Name: Identificazione di MyoD Interattoma Utilizzando Tandem Affinity Purification accoppiato alla spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: Scopri l'identificazione dei partner proteici di MyoD mediante purificazione a doppia affinità e spettrometria di massa. Questo metodo consente di rivelare interazioni a bassa abbondanza nei compartimenti subnucleari.

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Il lavoro nel laboratorio di Ait-Si-Ali è stato sostenuto dall'Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot e il concorso "Chi sono io?" Laboratorio di Eccellenza #ANR-11- LABX-0071 finanziato dal governo francese attraverso il suo programma "Investimenti per il futuro" gestito dall'ANR nell'ambito della sovvenzione #ANR-11-IDEX-0005-01. EB è stato sostenuto da una sovvenzione INCa.

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo presentato consenta l&#39;identificazione esaustivo di partner di un fattore di trascrizione, MyoD. Ha rivelato partner MyoD in un sistema eterologo resistente alla differenziazione MyoD indotta, ovvero cellule HeLa-S3. Così, per definizione, i partner MyoD identificati sono ubiquitariamente espressi. Questi includono fattori generali e specifici di sequenza di trascrizione, enzimi cromatina modificanti, proteine ​​di elaborazione RNA, chinasi (Tabelle 1 e 2). Dato che le cell...

organismi pluricellulari eucarioti sono composti da diversi organi e tessuti. Ogni tessuto funzionale ha un pattern di espressione genica specifica, che è determinato ad ogni passo differenziazione. differenziazione cellulare coinvolge l&#39;attivazione di geni specifici, manutenzione della loro espressione e, in generale, il silenziamento di una serie di geni come quelli coinvolti nella proliferazione cellulare. Scheletrico differenziamento muscolare, o miogenesi, è quindi un processo a più fasi, che inizia con la determinazione delle cellule staminali mesodermiche in mioblasti, e poi porta alla differenziazione terminale di questi mioblasti in primo mono-nucleate, e quindi multi-nucleate, miotubi . Così, i mioblasti vengono &quot;determinate&quot; Le cellule, che sono ancora in grado di proliferare, ma si sono impegnati a lignaggio muscolo scheletrico, e quindi in grado di differenziarsi solo in cellule del muscolo scheletrico sia durante lo sviluppo embrionale o nella rigenerazione del muscolo adulto. Il processo di terminale muscolo scheletrico differireziazione è orchestrato da uno specifico programma genetico che inizia con l&#39;uscita permanente dal ciclo cellulare delle cellule precursori mioblasti che conduce ad un silenziamento definitiva di proliferazione associati geni, come E2F geni target 1. Infatti, durante il processo di differenziazione terminale, arresto mioblasti proliferazione è un passo cruciale che precede l&#39;espressione di geni specifici muscolo scheletrico e la fusione dei mioblasti in miotubi 2. Tale programma permette cellule staminali muscolari adulte, dette anche cellule satelliti, per differenziare durante il processo di rigenerazione dopo un trauma del muscolo scheletrico. Miogenesi mammiferi è criticamente dipendente da una famiglia di miogenico elica-ansa-elica (bHLH) fattori di trascrizione MyoD, Myf5, MRF4 e Myogenin, spesso indicato come la famiglia di fattori scheletrico determinazione muscolare o MRF (muscolo fattori normativi) 3. Ciascuno di essi ha un ruolo essenziale nella specifica e differenziazione delle cellule del muscolo scheletrico e ha uno specifico modello di espressione 4 5-7. L&#39;attivazione di Myf5 e MyoD costituisce il passo determinante che impegna le cellule al lignaggio miogenico, e la successiva espressione di Myogenin innesca miogenesi con l&#39;attivazione di geni specifici del muscolo scheletrico, come MCK (muscolo creatina chinasi). Myogenic fattori di trascrizione bHLH collaborano con i membri della famiglia MEF2 nel attivazione di geni muscolari da loci precedentemente silenziosa 8. Essi hanno inoltre stimolare scheletrico trascrizione genica muscolare eterodimeri con le proteine ​​onnipresente bHLH, E12 e E47, note come proteine ​​E, che legano i cosiddetti E-box in varie regioni del gene-normativo 8. Twist, Id (inibitore di differenziazione) e di altri fattori regolano negativamente questo processo, competendo con MyoD per le proteine ​​di legame E 8. MyoD è considerato come il giocatore importante nello scatenare muscolare terminale differenziazione 9 </sup&gt; poiché ha la capacità di indurre un programma determinazione miogenico / differenziazione (trans-differenziazione) in molti sistemi non-muscolari completamente differenziate 10-13. In effetti, l&#39;espressione forzata di MyoD induce la trans-differenziazione dei diversi tipi cellulari, anche quelli derivati ​​da un&#39;altra origine embryologic 12. Ad esempio, MyoD in grado di convertire gli epatociti, fibroblasti, melanociti, neuroblasti, e adipociti in cellule muscolari-like. L&#39;azione trans-differenziativo di MyoD comporta un&#39;attivazione anomala del programma genetico miogenico (in particolare i suoi geni bersaglio) in un ambiente non-muscolare, concomitante al silenziamento del programma genetico originale (in particolare, i geni della proliferazione). In proliferanti mioblasti, MyoD è espressa, ma non è in grado di attivare i suoi geni bersaglio anche quando si lega ai loro promotori 14-16. Pertanto, il requisito di MyoD siano continuamente espressi in mioblasti indifferenziati rimane abbastanza elusive. MyoD potrebbe reprimere i suoi geni bersaglio dovuto all&#39;assunzione di enzimi cromatina modificanti repressive in proliferanti mioblasti prima del carico di attivare il rimodellamento della cromatina enzimi 14,17. Per esempio, in proliferanti mioblasti, MyoD è associata a trascrizionale co-repressori KAP-1, istone deacetilasi (HDAC) e metiltransferasi lisina repressive (km in linea), tra cui l&#39;istone H3 lisina 9 o H3K9 e H3K27 km in linea, e sopprimere attivamente la sua espressione di geni bersaglio attraverso la definizione di un locale repressiva struttura della cromatina 14,17. È importante sottolineare che un recente rapporto ha indicato che MyoD è essa stessa direttamente metilato dalle H3K9 il KMT G9a con conseguente inibizione della sua attività transattivante 16. I meccanismi epigenetici coinvolti in questa trans-differenziazione delle cellule non muscolari di MyoD sono largamente sconosciuti. In particolare, alcune linee cellulari sono resistenti a MyoD indotta trans-differenziazione. Così, in cellule HeLa, MyoD è inattivo oaddirittura potrebbe funzionare come repressore piuttosto che attivatore della trascrizione a causa della mancanza di espressione della subunità BAF60C del rimodellamento della cromatina complesso SWI / SNF 18. Questo modello può quindi essere di scelta per caratterizzare meglio i meccanismi di MyoD indotta repressione gene. E &#39;adatto anche per saggiare la capacità di MyoD di indurre ambiente cromatina repressiva alla sua loci bersaglio con i suoi partner associati e quindi scoprire i meccanismi repressivi MyoD-dipendente della proliferazione mioblasti per mettere a punto la differenziazione terminale. Qui si descrive il protocollo per l&#39;identificazione dei partner MyoD utilizzando Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) accoppiata alla spettrometria di massa caratterizzazione (MS). L&#39;uso di cellule HeLa-S3 esprimono stabilmente Flag-HA-MyoD consentito di ottenere abbastanza materiale per purificare i complessi MyoD da estratti nucleari frazionati. L&#39;identificazione di partner MyoD nel sistema eterologo è seguito validation in un sistema di riferimento.

