Identificazione di MyoD Interattoma Utilizzando Tandem Affinity Purification accoppiato alla spettrometria di massa

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare in modo esaustivo i partner della proteina MyoD. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia del muscolo scheletrico, come la regolazione molecolare della deformazione tonale del muscolo scheletrico da parte del fattore chiave di trascrizione muscolare, MyoD. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di svelare i partner MyoD che hanno un'abbondanza elettivamente bassa, localizzata in uno specifico compartimento subnucleare.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione della differenziazione muscolare, può essere applicato anche ad altri sistemi, come qualsiasi altro tessuto, in particolare la differenziazione nucleare. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Lauriane Fritsch, assistente di ricerca del nostro laboratorio. In questo protocollo, i complessi MyoD saranno purificati da cellule HeLa S3 che esprimono stabilmente MyoD con tag gluteninici FLAG.

Le cellule HeLa S3 trasdotte con il vettore vuoto saranno utilizzate come controllo. Entrambe le linee cellulari sono state precedentemente coltivate, raccolte e conservate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius, come descritto nel testo del protocollo. Scongelare rapidamente i pellet di cella in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Tutti i tamponi e gli omogeneizzatori devono essere preraffreddati e l'intera procedura deve essere eseguita in una cella frigorifera. In genere, vengono utilizzati 20 grammi di cellule per ogni punto sperimentale, ma ai fini di questa dimostrazione, verranno elaborati solo 10 grammi, o circa 10 mL di cellule. Risospendere le cellule in 10 mL di tampone ipotonico A, utilizzando inizialmente 5 mL di tampone.

Quindi, aggiungendo 2,5 ml, seguiti da altri 2,5 ml. Lavare bene la pipetta con un tampone fresco per ottenere il massimo delle cellule. Trasferire 20 mL della sospensione cellulare nell'omogeneizzatore preraffreddato con un pestello a tenuta ermetica.

Omogeneizzare le cellule con 20 colpi. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 millilitri. Per il massimo recupero delle cellule, lavare l'omogeneizzatore con 3,5 ml di tampone di saccarosio.

Trasferire rapidamente questa sospensione nella provetta da 50 mL per preservare i nuclei e limitare le perdite. Colorare un'aliquota da 30 microlitri della sospensione cellulare con 30 microlitri di blu di tripano al 4% e analizzare al microscopio per determinare l'efficienza della lisi. Tutti i nuclei dovrebbero essere blu se la lisi ha successo.

Se necessario, ripetere l'omogeneizzazione. Centrifugare per sette minuti a 10.000 x g e quattro gradi Celsius per pellettare i nuclei. Conservare il surnatante come frazione citoplasmatica.

Iniziare la procedura di preparazione della frazione estraibile del sale nucleare risospendendo il pellet di nuclei in 4 mL di tampone saccarosio. Quindi, aggiungere 4 mL di tampone ad alto contenuto di sale goccia a goccia mescolando accuratamente su un vortice per ottenere una concentrazione finale di 300 mM di cloruro di sodio. Incubare per 30 minuti su ghiaccio mescolando ogni cinque minuti.

Quindi, ridurre la concentrazione di cloruro di sodio a 150 mM aggiungendo 8 mL di tampone saccarosio. Centrifugare per 10 minuti a 13.000 x g e quattro gradi Celsius. Raccogli il surnatante che è la frazione estraibile dal sale e lascialo in ghiaccio.

Per preparare la frazione legata alla cromatina, risospendere meticolosamente il pellet in 3,5 mL di tampone saccarosio. Aggiungere il cloruro di calcio a una concentrazione finale di 1 mM e mescolare. Il cloruro di calcio attiverà la nucleasi micrococcica che verrà aggiunta in seguito.

Preriscaldare la sospensione per un minuto a 37 gradi Celsius. Aggiungere 35 microlitri di un brodo di nucleasi micrococcica da 5 unità per microlitro per ottenere una concentrazione finale di 25 10 millesimi unità per microlitro. Incubare per esattamente 12 minuti a 37 gradi Celsius.

Mescolare ogni quattro minuti. Dopo 12 minuti, posizionare immediatamente la reazione sul ghiaccio. Per arrestare l'attività della nucleasi micrococcica, aggiungere 56 microlitri di EDTA a 5 molari pH 8.0 a una concentrazione finale di 4 mM e vortex.

Incubare per cinque minuti con ghiaccio. Sonicare cinque volte per un minuto ogni volta ad alta ampiezza consentendo una pausa di un minuto tra le sonicazioni. Centrifugare sia la frazione estraibile in sale che quella arricchita con nucleosoma per 30 minuti a 85.000 x g a quattro gradi Celsius.

Raccogli i surnatanti. La frazione estraibile di sale dovrebbe essere di circa 13 ml. E la frazione arricchita di nucleasomi dovrebbe essere di circa 6 mL.

