Utilizzando una tecnica di laminazione per l'esecuzione di Microscopia confocale della sclera umana

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di eseguire la microscopia confocale della sclera umana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo oftalmico. Come la distribuzione delle cellule immunitarie e lo stato vascolare nei sani e le condizioni patologiche nella Sclera.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'imaging confocale del tessuto connettivo denso. A dimostrare la procedura sarà Stefan Kremers, uno studente laureato del nostro laboratorio. Per iniziare, prepara il 96% di etanolo e PBS in provette individuali.

Quindi preparare 100 micro-litri per campione degli anticorpi primari nella diluizione raccomandata di PBS contenente il due percento di BSA e mantenere tutte le soluzioni in ghiaccio. Disporre strumenti puliti, tra cui una o due pinze Colibri, forbici da microdissezione diritte, forbici curve, un bisturi numero 10 o una micro piuma per bisturi oftalmico, quattro aghi calibro 26 e un tampone. Avvolgi un foglio di alluminio attorno a una lastra di polistirolo o prepara una piastra di sughero per fissare il fazzoletto.

Dopo aver prodotto un bulbo aperto anteriormente secondo il protocollo di testo, posizionare la Sclera su un tampone con la parte aperta rivolta verso l'alto. Quindi usa una pinza colibrì per rimuovere la retina e gli strati uveali pigmentati dalla sclera interna fino a quando la sclera non è libera da questi strati. Quindi, se necessario, usa le forbici curve per rimuovere la retina e l'uvea dalla papilla.

Quindi rimuovere la congiuntiva rimanente, i muscoli extra-ovulari e la capsula dei tenoni dalla sclera superficiale. Ora usando la pinza colibrì per tenere delicatamente il tessuto, con le forbici diritte taglia campioni sclerali di circa due centimetri quadrati da diverse posizioni sul tessuto, evitando di afferrare ripetutamente con la pinza che renderanno l'area inadatta alla microscopia confocale. Posizionare i campioni in provette da 1,5 millilitri, aggiungere 1,5 millilitri di etanolo al 96% e incubare per 15 minuti per fissare il tessuto.

Quindi, dopo aver rimosso l'etanolo, utilizzare 1,5 millilitri di PBS per lavare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuno mentre si agitano. Successivamente, trasferire i campioni a 1,5 millilitri di PBS con il cinque percento di BSA e incubare a temperatura ambiente per due ore, il che indurrà il rigonfiamento dei campioni, per facilitare la laminazione e prevenire il legame non specifico. Quando i campioni si sono gonfiati, al microscopio stereo-binoculare utilizzare aghi da 26 gauge che sono stati piegati ai bordi per fissare i campioni sclerali posteriori alla membrana di polistirene avvolta in un foglio di alluminio o alla piastra di sughero.

Quindi, per laminare i campioni a tutto spessore, utilizzare una pinza colibrì per tenere orizzontalmente il bordo anteriore del tessuto sclerale. Con un bisturi numero 10, tagliare con cura uno strato il più sottile possibile di sclera superficiale, dallo strato sottostante. Per evitare che il fazzoletto si secchi, pipettare 50 microlitri di PBS sugli strati.

Quindi, dopo che gli strati sono stati tagliati, posizionarli in 100 microlitri di PBS in una piastra da 96 pozzetti e utilizzare un pennarello impermeabile per etichettare sia l'orientamento che lo strato. Continuare a isolare gli strati e trasferirli sulla piastra a 96 pozzetti fino a quando il tessuto non è completamente laminato. Per eseguire l'immunoistochimica, rimuovere il terreno dalla piastra a 96 pozzetti tenendo la pipetta contro la parete di ciascun pozzetto e aspirando il fluido.

Quindi aggiungere 100 micro-litri di anticorpi primari diluiti da uno a 100 in PBS con il 2% di BSA nei pozzetti appropriati e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare da 200 a 300 microlitri di PBS per lavare i campioni su un agitatore tre volte per cinque minuti ciascuno. Se necessario, utilizzare un altro anticorpo primario e incubare nuovamente per una notte a quattro gradi Celsius.

Quindi aggiungere 100 micro-litri degli anticorpi secondari corrispondenti, diluiti da uno a 300 in PBS con il due percento di siero di capra, e incubare al buio a temperatura ambiente per una o due ore. Dopo l'incubazione, utilizzare da 200 a 300 microlitri di PBS per risciacquare nuovamente i campioni sull'agitatore tre volte per cinque minuti ciascuna. Quindi aggiungere 100 micro-litri di una diluizione da uno a 2000 di DAPI in ciascun pozzetto e incubare al buio a temperatura ambiente.

Prima di utilizzare da 200 a 300 microlitri di PBS per lavare i campioni due volte. Trasferire i campioni sui vetrini del microscopio sotto il microscopio stereo-binoculare per assicurarsi che il campione sia appoggiato sul vetrino e aggiungere una o due gocce di terreno di montaggio fluorescente. Quindi posizionare un vetrino coprioggetti sopra e utilizzare lo smalto trasparente per sigillare i bordi.

Conservare al buio a quattro gradi Celsius per un uso successivo o esaminare direttamente al microscopio confocale. Per verificare lo spessore dei campioni, prelevare z-stack, poiché lo spessore differisce equatorialmente e posteriormente a seconda della posizione sclerale. Queste immagini mostrano la diversa rete del plesso dei vasi sanguigni nella sclera umana laminata derivata dall'episclera anteriore e posteriore.

I vasi sanguigni sono positivi per CD31 come mostrato in verde. In questa figura sono illustrate le cellule immunitarie LYVE1 positive dell'episclera e la loro relazione con i vasi sanguigni CD31 positivi. La serie z-stack è stata scattata con un ingrandimento di 10x per esaminare le relazioni tridimensionali dei vasi sanguigni e delle cellule immunitarie.

Come mostrato qui, i muscoli extra-oculari racchiusi all'interno della sclera possono anche essere analizzati per la presenza di vasi sanguigni o cellule immunitarie, utilizzando rispettivamente i marcatori CD31 e LYVE1. Una volta padroneggiata, la tecnica di laminazione può essere eseguita in meno di un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di evitare che il tessuto si secchi.

Non dimenticare che lavorare con i tessuti umani può essere potenzialmente infettivo e che è sempre necessario prendere precauzioni come la diagnostica microbiologica e virologica.