<table><tbody><tr><td>Linee cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td>Spinner Omogeneizzatore per 778531 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>:&nbsp; Omogeneizzatore a dounce&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 e 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di agitazione per spinner</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Marienfeld Superior&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>Provette a basso legame</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di centrifuga vuota</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-poliacrilammide 4-12%&nbsp; gel</td><td>Life technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x tampone di caricamento&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Agente riducente 10x</td><td>Life technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione dell'argento</td><td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti centrifughe, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Proteine G perline di agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G&nbsp; Resina</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Flag resin (gel di affinità anti-agarosio M2-Flag)</td><td>Resina Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA (agarosio monoclonale anti-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Flag free peptide (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Sintesi personalizzata</td><td>Risospensione fino a 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>peptide libero da HA (YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Sintesi personalizzata</td><td>Risospensione fino a 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine a base di acido bicinconinico : Kit BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Substrato HRP a chemiluminescenza potenziata (ECL) a base di luminol</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>DNA spermatico di salmone tosato (acido desossiribonucleico, sale sodico dai testicoli di salmone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Spermina tetracloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>Spermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS tampone di corsa</td><td>Life technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (alto glucosio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>Pre-riscaldamento&nbsp; a 37 gradi; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05% rosso fenolo</td> Life <td>technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Siero</td><td>GE sanità scienze della vita&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>Ogni lotto di siero deve essere prima testato per le cellule.</td></tr><tr><td>Penicillina e streptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Trypan Blue, 0,4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Acqua (filtrata sterile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA da ratto (12CA5)</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr><td>Flag</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>Da utilizzare per il western blotting</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>Da utilizzare per l'immunoprecipitazione e il western blotting</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG Topo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Coniglio</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-ratto -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di capra -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione di myod interattoma utilizzando tandem affinity purification accoppiato alla spettrometria di massa

