Un passo per passo protocollo per la chirurgia sottoretinico in Conigli

L'obiettivo generale di questo intervento chirurgico è quello di sostituire l'epitelio pigmentato della retina disfunzionale, o RPE, per trovare una possibile cura per le malattie correlate all'RPE, come la degenerazione maculare legata all'età. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo optometrico sulla terapia cellulare e sulla degenerazione maculare legata all'età. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può fornire una modalità di trasporto per il substrato di sostituzione cellulare o per i dispositivi di somministrazione di farmaci nello spazio sottoretinico.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla vitrectomia e sulla chirurgia sottoretinica nei conigli, può essere utilizzato anche su altri organismi modello, come maiali, scimmie o esseri umani. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, poiché non solo la chirurgia intraoculare è complessa, ma anche il personale, l'organizzazione e la tecnologia per questa procedura devono essere ben sincronizzati. A dimostrare la procedura di caricamento degli strumenti saranno Fabian Thieltges, un post-doc, e Ralf Brinken, un infermiere di scrub chirurgico, entrambi del mio laboratorio.

Prima di iniziare l'intervento chirurgico, confermare il livello appropriato di anestesia e applicare un unguento oculare sull'altro occhio non operato dell'animale. Quindi, posiziona il coniglio sotto un microscopio chirurgico sul lato sinistro, con l'occhio destro rivolto verso l'alto e il naso leggermente sollevato da una piega a coperta. Disinfettare l'occhio per un minuto con alcune gocce di iodio povidone.

Quindi, sciacquare l'occhio con BSS sterile e coprire la testa dell'animale con un telo sterile con un'apertura dell'occhio pretagliata. Posiziona un pezzo di 12 x 17 centimetri di drappo adesivo per incisione chirurgica sull'occhio e usa le forbici per esporre l'occhio con un'incisione orizzontale sulla linea mediana. Utilizzando i calibri invertiti, spostare l'occhio in posizione proptosa e fissare il tessuto con una sutura di seta 3-0.

Quindi, utilizzare un paio di forbici Vannas per incidere la congiuntiva vicino al limbus, a circa un millimetro dai vasi sanguigni adiacenti, e allargare la peritomia parallelamente al limbus. Separare senza mezzi termini la congiuntiva, seguita da un'incisione verticale perpendicolare da sei a sette millimetri per fare una "T" nella congiuntiva. Fai un'altra piccola peritomia intorno alla posizione delle 2

Quindi, inserire con cautela la punta di una lama microvitreoretinica calibro 23 attraverso la sclera, puntando verso il polo posteriore dell'occhio a 3,5 millimetri dal limbus nella posizione delle 8. Per evitare di allargare l'incisione, ritrarre lentamente la lama nella stessa direzione e posizionare una sutura Vicryl 7-0. Quindi, inserire la cannula per infusione con porta laterale personalizzata nell'apertura sclerale e utilizzare la sutura preposizionata per fissare la cannula.

Impostare la pressione intraoculare da 20 a 24 millimetri di mercurio. Quindi, usa un trocar a testa piatta calibro 25 per perforare la sclera a ore 2 e inserisci una luce del lampadario calibro 25 nella porta. Fissare la luce con del nastro adesivo e regolarla a circa il 30% di potenza, quindi regolare individualmente.

Utilizzare un bisturi da 20 per rimuovere l'epitelio corneale edematoso per facilitare una migliore visualizzazione intraoculare. Ora, eseguire un'altra sclerotomia con la lama microvitreoretinica calibro 23 a ore 10 e posizionare una sutura Vicryl 7-0 a forma di U attorno alla sclera incisa senza legare completamente il nodo. Inserire la punta di un vitrector ad alta velocità nell'incisione e iniziare la vitrectomia attorno alla porta di ingresso.

Tagliare l'umor vitreo in piccoli pezzi ad un massimo di 2.000-3.000 tagli al minuto, proseguendo la vitrectomia sul disco ottico e sulle fibrae midollari, e aspirando ad un massimo di 200 millimetri di mercurio. Per separare delicatamente l'umor vitreo dalla retina, tenere il vitrettore sopra il polo posteriore e inferiore del disco e continuare ad aspirare senza tagliare. Quando il distacco posteriore del vitreo è completo, iniettare per via intravitreale circa 50 microlitri del composto di interesse per visualizzare il vitreo galleggiante durante la sua rimozione quasi totale.

Quando l'occhio è stato preparato, sciacquare la coltura cellulare di impianto tre volte con BSS di grado oftalmico non integrato. Quindi, riempire una piastra per colture cellulari da 100 x 20 millimetri con 10 millilitri di BSS di grado oftalmico e aggiungere l'inserto per colture cellulari alla piastra. Centrare la capsula al microscopio ottico e utilizzare un ago cavo ovale affilato su misura per perforare un substrato piatto a forma di fagiolo di 2,4 x 1,1 millimetri con due bordi lunghi e due bordi arrotondati fuori dalla coltura cellulare.

