono poi essere utilizzati per il sequenziamento dell'RNA o seminati per studi funzionali. Non dimenticare che lavorare con il 2-mercaptoetanolo può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare guanti e lavorare sotto cappa chimica devono essere sempre adottate quando si utilizza questo composto.

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Questo video dimostra l'isolamento delle cellule dai gangli sensoriali dei topi. I gangli sono sottoposti a digestione enzimatica per sciogliere la matrice extracellulare. Le singole cellule vengono quindi raccolte mediante filtraggio attraverso un filtro a celle seguito da una centrifugazione in gradiente di densità per la rimozione dei detriti. Infine, vengono eseguiti il lavaggio e la centrifugazione per raccogliere le cellule isolate per analisi future.

Isolamento di cellule dai gangli sensoriali

Questo video mostra la registrazione elettrofisiologica dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) nei topi utilizzando una tecnica di patch-clamp perforata. L'epitelio olfattivo, contenente OSN con recettori degli odori marcati con fluorofori, viene isolato da un topo e fissato in una camera di registrazione. Una pipetta di registrazione è fissata alla manopola dendritica di un OSN e la nistatina all'interno della pipetta perfora la membrana per formare la connettività elettrica con la cellula.

Registrazione perforata con patch-clamp dei neuroni sensoriali olfattivi nei topi

Abbiamo sviluppato un metodo semplice, affidabile e relativamente poco costoso per l'intubazione endotracheale nei topi mediante laringoscopia diretta con un otoscopio con un speculum 2,0 millimetri. Questa tecnica è atraumatica e può essere utilizzato per misurazioni ripetute in esperimenti cronici. Troviamo superiore a tracheostomia o riportato in precedenza tecniche non chirurgiche.

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Presentiamo un protocollo chirurgico che descrive in dettaglio come eseguire un'assotomia di taglio o schiacciamento sul nervo facciale nel topo. L'assotomia del nervo facciale può essere impiegata per studiare la risposta fisiologica alla lesione nervosa e testare le tecniche terapeutiche.

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Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un metodo raffinato di intubazione del topo di laboratorio. Il metodo non è invasivo e, quindi, ideale per studi che richiedono il monitoraggio seriale della funzione respiratoria e/o l'instillazione di trattamenti nel polmone.

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Un metodo per identificare e isolare Airway-innervano neuroni sensoriali nei topi

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