Name: La raccolta selettiva di Marginating-epatiche leucociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Scopri il metodo di raccolta selettiva dei leucociti epatici marginanti mediante perfusione forzata da fegati di ratti o topi. Questa tecnica consente di isolare cellule immunitarie pure dai sinusoidi epatici per studiare le loro funzioni immunologiche uniche nelle malattie epatiche.

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Gli autori e questo lavoro sono stati supportati dalla sovvenzione NIH/NCI # R01CA172138 (a SBE).

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) a Tel-Aviv. 1. I ratti protocollo <ol><li> preparativi <ol><li> Preparare la soluzione eparinizzata PBS (30 unità / ml) da utilizzare a temperatura ambiente (RT) con l&#39;aggiunta di 30 unità di conservanti eparina libera per ml di tampone fosfato (PBS) 1x soluzione. Calcolare 35 ml per animale. </li><li> Passare eparinato PBS attraverso le linee di pompe peristaltiche e gli aghi a farfalla per eliminare le bolle d&#39;aria. </li><li> Sterilizzare strumenti chirurgici - 2 paia di forbici, pinze smussato taglio, 2 emostatiche, pinze e dente-tessuto (autoclave a 121 ° C per almeno 30 minuti su impostazione gravità (a secco)). </li></ol></li><li> Perfusione del fegato e raccolta di MH-leucociti <ol><li> Eutanasia l&#39;animale da una dose eccessiva di 8% isoflurano. Per precauzione, posizionare un tubo da 50 ml contenente una isofluranopad -soaked intorno alla testa ratto fino aprendo la sua cavità toracica. </li><li> Aprire le cavità peritoneale e al torace per esporre il fegato e il complesso cardiopolmonare immediatamente al momento della cessazione della respirazione. Evitare di sanguinamento attraverso questo processo. <ol><li> In particolare, avviare l&#39;incisione in corrispondenza del punto della linea mediana addominale inferiore, senza danneggiare gli organi interni, e di progresso per entrambe le parti in diagonale verso le costole, il taglio attraverso di loro a livello del torace cavità superiori. </li></ol></li><li> All&#39;interno di circa un minuto, raccogliere più sangue possibile (~ 6 ml da un animale 250 g) dal ventricolo destro in una siringa. </li><li> Fissare la vena cava caudale con una pinza emostatica il più vicino possibile al cuore, per consentire la raccolta del perfusato. </li><li> Estrarre l&#39;intestino e posto al di fuori l&#39;animale a destra dello sperimentatore, per esporre la vena porta. </li><li> Inserire un catetere 25 G IV, collegata ad una pompa peristaltica, nella vena porta, come caudali possibile,ma rostrale alla vena splenica. </li><li> Inserire un ago G 25 farfalla, collegato ad una siringa da 5 ml, nella vena cava inferiore, caudalmente alla hemostat. </li><li> Accendere la pompa peristaltica ad una velocità di circa 3 ml / min e raccogliere delicatamente i primi ml di perfusato che sono contaminati con il sangue nella siringa. Continuare fino a quando il colore perfusato è impallidisce rosso (circa 3-5 ml). Si noti che il colore del fegato cambia verso marrone chiaro. </li><li> Senza fermare la pompa peristaltica, sostituire la raccolta siringa da 5 ml con una siringa da 20 ml raccolta e raccogliere almeno 20 ml di perfusato fegato impiegando una maggiore velocità di perfusione (fino a 4 ml / min). Monitorare costantemente il flusso perfusato nella siringa di raccolta, e di evitare il vuoto che è troppo forte (che può ostruire l&#39;ago attraverso crollare le pareti vena cava). </li><li> Termina perfusione quando il colore del fegato si rivolge a marrone chiaro. </li></ol></li><li> I leucociti Estrazione <ol&gt; <li> Centrifugare il perfusato per 10 minuti a 400 xg, 24 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS, centrifugare a 400 xg per 10 minuti, e aspirare il surnatante. Sulla base di obiettivi di studio, usare la preparazione come è, o condurre purificazioni supplementari (ad esempio, la separazione in gradiente di densità). <ol><li> In particolare, lo strato 4 ml di perfusato oltre 4 ml di massa separazione in gradiente di densità in un 50 cc tubo di polipropilene centrifuga. Spin le provette a 754 xg, RT, per 30 minuti con la rottura off. </li><li> Ottenere gli strati mononucleari all&#39;interfaccia in gradiente di densità di separazione-surnatante pipettando manuale, lavare in PBS, e inserire in una provetta da 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Il protocollo del mouse <ol><li> preparativi <ol><li> Preparare la soluzione eparinizzata PBS (30 unità / ml) da utilizzare a temperatura ambiente (RT) con l&#39;aggiunta di 30 unità di conservanti eparina libera per ml di tampone fosfato (PBS) 1x solution. Calcolare 20 ml per animale. </li><li> Passare eparinato PBS attraverso le linee di pompe peristaltiche e gli aghi a farfalla per eliminare le bolle d&#39;aria. </li><li> Sterilizzare strumenti chirurgici - 2 paia di forbici, pinze smussato taglio, 2 emostatiche, pinze e dente-tessuto (autoclave a 121 ° C per almeno 30 minuti su impostazione gravità (a secco)). </li></ol></li><li> Perfusione del fegato e raccolta di MH-leucociti <ol><li> Eutanasia l&#39;animale da una dose eccessiva di 8% isoflurano. Per precauzione, posizionare un tubo da 15 ml contenente un tampone imbevuto isoflurano-intorno alla testa del mouse fino a quando aprendo la sua cavità toracica. </li><li> Fissare le membra del mouse per un letto. </li><li> Aprire le cavità peritoneale e al torace per esporre il fegato e il complesso cardiopolmonare immediatamente al momento della cessazione della respirazione, mantenendo l&#39;aspetto inferiore del diaframma intatto (per creare un pool di scarico cavità toracica). Evitare di sanguinamento attraverso questo processo. <ol><li> In particolare, iniziare l&#39;incisione al minorepunto addominale linea mediana, senza danneggiare gli organi interni, e di progresso per entrambe le parti in diagonale verso le costole, il taglio attraverso di loro a livello del torace cavità superiori. </li></ol></li><li> Ritiro l&#39;intestino e posto al di fuori l&#39;animale a destra dello sperimentatore, per esporre la vena porta. </li><li> Inserire un ago 30 g, collegata ad una pompa peristaltica nella vena rostrale alla vena splenica. </li><li> Tagliare la vena cava inferiore sopra il diaframma per permettere il drenaggio e la raccolta del perfusato dalla cavità toracica. </li><li> Accendere la pompa peristaltica ad una velocità di circa 3 ml / min e raccogliere delicatamente il primo 3 ml di perfusato che sono contaminati con il sangue dal pool cavità toracica. </li><li> Eliminare questo perfusato. Ripetere tale lavaggio di nuovo, se necessario, utilizzando soluzione fisiologica, e solo allora iniziare a raccogliere perfusato fegato. </li><li> Ri-avviare la perfusione ad una velocità fino a 4 ml / min, e raccogliere 10 ml di perfusato dalla cavità toracica utilizzandouna farfalla collegata ad una siringa. </li><li> Termina perfusione quando il colore del fegato si rivolge a marrone chiaro. </li></ol></li><li> I leucociti Estrazione <ol><li> Centrifugare il perfusato per 10 min a 400 x g. </li><li> Aspirare il surnatante. </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS, centrifugare a 400 xg per 10 minuti, e aspirare il surnatante Sulla base di obiettivi di studio, usare la preparazione come è, o condurre ulteriori purificazioni (ad esempio, la separazione in gradiente di densità). <ol><li> In particolare, lo strato ogni 4 ml di perfusato oltre 4 ml di massa separazione in gradiente di densità in un 50 cc tubo di polipropilene centrifuga. Spin le provette a 754 xg, RT, per 30 minuti con la rottura off. </li><li> Ottenere gli strati mononucleari all&#39;interfaccia in gradiente di densità di separazione-surnatante pipettando manuale, lavare in PBS, e inserire in una provetta da 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
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<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+mouse+liver-associated+natural+killer+activity+by+biologic+response+modifiers+occurs+largely+via+rapid+recruitment+of+large+granular+lymphocytes+from+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow.</a> J Immunol. 143, 372-378 (1989).</li>
<li>Schluter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastatic+tumor+cell+adhesion+and+extravasation+of+colon+carcinoma+cells+with+different+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential.</a> Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li>
<li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li>
<li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+phenotyping%2C+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li>
<li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+%28pit+cells%29+in+rat+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo di perfusione epatica presentato qui permette una raccolta selettiva e lo studio della popolazione unica di marginating leucociti epatici. NK cellule epatiche, anche chiamate cellule pit 3, costituiscono una popolazione di cellule NK distintivo che risiedono nei sinusoidi epatici. Si trovano in ratti, topi e negli esseri umani 17 18,19. Rispetto al isolate cellule NK periferico, cellule pit dimostrato superiore citotossicità contro YAC-1 e CC531s linee cellulari bersaglio ...