Inondare delicatamente l'ago attraverso la seconda porta con BSS per inserire l'impianto nel piatto di coltura cellulare riempito di BSS. Per ottenere un terzo bordo, praticare un'incisione di 0,5 millilitri in una delle estremità rotonde dell'impianto e utilizzare una pinza per peeling della membrana calibro 23 per trasferire l'impianto nella stazione di carico su misura. Assicurarsi che l'impianto sia in posizione verticale, quindi utilizzare la pinza per spingere delicatamente l'impianto completamente nello strumento sparatutto fino a quando tutto il tessuto non è fissato all'interno della punta e posizionare la punta sparatutto nella stazione di caricamento sotto BSS fino a quando le cellule non vengono impiantate.

Per consentire l'impianto delle cellule sotto la retina, avvicinarsi alla retina neurale con un ago per iniezione sottoretinica estensibile calibro 41 collegato a una siringa a tenuta di gas e iniettare BSS per via sottoretinica per creare un distacco di retina. Quando la bolla ha un diametro del disco di circa 2 o 3, utilizzare forbici VR verticali calibro 23 per allargare la retinotomia a 1,5 millimetri e utilizzare un coltello da incisione da 1,4 millimetri per estendere con precisione la sclerotomia a ore 10 a un approccio calibro 20. Successivamente, prova a far passare un manichino da tiro calibro 20 attraverso la sclerotomia, allargando l'incisione se necessario per garantire una transizione fluida ma aderente del tiratore caricato.

Quindi, passare il tiratore carico attraverso l'incisione sclerale a 20-24 millimetri di mercurio fino al bordo della retinotomia e iniettare l'impianto per via sottoretinica da una posizione epiretinica. Il tiratore dovrebbe passare rapidamente attraverso la sclera al primo tentativo, quindi assicurarsi una sclerotomia di dimensioni ottimali. Le cellule RPE devono quindi essere impiantate sottoretinicamente con un angolo poco profondo per evitare l'intrappolamento del bordo d'attacco dell'impianto sulla membrana di Bruch.

Regolare l'impianto in modo che sia posizionato sotto la retina ragionevolmente lontano dalla retinotomia. Quindi, rimuovere la porta dalla sclerotomia e iniettare 25 microlitri di triamcinolone attraverso la porta del lampadario. Utilizzando suture 7-0, chiudere le sclerotomie a ore 2 e 10 e verificare la presenza di perdite.

Rimuovere la cannula per infusione e chiudere immediatamente l'ultima sclerotomia con la sutura Vicryl 7-0 preposizionata. Utilizzando un ago calibro 30, iniettare BSS per regolare la pressione intraoculare secondo necessità, durante la palpazione. Infine, suturare la congiuntiva con Vicryl 7-0 e rimuovere la seta proptosante, avendo cura di evitare il plesso venoso orbitale profondo.

L'attecchimento sotto la retina ha un tasso di successo chirurgico di circa il 60% quando viene eseguita una vitrectomia centrale, che aumenta a oltre il 75% quando viene indotto un distacco posteriore del vitreo. Qui, viene mostrata un'immagine di riflettanza infrarossa dell'oftalmoscopio laser a scansione di epiteli pigmentati retinici in coltura xenotrapiantati su una membrana di poliestere dopo una procedura semplice, con l'atrofia dei fotorecettori risultante dalla reazione immunitaria che appare come un alone attorno all'impianto. In questa corrispondente immagine di tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale, si può osservare l'assottigliamento dello strato nucleare esterno in risposta allo xenotrapianto di RPE, principalmente nella retina con una banda iperriflettente visibile sopra l'impianto.

La retina neurale adiacente all'impianto, tuttavia, mostra bande di riflessione quasi normali, suggerendo una consegna atraumatica dell'impianto. Come osservato dalla colorazione H/E, le cicatrici sottoretiniche e l'atrofia dello strato nucleare esterno si verificano nei conigli xenotrapiantati non immunodepressi. Anche la membrana di Bruch sotto l'impianto sembra essere contigua, con il coriocapillare che contiene alcuni eritrociti sparsi, confermando ulteriormente l'assenza di traumi subiti durante la consegna dell'impianto.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un'ora se non si incontrano complicazioni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di creare una bolla retinica e una retinotomia abbastanza grandi da adattarsi all'impianto. Inoltre, un intervento chirurgico più rapido produrrà in genere risultati migliori.

Dopo questa procedura, altri metodi come la tomografia a coerenza ottica o l'istologia possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come il successo del trapianto, la biocompatibilità sottoretinica e la sopravvivenza delle cellule trapiantate. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali e dei biomateriali per esplorare la somministrazione sottoretinica di derivati delle cellule staminali e/o substrati trasportatori biofunzionalizzati per le malattie retiniche, in particolare l'EPR. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la vitrectomia e la chirurgia di impianto sottoretinico nei conigli.

Non dimenticare che lavorare con l'interfaccia del cristallino, del vitreoretinale e della sottoretina può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come il corretto posizionamento della mano, una buona visualizzazione, una pressione intraoculare stabile.