Targeting biofilm Associated

L'obiettivo generale di questa procedura è coltivare in modo semplice e riproducibile biofilm batterici in una piastra a 96 pozzetti su perni fissati al coperchio, per test di suscettibilità agli antibiotici mediante un colorante di vitalità. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della scoperta e dello sviluppo di antibiotici, esplorando l'attività su cellule associate ai biofilm, che spesso rappresentano in modo più accurato gli stati di infezione in vivo. Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di sottoporre facilmente a sfida biofilm preformati in un saggio trifasico e determinare l'inibizione utilizzando un comune colorante di vitalità.

Per iniziare, coltivare una cultura di organismo produttore di biofilm in un mezzo ricco di nutrienti. Inoculare il ceppo di Staphylococcus aureus Newman da un'ampolla di glicerolo in 10 millilitri di mezzo Muller-Hinton. Eseguire tutti i passaggi che prevedono la manipolazione di S.aureus indossando guanti e all'interno di una cappa a sicurezza biologica.

Incubare per 16 ore a 37 gradi Celsius su un agitatore rotatorio. Aggiungere il volume di coltura calcolato in un tubo da centrifuga e pellettizzare le cellule centrifugando per un minuto a 10.000 G. Per preparare l'inoculo del biofilm, aspirare il mezzo di crescita esausto e risospendere il pellet cellulare in 20 millilitri di CRPMI. Utilizzando una pipetta multicanale da 200 microlitri, aggiungere 125 microlitri di inoculo da un serbatoio di 25 millilitri in ciascuna pozzetta delle righe da A a G della piastra inferiore.

Aggiungere 125 microlitri di mezzo CRPMI sterile in ciascun pozzetto della riga H come controllo di sterilità. Prendere il coperchio con i perni e tenerlo sopra il fondo della piastra con i perni rivolti verso il basso. Allineare con attenzione ciascun perno con il rispettivo pozzetto.

Evitare il contatto fisico tra la piastra e i perni. Una volta allineato, abbassare con cura il coperchio. Sigillare il coperchio alla piastra con pellicola di paraffina per prevenire l'evaporazione e collocare il tutto in un sacchetto di plastica richiudibile, sigillandolo accuratamente.

Mantenere il volume d'aria nel sacchetto il più basso possibile per minimizzare l'evaporazione. Incubare la piastra senza agitazione a 37 gradi Celsius per 48 ore, in un incubatore con 5% di anidride carbonica. Nel giorno della sfida con il biofilm, prelevare una nuova piastra a 96 pozzetti e aggiungere 100 microlitri di CRPMI, equilibrato a temperatura ambiente, in ciascun pozzetto delle righe da B a H. Diluire separatamente fino a quattro composti in esame, in 1,0 millilitro di CRPMI, fino a una concentrazione finale 2x rispetto a quella desiderata.

Aggiungere 200 microlitri del composto 1 nei pozzetti A1-A3. 200 microlitri del composto 2 nei pozzetti A4-A6. 200 microlitri del composto 3 nei pozzetti A7-A9. E 200 microlitri del composto 4 nei pozzetti A10-A12. Diluire in serie i composti in prova utilizzando una pipetta multicanale.

Trasferire inizialmente 100 microlitri dalla riga A alla riga B e mescolare. Procedere in questo modo trasferendo 100 microlitri da pozzetto a pozzetto. Mescolare dopo ogni trasferimento e fermarsi alla riga F. Dopo il mescolamento, espellere 100 microlitri dalla riga F in un contenitore per rifiuti.

Non trasferire alcun liquido nelle righe G e H. Infine, aggiungere 100 microlitri di CRPMI in ogni pozzetto della piastra utilizzando una pipetta multicanale, portando il volume finale a 200 microlitri. Aggiungere 200 microlitri di soluzione salina fosfato tamponata in una piastra sterile da 96 pozzetti, fresca, che presenti pozzetti con dimensioni identiche a quelle della piastra per l'iniziazione del biofilm. Successivamente, rimuovere il sacchetto di plastica e la pellicola di paraffina dalla piastra per l'iniziazione del biofilm incubata.

Sollevare il coperchio verticalmente, evitando il contatto tra i perni e il fondo della piastra, poiché ciò potrebbe danneggiare il biofilm. Conservare la parte inferiore per l'analisi successiva dell'OD600. Rimuovere le cellule planctoniche lavando il coperchio con i perni posizionandolo sulla piastra contenente PBS.