I sinusoidi epatici contengono numerosi sottotipi di leucociti di varie attività immunitarie critici per l&#39;organismo. linfociti Ad esempio, marginating epatica (MH) natural killer (NK), noto anche come celle fossa, sono caratterizzati morfologicamente come grandi granulari (LGLs) e funzionalmente come leucociti con capacità citotossica spontanea, consentendo epatica resistenza contro l&#39;istituzione di sangue- metastasi tumorali a carico. L&#39;obiettivo del metodo qui presentato è quello di consentire la raccolta selettiva dei leucociti MH, al fine di studiare questa popolazione cellulare importante ed unico (e vano immunitario), e per chiarire l&#39;impatto delle varie manipolazioni (ad esempio attivazione immunitaria) su queste cellule specifiche. Nonostante il fallimento di immunità per eliminare un tumore primario in via di sviluppo, prove in pazienti affetti da cancro e modelli animali indicano che il sistema immunitario in grado di controllare le cellule tumorali, micrometastasi e malattia residua throu circolantiGH immunità cellulo-mediata (CMI). Tuttavia, vi è una contraddizione apparente tra questi in capacità vivo e in vitro negli esseri umani e negli animali, che dimostrano che la maggior parte delle cellule tumorali autologhe sono resistenti alla citotossicità dai leucociti splenici 1,2 circolanti o. Questa incoerenza può essere attribuita, almeno in parte, l&#39;esistenza in vivo di una distinta sottopopolazione leucocitaria, cioè i (sinusoidi) leucociti marginating-epatico e la sottopopolazione di cellule NK attivate, ovvero cellule pit 3. Infatti, dati non pubblicati dal nostro laboratorio hanno indicato che nei ratti F344 cellule tumorali singenici (MADB106), che sono stati trovati resistenti alla circolazione e milza leucociti, sono stati lisati dalle cellule NK MH-4. Così, le cellule tumorali che sono presumibilmente &quot;NK-resistente&quot; leucociti circolanti possono essere comandate da cellule MH-NK. Degno di nota, nei topi l&#39;attività maggiore di MH-NK è evidente solo dopo in vivo immunitariostimolazione (ad esempio attraverso l&#39;uso di Poly I: C o CpG-C) 5. Le cellule NK-specific fegato (MH-NK) sono situati all&#39;interno del lume sinusoidali, aderendo alle cellule endoteliali e cellule di Kupffer. Cellule NK-MH sono caratterizzati esclusivamente da granuli densi sferici e vescicole asta animato 6, che contengono la fosfatasi acida come enzimi lisosomiali, e perforina e granzimi come sostanze bioattive 7,8. Rispetto alle cellule NK circolanti, cellule NK-MH presentano un maggior numero e le dimensioni dei granuli e vescicole 9-11. In condizioni infiammatorie, cellule NK-MH hanno dimostrato di esibire espressione maggiore di LFA-1 12, rispetto alle cellule NK circolanti. Questa espressione maggiore potrebbe costituire un meccanismo attraverso il quale le cellule NK-MH sono più citotossica nei confronti di alcune cellule tumorali rispetto alle cellule NK 13,14 circolanti. nterestingly, dopo incubazione in vitro con interleuchina (IL) -2, cellule NK-MH diventano allargata, eil loro numero e le dimensioni dei granuli aumentano, che sono tutti coerenti con un pro fi lo di assassino linfochine attivato cellule 15 (LAK). leucociti MH attivi non possono essere ottenuti esclusivamente attraverso i metodi di raccolta dei leucociti del fegato standard, che si basano sulla macinazione e degradazione biologica del tessuto. Il nostro approccio perfusione descritto ha due importanti vantaggi rispetto agli approcci standard. Innanzitutto, l&#39;approccio perfusione raccoglie selettivamente leucociti MH, prevenire la contaminazione da altri leucociti da altri compartimenti fegato. In secondo luogo, la tecnica di perfusione meglio preserva l&#39;integrità, l&#39;attività e l&#39;ambiente fisiologico dei leucociti MH, a differenza del trattamento tessuti approcci che danneggiano le cellule o alterare la loro morfologia, ea causa di danni ai tessuti, induce il rilascio di vari fattori che marcatamente modulano immunitario attività. Il fegato è un importante organo bersaglio per le metastasi del cancro unaND per varie infezioni 16. Come le cellule MH presentano caratteristiche uniche, è importante studiare questa specifica popolazione in varie condizioni rispetto a queste patologie. Ad esempio, è degno di nota che l&#39;attivazione immunitaria sistemica da vari BRM (ad esempio poli I: C o CpG-C) hanno dimostrato di attivare MH-leucociti più di leucociti 5 circolanti.

