Differenziazione dei atriale cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti utilizzando la BMP Antagonista Grem2

L'obiettivo generale di questo protocollo di differenziamento è quello di generare popolazioni omogenee di cardiomiociti atriali in coltura. Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio dello sviluppo cardiaco e delle malattie cardiache come l'aritmia atriale. I principali vantaggi di questa tecnica sono che produce colture omogenee di cardiomiociti atriali in vitro e che può essere eseguita con un allenamento minimo.

Fino a quattro giorni prima dell'allestimento delle colture di cellule staminali embrionali di topo, o mESC, codificare piastre di tessuto da 10 centimetri con 5 millilitri di soluzione di gelatina allo 0,2% ciascuna, in piastre a sei pozzetti con 1 millilitro di gelatina per pozzetto in una cappa di coltura tissutale sterilizzata. Il giorno della coltura, rimuovere la soluzione di gelatina in eccesso e aggiungere 10 millilitri di terreno in uno dei piatti da 10 centimetri ricoperti di gelatina. Quindi, utilizzare i criotoni per far roteare delicatamente una fiala da 1 volte 10 ai 6 mESC in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino a quando rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio al centro della fiala.

Asciugare la fiala con un panno monouso privo di lanugine e sterilizzarla con etanolo al 70%. Quindi posizionare la fiala nella cappa di coltura tissutale e utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere gli ESC al piatto. Posizionare le cellule in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e spostare delicatamente la piastra dalla parte anteriore a quella posteriore e da un lato all'altro per distribuire uniformemente le cellule.

Al termine dell'incubazione, utilizzare un microscopio a campo chiaro per confermare l'attacco delle cellule. Si osserveranno alcuni detriti e cellule morte. Sostituire il terreno con 10 millilitri di terreno mESC fresco e rimettere le cellule nell'incubatore.

Quando la coltura è confluente al 60-70%, sciacquare la piastra con 5 millilitri di DPBS sterile senza magnesio e calcio e incubare le cellule in 2 millilitri di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Mentre le cellule sono in incubazione, aspirare la soluzione di gelatina in eccesso da una nuova piastra da 10 centimetri per coltura passata e aggiungere 10 millilitri di terreno a ciascuna piastra. Quindi raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione in una provetta da 15 millilitri e risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno mESC.

A seconda del rapporto di divisione desiderato, aggiungere da 0,5 a 1 millilitro di sospensione cellulare a ciascuna piastra da 10 centimetri e rimettere le cellule nell'incubatore, distribuendo delicatamente le cellule in ciascuna piastra come appena dimostrato. Quando le cellule passate sono confluenti al 70%, staccarle con tripsina EDTA come appena dimostrato, quindi risospendere la sospensione a singola cellula in 5 millilitri di corpo embrioide o terreno EB. Contare le mESC e poi diluirle nel volume appropriato di terreno EB fino a una concentrazione finale di 2,5 volte 10 per la terza cellula per millilitro.

Successivamente, aggiungere 2 millilitri di PBS sul fondo di una capsula di Petri batterica sterile da 10 centimetri per coltura di gocce sospese e trasferire la sospensione di EB in una bacinella di soluzione sterile. A questo punto, rimuovere il coperchio da uno dei piatti preparati e utilizzare una pipetta multicanale, dotata di sei puntali, per depositare con cura 60 gocce da 20 microlitri di sospensione EB sulla superficie interna. Riposizionare delicatamente il coperchio sulla piastra, facendo attenzione a non rimuovere le gocce pendenti e posizionare le piastre nell'incubatore per colture cellulari per due giorni.

Per lavare gli EB, rimuovere con cautela il coperchio dalla coltura a goccia sospesa e inclinarlo con un angolo di 45 gradi. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica da 5 millilitri contenente un terreno EB a temperatura ambiente, lavare delicatamente gli EB in una pozza sul fondo del coperchio. Ispezionare attentamente il coperchio per verificare la presenza di EB attaccati alla superficie, quindi trasferire gli EB in una capsula di Petri di 6 centimetri non rivestita.

Riportare gli EB nell'incubatore di coltura tissutale per altri due giorni, controllando quotidianamente le piastre per verificare la presenza di aggregazione e attaccamento degli EB. Prima di galvanizzare gli EB, sostituire la soluzione di rivestimento in gelatina in eccesso in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti preparata, con 2 millilitri di terreno di trattamento Grem2 a temperatura ambiente appena preparato. Quindi utilizzare una pipetta P1000 impostata su 100 microlitri per trasferire 30 EB in ciascun pozzetto, quindi rimettere la piastra nell'incubatore per una notte, disperdendo uniformemente le cellule con un movimento delicato come dimostrato.

Dopo che gli EB si sono attaccati al fondo dei pozzetti, sostituire il terreno Grem2 ogni due giorni fino al giorno 10. Quindi, nutrire le cellule con terreno EB fresco ogni due giorni per mantenere una coltura cellulare sana. Prima della coltura a goccia sospesa, le cellule staminali pluripotenti devono essere compatte e prive di differenziazione spontanea.

Se si osserva una differenziazione spontanea, le cellule non devono essere utilizzate nelle colture a goccia sospese. L'EB di qualità si forma generalmente meglio all'interno di gocce pendenti equidistanti e ben arrotondate. Entro il secondo giorno di differenziazione, gli EB dovrebbero essere visibili ad occhio nudo, come disposizioni sferiche di cellule staminali differenzianti sulla punta delle gocce pendenti.

Al quarto giorno, gli EB ben formati dovrebbero essere fluttuanti e omogenei per dimensioni e forma. Una volta piastre, gli EB si appiattiscono mentre le cellule migrano fuori dall'EB sulla superficie della piastra di coltura tissutale, come osservato qui nei giorni di differenziazione otto e 10. Nei pozzetti di controllo non trattati, si osservano piccole chiazze che si contraggono lentamente già dal sesto giorno e fino al nono giorno.

Mentre nei pozzetti trattati con Grem2, sono comuni grandi chiazze con un tasso di contrazione relativamente veloce. L'analisi RT-QPCR dell'espressione genica nelle cellule differenziate rivela tipicamente alti livelli di geni strutturali e regolatori cardiaci nelle colture trattate con Grem2. Se viene utilizzata la linea cellulare di nuclei alfa-MHC DsRed, l'aumento della resa dei cardiomiociti si osserva come un numero maggiore di nuclei marcati con DsRed nei pozzetti trattati con Grem2.

Il trattamento con Grem2 distorce anche la differenziazione verso un fenotipo simile all'atriale, come confermato da RT-QPCR e misurazioni del patch clamp della durata del potenziale d'azione cellulare. Una volta padroneggiate, le cellule staminali differenzianti possono essere trattate con Grem2 in soli 60 minuti e le cellule beading vengono solitamente osservate già dal settimo giorno. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di aggiungere costantemente Grem2 al quarto giorno dopo il picco di espressione dei marcatori di gastrulazione come la brachiuria.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'elettrofisiologia e la QPCR per comprendere le caratteristiche funzionali e molecolari delle cellule che sono state generate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare cardiomiociti atriali da ESC di topo, usando Grem2.