Immergere i perni per cinque secondi. Estrarli dal PBS e immergerli nuovamente, avendo cura di non farli urtare contro i lati delle pozzette. Posizionare il coperchio con i perni risciacquati nella piastra di prova.

Evitare un contatto eccessivo tra i perni e la piastra inferiore, poiché ciò danneggerebbe il biofilm, portando a risultati non riproducibili. Sigillare la piastra con pellicola di paraffina e inserirla in un sacchetto di plastica richiudibile, come in precedenza. Incubare la piastra, senza agitazione, per 24 ore a 37 gradi Celsius, in un incubatore con 5% di anidride carbonica.

Prendere il fondo della piastra per l'inizio della formazione del biofilm e risospendere i batteri in ogni pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Misurare l'OD600 con un lettore di micropiastre adeguato, per confermare la crescita avvenuta in tutti i pozzetti tranne nei controlli di sterilità della riga H. Utilizzare un lettore di piastre dotato di camera di incubazione e in grado di effettuare letture cinetiche di fluorescenza per rilevare la conversione del resazurin. Impostare una misurazione cinetica di fluorescenza di 24 ore con un'eccitazione a 530 nanometri e un'emissione a 590 nanometri.

Impostare la temperatura della camera a 37 gradi Celsius e programmare la lettura della piastra ogni 20 minuti. Impostare il lettore di piastre per effettuare la misurazione dal fondo della piastra seguendo le istruzioni del produttore. Prepararsi a lavare la piastra aggiungendo 200 microlitri di PBS in ogni pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti mediante una pipetta multicanale.

Quindi, preparare il mezzo di recupero del biofilm aggiungendo 400 microlitri di soluzione madre di resazurina 0,8 milligrammi per millilitro a 20 millilitri di mezzo CRPMI, ottenendo una concentrazione finale di 16 microgrammi per millilitro di resazurina. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di mezzo di recupero del biofilm, utilizzando una pipetta multicanale, in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti. Trasferire la piastra di prova dall'incubatrice in una cappa a sicurezza biologica e rimuovere con attenzione il sacchetto di plastica e il film sigillante.

Rimuovere il coperchio con perni dalla piastra di sfida e risciacquare le cellule planctoniche in PBS come in precedenza, mantenendo il fondo della piastra di sfida per l'analisi successiva dell'OD600. Dopo il risciacquo, posizionare il coperchio con perni nel fondo della piastra contenente il mezzo di recupero del biofilm. Avvolgere i lati della piastra con pellicola paraffinata, avendo cura di non ostruire il fondo delle pozzette perimetrali.

Immediatamente dopo aver sigillato la piastra, posizionarla sul lettore di piastre e avviare una lettura cinetica per un periodo di 24 ore, attivando il protocollo cinetico per la resazurina precedentemente impostato. Per quantificare la crescita di cellule planctoniche, che potrebbe verificarsi o meno durante la prova, leggere l'OD600 dell'intera superficie inferiore della piastra mediante un lettore per micropiastre. Qui viene mostrato un esempio di disposizione di una piastra di prova, che utilizza due diluizioni complete per titolare le concentrazioni del composto.

I biofilm coltivati sono stati trattati con neocuproina o con il suo complesso rameico. Letture dell'OD600 del fondo della piastra di sfida dopo 24 ore hanno rivelato che il complesso rameico della neocuproina, ma non la neocuproina da sola, ha impedito il distacco e la successiva crescita di cellule vitali dai biofilm trattati a concentrazioni di 1,25 micromolare o superiori. I corrispondenti biofilm sono stati quindi testati mediante saggio con resazurina.

L'ispezione visiva dopo 24 ore consente una risposta rapida di tipo sì-no qualora si eseguano in parallelo più piastre. La resazurina diventa rosa nelle pozzette con biofilm vitali, ma rimane blu quando il biofilm è stato eradicato. Una lettura cinetica della conversione della resazurina può rivelare effetti dipendenti dalla concentrazione sulla vitalità del biofilm, come mostrato qui con la gentamicina.

Il ritardo dipendente dalla concentrazione nell'inizio della conversione del colorante indica una riduzione della vitalità del biofilm. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di non urtare i perni contro i lati delle pozzette.