<table><tbody><tr>Pompa <td></td><td></td><td></td><td>peristaltica Autoclud</td></tr><tr><td>Ago a farfalla</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Ago a farfalla</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4"</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Pic soluzione</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Pic soluzione</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Pic soluzione</td><td></td> 5 <td>ml</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Soluzione Pic</td><td>10 ml</td>Siringa Soluzione Pic 25 ml Pinze smussate Emostatico a forbice Pinze per tessuti Lampada con lente d'ingrandimento fluorescente a luce diurna da 22 W <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la raccolta selettiva di marginating-epatiche leucociti

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

I leucociti marginanti-epatici (MH) (leucociti che aderiscono ai sinusoidi del fegato), hanno dimostrato di mostrare una composizione e caratteristiche uniche rispetto ai leucociti di altri compartimenti immunitari. In particolare, l'evidenza suggerisce un distinto profilo pro- e anti-infiammatorio della popolazione leucocitaria MH e una maggiore citotossicità delle cellule NK specifiche del fegato (vale a dire, cellule pit) rispetto agli immunociti circolanti o splenici sia nei topi che nei ratti. Il metodo qui presentato consente il prelievo selettivo di leucociti MH mediante perfusione forzata del fegato in topi e ratti. A differenza di altri metodi utilizzati per estrarre i leucociti del fegato, tra cui la macinazione dei tessuti e la degradazione biologica, questo metodo produce esclusivamente leucociti dai sinusoidi del fegato, non contaminati da cellule provenienti da altri compartimenti epatici. Inoltre, la tecnica di perfusione preserva meglio l'integrità e l'ambiente fisiologico dei leucociti MH, risparmiando le risposte fisiologiche note all'elaborazione tissutale. Poiché molte cellule maligne circolanti e cellule infette vengono trattenute mentre passano attraverso i sinusoidi epatici, interagendo fisicamente con le cellule endoteliali e i leucociti residenti, l'esclusiva popolazione di leucociti MH è posizionata strategicamente per interagire, identificare e reagire nei confronti delle cellule circolanti aberranti. Pertanto, il prelievo selettivo di leucociti MH e il loro studio in varie condizioni possono far progredire la nostra comprensione del significato biologico e clinico dei leucociti MH, in particolare per quanto riguarda le cellule aberranti circolanti e le malattie correlate al fegato e le metastasi tumorali.