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Scheletrico differenziazione terminale muscolare inizia con l&#39;impegno di cellule precursori mesodermiche pluripotenti a mioblasti. Queste cellule hanno ancora la capacità di proliferare o possono differenziarsi e si fondono in miotubi multinucleati, che maturare ulteriormente per formare fibre muscolari. Scheletrico differenziazione terminale muscolare è orchestrata con l&#39;azione coordinata di diversi fattori di trascrizione, in particolare i membri dei fattori regolatori muscolari o MRF (MyoD, Myogenin, Myf5, e MRF4), chiamato anche il miogena bHLH fattori di trascrizione della famiglia. Questi fattori cooperano con i complessi della cromatina-rimodellamento all&#39;interno della rete regolamentare trascrizionale elaborato per raggiungere miogenesi scheletrico. In questo, MyoD è considerato il maestro miogenico fattore di trascrizione nello scatenare differenziamento terminale muscolare. Questa nozione è rafforzata dalla capacità di MyoD convertire cellule non muscolari in cellule muscolari scheletriche. Qui si descrive un metodo utilizzato per identificare MyoDpartner proteici in modo esaustivo, al fine di chiarire i diversi fattori coinvolti nella scheletrico differenziazione terminale muscolare. L&#39;obiettivo a lungo termine è quello di comprendere i meccanismi epigenetici coinvolti nella regolazione dei geni muscolo scheletrico, vale a dire., Obiettivi MyoD. partner MyoD sono identificati utilizzando Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) da un sistema eterologo accoppiato alla caratterizzazione spettrometria di massa (MS), seguito dalla validazione del ruolo delle parti interessate durante scheletrico differenziamento terminale muscolare. forme aberranti di fattori miogenici, o la loro regolamentazione aberranti, sono associati con una serie di disturbi muscolari: miastenia congenita, distrofia miotonica, rabdomiosarcoma e difetti nella rigenerazione muscolare. Come tale, i fattori miogenici forniscono un pool di potenziali bersagli terapeutici nei disturbi muscolari, sia per quanto riguarda i meccanismi che causano la malattia stessa e meccanismi rigenerativi che possono migliorare il trattamento della malattia. Così, il understan dettagliatading delle interazioni intermolecolari ei programmi genetici controllate dai fattori miogenici è essenziale per la progettazione razionale di terapie efficaci.

Per comprendere la regolazione dell&#39;attività MyoD, abbiamo intrapreso la caratterizzazione esaustivo dei complessi MyoD utilizzando purificazione biochimica, basato sulla immunopurificazione di una forma doppia targhetta di MyoD seguita da spettrometria di massa (MS). L&#39;uso della linea di cellule HeLa-S3 esprime MyoD Flag-HA-tag e una linea cellulare di controllo che esprime permessi Flag-HA per ottenere abbastanza materiale per purificare il complesso MyoD eseguendo doppio affin...

MyoD è un fattore di trascrizione miogenico con una forte capacità di indurre la transdifferenziazione miogenica di molte linee cellulari non muscolari completamente differenziate. I meccanismi epigenetici coinvolti in questa transdifferenziazione sono in gran parte sconosciuti. Qui descriviamo un metodo di purificazione a doppia affinità seguito da spettrometria di massa per caratterizzare in modo esaustivo i partner MyoD.

