Name: Analisi clinicopatologica di miRNA espressione in Breast Cancer tessuti mediante lutilizzo di miRNA In Situ ibridazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ di miRNA per rilevare l'espressione di micro RNA nei tessuti di cancro al seno. Questo metodo consente di localizzare cellularmente i miRNA e chiarire il loro ruolo nella soppressione tumorale.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH (5R01 CA178386-03) e dalla sovvenzione USC ASPIRE-1 a HC. Vorremmo ringraziare Vrushab Gowda per la sua assistenza con il manoscritto.

Questo studio è stato approvato dal Institutional Review Board dell&#39;Università Hwasun Hospital Chonnam Nazionale e University of South Carolina. campioni TMA composte da cancro al seno e tessuti del seno normali adiacenti abbinati sono stati forniti dalla Biobanca di Chonnam National University Hospital Hwasun, membro della Corea del Biobanca rete. 1. Soluzione Preparazione <ol><li> Preparare 1 L di DNasi e RNasi acqua libera. Effettuare tutte le soluzioni chimiche che utilizzano dietilpirocarbonato (DEPC) acqua trattata. Trattare 1 L di acqua con 500 ml di DEPC e incubare per 3 ore a temperatura ambiente. Autoclave l&#39;acqua per inattivare DEPC. Attenzione: Non inalare DEPC poiché è noto agente cancerogeno. </li><li> Preparare 1x PBS da 10x PBS con acqua DEPC trattati. </li><li> Preparare 20x SSC (sciogliere 175,3 g di NaCl e 88,2 g di citrato di sodio in 800 ml di acqua, regolare il pH a 7,0 con poche goccia di 14 N soluzione di HCl e regolare il volume di 1 L con water), 4% paraformaldeide, 95% di etanolo, 80% di etanolo con acqua DEPC trattati. </li><li> Aggiungere 8 ml di trietanolamina e 1,05 ml di HCl in 590 ml di acqua trattata con DEPC e aggiungere 1,5 ml di anidride acetica per acetilazione. </li><li> Preparare 50 mg / mL proteinasi K in tampone (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 in DEPC acqua trattata). </li><li> Preparare tampone di ibridazione composta da 500 ml di formammide, 250 microlitri di 20x SSC, 100 ml di 50x soluzione di Denhardt, 12,5 l di t-RNA, 2,5 l di DNA aringhe sperma, 30 ml di RVC, 0,02 g di blocco dei reagenti e 50 ml di acqua DEPC. Preparare fresco. </li></ol> 2. tessuto mammario Sezioni <ol><li> Tagliare 5 micron sezioni incluse in paraffina fissati in formalina con microtomo e applicare la sezione per caricare slitta 14. Nota: il tessuto del seno utilizzato qui è stato preparato in precedenza dalla Corea del Biobanche di rete. </li></ol> 3. Preparazione del tessuto <ol><li> Rimuovere la paraffina from tessuto immergendo i vetrini in Coplin 2x vaso in xilene fresco per 10 minuti ciascuno e reidratare la sezione di tessuto da 5 min incubazioni in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 95% e 80%) in DDH 2 O. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante. </li><li> Immergere il tessuto in DEPC acqua trattata per 5 min. A questo punto fare confini intorno sezione di tessuto con la penna barriera idrofoba. </li><li> Fissare il tessuto con 4% PFA per 15 minuti seguita da un lavaggio con PBS. </li><li> Immergere il tessuto in 0,3% Triton X-100 / PBS per 10 minuti seguita da un lavaggio con PBS. </li><li> Incubare campione con 50 mg soluzione / ml proteinasi K per 15 minuti a 37 ° C. Poi incubare sezioni di tessuto con trietanolammina e anidride acetica per 5 min a temperatura ambiente, seguito da un lavaggio con PBS. Nessun lavaggio PBS è richiesto tra il trattamento proteinasi K e trietanolammina / trattamento anidride acetica. </li></ol> 4. ibridazione <ol><li> Lavare accuratamente e incu il tessutobate la sezione di tessuto con tampone di ibridazione da 2 a 3 ore a temperatura ambiente. Tipicamente 120 microlitri tampone di ibridazione è sufficiente a coprire la sezione di tessuto. </li><li> Diluire 5&#39;-DIG etichettata sonda LNA a concentrazione finale di 3:00 in 120 ml soluzione di ibridazione. Come la concentrazione stock di solito è di 40 ng / ml, aggiungere 3 ml di brodo di tampone di ibridazione 120 ml e incubare la miscela a 95 ° C per 5 min. </li><li> Incubare la sezione di tessuto con sonda durante la notte a 54 ° C (Tm) in una camera umida. Tipicamente 120 ml è sufficiente a coprire una sezione. Creare umidità utilizzando due asciugamani di carta bagnati. La dimensione ideale della camera è di 10 pollici da 8 pollici. </li><li> Nota: Tm può essere diverso per i diversi miRNA. 