Nei ratti F344 abbiamo confrontato la citotossicità delle cellule NK-MH (raccolti dai sinusoidi epatici di perfusione del fegato forzata) alla citotossicità di tutta la popolazione di cellule epatiche dopo macinazione meccanica del tessuto epatico, e la citotossicità dei leucociti circolanti. Tutte le preparazioni cellulari sono stati lavati almeno 3 volte, come di routine in saggi immunologici, e come linee cellulari obiettivo che abbiamo usato il le linee di cellule bersaglio MADB106 s...

I leucociti epatici marginanti mostrano caratteristiche uniche e funzioni immunologiche distinte rispetto ad altre popolazioni di leucociti. Qui descriviamo un metodo per il prelievo selettivo di questa specifica popolazione di cellule epatiche, attraverso la perfusione forzata del fegato di ratti o topi. I leucociti epatici marginanti sembrano fondamentali nel determinare la suscettibilità alle malattie e alle metastasi epatiche.

La raccolta selettiva di Marginating-epatiche leucociti

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere selettivamente i leucociti epatici marginanti, cellule immunitarie che aderiscono ai sinusoidi del fegato, mediante perfusione forzata da fegati di topo o ratto. Questo metodo consente lo studio dei leucociti epatici, che presentano caratteristiche uniche e funzioni immunologiche distinte rispetto ad altre popolazioni di leucociti. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce leucociti esclusivamente provenienti dal sinusoidi epatici, senza contaminazione da cellule di altri compartimenti epatici come il parenchima.La procedura sarà dimostrata da Liat Sorski e Lee Shaashua, due straordinarie studentesse laureate del mio laboratorio. Prima di iniziare la procedura di perfusione epatica, far scorrere PBS eparinizzato attraverso i tubi della pompa peristaltica e gli aghi butterfly per rimuovere eventuali bolle d'aria. Successivamente, immediatamente dopo la cessazione della respirazione, utilizzare forbici sterili e pinze da tessuto dentellate per praticare un'incisione addominale mediana a partire dal basso addome del ratto eutanasizzato fino al processo xifoideo, avendo cura di non danneggiare gli organi interni.Successivamente, utilizzare la pinzetta per sollevare lo sterno e tagliare con attenzione il diaframma e la gabbia toracica su entrambi i lati. Applicare un emostatico allo sterno e ripiegare la gabbia toracica in direzione rostrale per esporre il complesso cardio-polmonare. Preparare quindi un ago butterfly da 21 gauge collegato a una siringa da 10 millilitri ed inserirlo nel ventricolo destro del cuore.Successivamente, utilizzare la siringa da 10 millilitri per raccogliere la maggior quantità possibile di sangue. Una volta raccolto tutto il sangue, utilizzare un emostatico per clampare la vena cava caudale il più vicino possibile al cuore. Quindi, spostare gli intestini dalla cavità addominale verso il lato sinistro dell'animale per esporre la vena porta.Successivamente, preparare un catetere endovenoso da 25 gauge collegato al tubo di efflusso della pompa peristaltica e inserirlo nella vena porta il più caudalmente possibile, rimanendo comunque cranialmente rispetto alla vena splenica. Poi, preparare un ago a farfalla da 21 gauge collegato a una siringa da cinque millilitri ed inserirlo nella vena cava inferiore caudalmente rispetto all'emostatico. Accendere la pompa peristaltica ad una velocità di circa tre millilitri al minuto e raccogliere i primi millilitri