I complessi proteici MyoD saranno purificati mediante purificazione a doppia affinità. Poiché le procedure per la purificazione basata su FLAG e per la purificazione basata su HA sono simili, verrà dimostrata solo la purificazione basata su FLAG. Dopo aver aggiunto TEGN, trasferire il volume appropriato di resina FLAG in una provetta da 50 mL.

Per ogni punto sperimentale sono necessari 300 microlitri di resina FLAG proveniente dalla resina FLAG prewash commerciale al 50%. Centrifugare per due minuti a 1.000 x g. Rimuovere il surnatante, aggiungere TEGN freddo e centrifugare di nuovo.

Lavare la resina FLAG con TEGN freddo per un totale di cinque volte. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere la resina FLAG in un volume uguale di TEGN. Per ogni punto sperimentale, mescolare 300 microlitri di resina FLAG lavata e l'estratto proteico corrispondente.

Utilizzare una provetta da 15 mL per la frazione arricchita di nucleasomi e una provetta da 50 mL per la frazione estraibile dal sale. Incubare i tubi su una ruota rotante per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, centrifugare tutte le provette per due minuti a 1.000 x g a quattro gradi Celsius.

Raccogliere i surnatanti e mantenerli a quattro gradi Celsius fino ad ottenere il risultato del test di efficienza di purificazione. Per i campioni estraibili con sale, risospendere la resina FLAG in 4 mL di TEGN e trasferirla in una provetta da 15 mL. Ripetere questo passaggio tre volte, trasferendo ogni volta negli stessi 15 ml per evitare di perdere le perle.

Centrifugare per due minuti a 1.000 x g a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere 13 mL di TEGN alla resina FLAG e centrifugare per due minuti a 1.000 x g a quattro gradi Celsius. Lavare la resina sette volte in questo modo.

Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere la resina in 1 mL di TEGN e trasferirla in una provetta da 1,5 mL a basso legame. Centrifugare per due minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere la resina per ogni punto sperimentale in 100 microlitri di soluzione peptidica FLAG a 4 mg/mL a pH 7,8 Mescolare bene e aggiungere 100 microlitri di tampone TEGN.

Incubare a quattro gradi Celsius per almeno quattro ore per eluire le proteine legate. Centrifugare per due minuti e trasferire la resina e il surnatante in una colonna di centrifuga vuota posta in una provetta da 2 mL. Centrifugare la colonna per un minuto a 6.000 x g.

Raccogliere il surnatante rimanente nella provetta da 2 mL. L'efficienza di purificazione viene quindi testata come descritto nel testo del protocollo, prima di procedere con la purificazione basata su HA. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi di complessi MyoD purificati a doppia affinità da frazioni estraibili con sali nucleari o arricchite con nucleasomi di una linea cellulare HeLa S3 che esprimono stabilmente FLAG HA MyoD.

La colorazione dell'argento ha identificato FLAG HA MyoD indicato dalla freccia che è assente dalla linea cellulare simulata. I complessi MyoD purificati a doppia affinità sono stati frazionati su gradienti di glicerolo. Il western blotting delle frazioni con anticorpi anti-FLAG ha scoperto i sottocomplessi MyoD nei due compartimenti subnucleari.

In particolare, il MyoD estraibile a sale è distribuito in tre sottocomplessi, mentre il MyoD legato alla cromatina appartiene principalmente a un complesso. L'analisi della spettrometria di massa degli interattori MyoD isolati da frazioni estraibili con sali nucleari e arricchite di nucleosomi ha identificato una serie di partner noti e nuovi partner di MyoD. Qui gli interattori MyoD che si trovano in entrambe le frazioni o, specificamente per una delle frazioni, sono raggruppati in base alle loro annotazioni funzionali.

Alcuni degli interattori rivelati dalla spettrometria di massa sono stati confermati dal Western blot sui complessi MyoD. Questi includono i fattori di trascrizione CBF, la subunità SWI/SNF BAF47 e le proteine HP1. Poiché le cellule HeLa non sono cellule muscolari e normalmente non esprimono MyoD, è necessario confermare le interazioni tra gli interattori appena identificati e MyoD e i mioblasti.

Estratti nucleari totali di mioblasti di topo proliferanti e differenzianti sono stati utilizzati per l'immunoprecipitazione e l'analisi Western con gli anticorpi indicati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni e mezzo se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di affinare i risultati ottenuti nei mioblasti.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il knockdown del particolare partner nel sistema di rilevanza, come i mioblasti, per rispondere a domande aggiuntive come il significato funzionale dell'interazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica biologica dello sviluppo per esplorare la rete di regolazione di cinque fattori di trascrizione nella maggior parte dei sistemi corporei. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare i partner del fattore di trascrizione eseguendo il frazionamento cellulare seguito dalla purificazione di affinità tandem abbinata alla spettrometria di massa.