Identificazione di MyoD Interattoma Utilizzando Tandem Affinity Purification accoppiato alla spettrometria di massa

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare in modo esaustivo i partner della proteina MyoD. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia del muscolo scheletrico, come la regolazione molecolare della deformazione tonale del muscolo scheletrico da parte del fattore chiave di trascrizione muscolare, MyoD. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di svelare i partner MyoD che hanno un'abbondanza elettivamente bassa, localizzata in uno specifico compartimento subnucleare.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione della differenziazione muscolare, può essere applicato anche ad altri sistemi, come qualsiasi altro tessuto, in particolare la differenziazione nucleare. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Lauriane Fritsch, assistente di ricerca del nostro laboratorio. In questo protocollo, i complessi MyoD saranno purificati da cellule HeLa S3 che esprimono stabilmente MyoD con tag gluteninici FLAG.Le cellule HeLa S3 trasdotte con il vettore vuoto saranno utilizzate come controllo. Entrambe le linee cellulari sono state precedentemente coltivate, raccolte e conservate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius, come descritto nel testo del protocollo. Scongelare rapidamente i pellet di cella in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.Tutti i tamponi e gli omogeneizzatori devono essere preraffreddati e l'intera procedura deve essere eseguita in una cella frigorifera. In genere, vengono utilizzati 20 grammi di cellule per ogni punto sperimentale, ma ai fini di questa dimostrazione, verranno elaborati solo 10 grammi, o circa 10 mL di cellule. Risospendere le cellule in 10 mL di tampone ipotonico A, utilizzando inizialmente 5 mL di tampone.Quindi, aggiungendo 2,5 ml, seguiti da altri 2,5 ml. Lavare bene la pipetta con un tampone fresco per ottenere il massimo delle cellule. Trasferire 20 mL della sospensione cellulare nell'omogeneizzatore preraffreddato con un pestello a tenuta ermetica.Omogeneizzare le cellule con 20 colpi. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 millilitri. Per il massimo recupero delle cellule, lavare l'omogeneizzatore con 3,5 ml di tampone di saccarosio.Trasferire rapidamente questa sospensione nella provetta da 50 mL per preservare i nuclei e limitare le perdite. Colorare un'aliquota da 30 microlitri della sospensione cellulare con 30 microlitri di blu di tripano al 4% e analizzare al microscopio per determinare l'efficienza della lisi. Tutti i nuclei dovrebbero essere blu se la lisi ha successo.Se necessario, ripetere l'omogeneizzazione. Centrifugare per sette minuti a 10.000 x g e quattro gradi Celsius per pellettare i nuclei. Conservare il surnatante come frazione citoplasmatica.Iniziare la procedura di preparazione della frazione estraibile del sale nucleare risospendendo il pellet di nuclei in 4 mL di tampone saccarosio. Quindi, aggiungere 4 mL di tampone ad alto contenuto di sale goccia a goccia mescolando accuratamente su un vortice per ottenere una concentrazione finale di 300 mM di cloruro di sodio. Incubare per 30 minuti su ghiaccio mescolando ogni cinque minuti.Quindi, ridurre la concentrazione di cloruro di sodio a 150 mM aggiungendo 8 mL di tampone saccarosio. Centrifugare per 10 minuti a 13.000 x g e quattro gradi Celsius. Raccogli il surnatante che è la frazione estraibile dal sale e lascialo in ghiaccio.Per preparare la frazione legata alla cromatina, risospendere meticolosamente il pellet in 3,5 mL di tampone saccarosio. Aggiungere il cloruro di calcio a una concentrazione finale di 1 mM e mescolare. Il cloruro di calcio attiverà la nucleasi micrococcica che verrà aggiunta in seguito.Preriscaldare la sospensione per un minuto a 37 gradi Celsius. Aggiungere 35 microlitri di un brodo di nucleasi micrococcica da 5 unità per microlitro per ottenere una concentrazione finale di 25 10 millesimi unità per microlitro. Incubare per esattamente 12 minuti a 37 gradi Celsius.Mescolare ogni quattro minuti. Dopo 12 minuti, posizionare immediatamente la reazione sul ghiaccio. Per arrestare l'attività della nucleasi micrococcica, aggiungere 56 microlitri di EDTA a 5 molari pH 8.0 a una concentrazione finale di 4 mM e vortex.Incubare per cinque minuti con ghiaccio. Sonicare cinque volte per un minuto ogni volta ad alta ampiezza consentendo una pausa di un minuto tra le sonicazioni. Centrifugare sia la frazione estraibile in sale che quella arricchita con nucleosoma per 30 minuti a 85.000 x g a quattro gradi Celsius.Raccogli i surnatanti. La frazione estraibile di sale dovrebbe essere di circa 13 ml. E la frazione arricchita di nucleasomi dovrebbe essere di circa 6 mL.I complessi proteici MyoD saranno purificati mediante purificazione a doppia affinità. Poiché le procedure per la purificazione basata su FLAG e per la purificazione basata su HA sono simili, verrà dimostrata solo la purificazione basata su FLAG. Dopo aver aggiunto TEGN, trasferire il volume appropriato di resina FLAG in una provetta da 50 mL.Per ogni punto sperimentale sono necessari 300 microlitri di resina FLAG proveniente dalla resina FLAG prewash commerciale al 50%. Centrifugare per due minuti a 1.000 x g. Rimuovere il surnatante, aggiungere TEGN freddo e centrifugare di nuovo.Lavare la resina FLAG con TEGN freddo per un totale di cinque volte. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere la resina FLAG in un volume uguale di TEGN. Per ogni punto sperimentale, mescolare 300 microlitri di resina FLAG lavata e l'estratto proteico corrispondente.Utilizzare una provetta da 15 mL per la frazione arricchita di nucleasomi e una provetta da 50 mL per la frazione estraibile dal sale. Incubare i tubi su una ruota rotante per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, centrifugare tutte le provette per due minuti a 1.000 x g a quattro gradi Celsius.Raccogliere i surnatanti e mantenerli a quattro gradi Celsius fino ad ottenere il risultato del test di efficienza di purificazione. Per i campioni estraibili con sale, risospendere la resina FLAG in 4 mL di TEGN e trasferirla in una provetta da 15 mL. Ripetere questo passaggio tre volte, trasferendo ogni volta negli stessi 15 ml per evitare di perdere le perle.Centrifugare per due minuti a 1.000 x g a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere 13 mL di TEGN alla resina FLAG e centrifugare per due minuti a 1.000 x g a quattro gradi Celsius. Lavare la resina sette volte in questo modo.Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere la resina in 1 mL di TEGN e trasferirla in una provetta da 1,5 mL a basso legame. Centrifugare per due minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere la resina per ogni punto sperimentale in 100 microlitri di soluzione peptidica FLAG a 4 mg/mL a pH 7,8 Mescolare bene e aggiungere 100 microlitri di tampone TEGN.Incubare a quattro gradi Celsius per almeno quattro ore per eluire le proteine legate. Centrifugare per due minuti e trasferire la resina e il surnatante in una colonna di centrifuga vuota posta in una provetta da 2 mL. Centrifugare la colonna per un minuto a 6.000 x g.Raccogliere il surnatante rimanente nella provetta da 2 mL. L'efficienza di purificazione viene quindi testata come descritto nel testo del protocollo, prima di procedere con la purificazione basata su HA. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi di complessi MyoD purificati a doppia affinità da frazioni estraibili con sali nucleari o arricchite con nucleasomi di una linea cellulare HeLa S3 che esprimono stabilmente FLAG HA MyoD.La colorazione dell'argento ha identificato FLAG HA MyoD indicato dalla freccia che è assente dalla linea cellulare simulata. I complessi MyoD purificati a doppia affinità sono stati frazionati su gradienti di glicerolo. Il western blotting delle frazioni con anticorpi anti-FLAG ha scoperto i sottocomplessi MyoD nei due compartimenti subnucleari.In particolare, il MyoD estraibile a sale è distribuito in tre sottocomplessi, mentre il MyoD legato alla cromatina appartiene principalmente a un complesso. L'analisi della spettrometria di massa degli interattori MyoD isolati da frazioni estraibili con sali nucleari e arricchite di nucleosomi ha identificato una serie di partner noti e nuovi partner di MyoD. Qui gli interattori MyoD che si trovano in entrambe le frazioni o, specificamente per una delle frazioni, sono raggruppati in base alle loro annotazioni funzionali.Alcuni degli interattori rivelati dalla spettrometria di massa sono stati confermati dal Western blot sui complessi MyoD. Questi includono i fattori di trascrizione CBF, la subunità SWI/SNF BAF47 e le proteine HP1. Poiché le cellule HeLa non sono cellule muscolari e normalmente non esprimono MyoD, è necessario confermare le interazioni tra gli interattori appena identificati e MyoD e i mioblasti.Estratti nucleari totali di mioblasti di topo proliferanti e differenzianti sono stati utilizzati per l'immunoprecipitazione e l'analisi Western con gli anticorpi indicati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni e mezzo se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di affinare i risultati ottenuti nei mioblasti.Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il knockdown del particolare partner nel sistema di rilevanza, come i mioblasti, per rispondere a domande aggiuntive come il significato funzionale dell'interazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica biologica dello sviluppo per esplorare la rete di regolazione di cinque fattori di trascrizione nella maggior parte dei sistemi corporei. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare i partner del fattore di trascrizione eseguendo il frazionamento cellulare seguito dalla purificazione di affinità tandem abbinata alla spettrometria di massa.

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