di perfusato contaminati con sangue nella siringa.Posizionare la siringa da prelievo da cinque millilitri insieme alla siringa da prelievo da 20 millilitri senza fermare la pompa quando il perfusato assume un colore rosso pallido. Successivamente, raccogliere almeno 20 millilitri di perfusato epatico a una velocità di sette millilitri al minuto. Quando l'intero fegato diventa di colore marrone chiaro, terminare la perfusione.Quindi, centrifugare il perfusato e aspirare il soprannatante. Per raccogliere i leucociti epatici marginanti del topo, immediatamente dopo la cessazione della respirazione, utilizzare forbici sterili e pinze da tessuto per effettuare un'incisione mediana dell'addome fino al processo xifode. Successivamente, utilizzare le pinze per sollevare lo sterno e tagliare con attenzione il diaframma e la gabbia toracica su entrambi i lati.Applicare un emostatico allo sterno e piegare la gabbia toracica in direzione rostrale per esporre il complesso cardio-polmonare. Spostare gli intestini all'esterno della cavità addominale, verso sinistra rispetto all'animale, per esporre la vena porta. Successivamente, collegare un ago da 30 gauge a una pompa peristaltica e inserirlo nella vena porta in posizione rostrale rispetto alla vena splenica.Tagliare la vena cava inferiore al di sopra del diaframma per permettere lo scarico e la raccolta del perfusato dalla cavità toracica. Quindi, accendere la pompa peristaltica a una velocità di circa tre millilitri al minuto e raccogliere i primi millilitri di perfusato contaminati dal sangue accumulatosi nella cavità toracica. Una volta raccolti tre millilitri, spegnere la pompa.Quindi, dopo aver inserito un ago farfalla da 21 gauge collegato a una siringa da 10 millilitri, riprendere la perfusione a una velocità fino a quattro millilitri al minuto, fino a quando non vengono raccolti 10 millilitri di liquido di perfusione dalla cavità toracica. Quando il fegato diventa marrone chiaro, interrompere la perfusione. Successivamente, trasferire il liquido di perfusione in un tubo da 15 millilitri.Centrifugare il campione, quindi aspirare il soprannatante. Mentre le cellule NK epatiche marginanti mostrano una citotossicità profonda contro linee cellulari bersaglio allogeniche, l'intera popolazione cellulare epatica e i leucociti circolanti mostrano livelli notevolmente più bassi di citotossicità e quasi nessuna attività citotossica contro una linea cellulare bersaglio sinnogenica.Livelli relativi inferiori simili di citotossicità sono evidenti quando i fegati sottoposti a lavorazione meccanica vengono lavati e separati mediante gradiente di densità. L'analisi fattoriale di popolazioni leucocitarie specifiche rivela differenze profonde nella composizione delle popolazioni di cellule immunitarie provenienti dai compartimenti circolanti e da quello epatico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in pochi minuti se eseguita correttamente.Seguendo questa procedura, la cellula può essere utilizzata per la citometria a flusso, PCR o qualsiasi altro metodo per caratterizzare questa importante popolazione di leucociti. Questa tecnica consente il prelievo selettivo di leucociti epatici marginanti per approfondire la comprensione del significato biologico e clinico. In particolare, ci si aspetta di controllare le cellule aberranti circolanti e le malattie correlate al fegato.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere i leucociti epatici in marginatione.

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Immunologia e Infezioni

Un nuovo metodo per ottenere i macrofagi da colture primarie di cellule di fegato di ratto è descritto. Questo metodo utilizza la proliferazione dei macrofagi nella cultura, seguita da agitazione di palloni cultura e la purificazione di attaccamento selettivo ai piatti di plastica. Questa tecnica fornisce in modo efficiente i macrofagi del fegato, senza attrezzature complesse e competenze.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Questo video descrive un metodo per la separazione spaziale di tre sottopopolazioni di cellule leucemiche: le cellule leucemiche sospese che fluttuano liberamente nel terreno, le cellule leucemiche luminose di fase che hanno aderito alla superficie del monostrato di cellule stromali mesenchimali e le cellule leucemiche attenuate di fase che sono migrate sotto il monostrato di cellule stromali mesenchimali dalla co-coltura 2D.

Raccolta di sottopopolazioni leucemiche: un metodo per la separazione spaziale di sottopopolazioni di cellule leucemiche dalla co-coltura 2D

In questo video, dimostriamo l'isolamento dei leucociti epatici marginanti dal fegato di topo mediante perfusione forzata.

Isolamento di leucociti epatici marginanti da un fegato di topo

Questo video dimostra l'isolamento dei linfociti, comprese le cellule natural killer o cellule NK, dal tessuto epatico umano per un'espansione selettiva. La digestione enzimatica e meccanica, seguita dalla separazione in gradiente di densità, favorisce l'isolamento dei linfociti, comprese le cellule NK. I linfociti raccolti possono essere ulteriormente utilizzati per l'espansione selettiva delle cellule NK.

Isolamento di cellule Natural Killer dal tessuto epatico per l'espansione selettiva

Viene descritta una tecnica per isolare epatociti umani e cellule epatiche non parenchimali dallo stesso donatore. I diversi tipi di cellule epatiche costituiscono la base per i modelli funzionali di fegato e l'ingegneria tissutale. Questo nuovo metodo mira a isolare le cellule epatiche in un'elevata resa e vitalità.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

I leucociti polmonari marginanti mostrano caratteristiche uniche e funzioni immunologiche distinte rispetto ad altre popolazioni di leucociti. Qui descriviamo il prelievo selettivo di questa sottopopolazione di leucociti polmonari, mediante perfusione forzata dei polmoni in ratti e topi. I leucociti polmonari marginanti sembrano fondamentali nel determinare la suscettibilità alle malattie trasmesse per via ematica e polmonare.

La raccolta selettiva di Marginating-polmonari leucociti

lesioni al fegato sono accompagnate da espansione di cellule progenitrici che rappresenta una popolazione cellulare eterogenea. Classificazione Novel di questo compartimento cellulare consente di distintivo più sottoinsiemi. Il metodo qui descritto illustra l'analisi citofluorimetrica ed elevato isolamento purezza vari sottogruppi che possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

L&#39;isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare popolazioni di cellule endoteliali linfatiche all'interno del fegato usando gli indicatori descritti. Utilizziamo collagenasi IV e DNasi e una delicata macinazione del tessuto, combinato con citometria a flusso, per identificare una popolazione distinta di cellule endoteliali linfatiche.

Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Gli epatociti carichi di lipidi sono inerenti alla rigenerazione del fegato, ma di solito vengono persi con la centrifugazione a gradiente di densità. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento cellulare ottimizzato che mantiene gli epatociti steatosici, producendo popolazioni rappresentative di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi.

Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC), un tipo di cellula intracranica recentemente identificato, hanno funzioni poco conosciute. Questo studio presenta un protocollo riproducibile per la raccolta di LLEC dai topi e la creazione di colture primarie in vitro . Questo protocollo è progettato per consentire ai ricercatori di approfondire le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle LLEC.

Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

Scopri il metodo di raccolta selettiva dei leucociti epatici marginanti mediante perfusione forzata da fegati di ratti o topi. Questa tecnica consente di isolare cellule immunitarie pure dai sinusoidi epatici per studiare le loro funzioni immunologiche uniche nelle malattie epatiche.

La raccolta selettiva di Marginating-epatiche leucociti

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