54 ° C è menzione per miR-489. </li></ol> 5. stringenza Wash <ol><li> Lavare il tessuto con 5x SSC per 7 minuti (dopo la fase di ibridazione, RNasi condizioni di libero non sono più necessari). </li><li> Lavare l&#39;arguzia sezione di tessutoh 1x SSC per 7 minuti due volte a 57 ° C. </li><li> Lavare la sezione di tessuto con 0.2x SSC per 7 minuti a 57 ° C. </li><li> Lavare la sezione di tessuto con 0.2x SSC per 7 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Incubare sezione di tessuto in PBS per 10 min. </li></ol> 6. Blocco <ol><li> Incubare la sezione di tessuto con tampone di arresto a temperatura ambiente per 1 ora in camera umida (Per fare un tampone di bloccaggio con 2 ml di FBS, 10 ml di Tween-20 e 3 ml di BSA in 18 m di PBS. Conservare tampone di bloccaggio a 4 ° C). </li></ol> 7. incubazione dell&#39;anticorpo primario e lo Sviluppo <ol><li> Diluire 1: 300 di anticorpi anti-DIG-AP in tampone di bloccaggio e incubare la sezione di tessuto con l&#39;anticorpo a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare le sezioni con tampone di lavaggio per 3 volte, per 5 minuti ciascuna (buffer fornito dal kit di sviluppo). </li><li> Sviluppare la sezione di tessuto con un kit commerciale per la fosfatasi alcalina che produce CY-3 luce fluorescente. </li> &lt;li&gt; Lavare la sezione con tampone di lavaggio per 5 minuti. sezione macchia con 100 ml di 2,5 ng / ml colorante Hoechst per 5 minuti seguita da 5 minuti di lavaggio con tampone di lavaggio. </li><li> Montare la sezione con il tampone di montaggio secondo il protocollo del produttore. Utilizzare 15 ml per sezione di tessuto e pulire soluzione di montaggio eccessiva con il tessuto pulire. Sigillare il vetrino con smalto trasparente per evitare perdite. </li><li> Osservare il microscopio sezione fluorescente utilizzando con ingrandimento 10X lente in modo totale è di 100X. </li></ol>

<ol><li>Shah, N. R., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+pathogenesis+of+breast+cancer%3A+Implications+in+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment.</a> World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).</li>
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<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+miR-182+and+miR-503+cooperatively+targets+FBXW7%2C+contributing+to+the+malignant+transformation+of+colon+adenoma+to+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma.</a> J Pathol. 234, 488-501 (2014).</li>
</ol>

Non c'è nulla da rivelare.

L&#39;obiettivo di questo studio era di determinare il livello di espressione dei miRNA nei tessuti di cancro al seno utilizzando miRNA ibridazione in situ. Si deve notare che in questo esperimento, tutte le condizioni sono stati ottimizzati per il tessuto del cancro al seno. Ulteriore ottimizzazione potrebbe essere richiesto per altri tipi di tessuto. Tutte le soluzioni devono essere effettuate con acqua DEPC e tutti i contenitori da utilizzare devono essere risciacquati con acqua DEPC trattati e successivamen...

Il cancro al seno è uno dei tumori più comuni che colpiscono la popolazione femminile in tutto il mondo. Oltre 1,3 milioni di casi di cancro al seno sono segnalati ogni anno in tutto il mondo 1,2. Anche se le cellule tumorali sono stati tradizionalmente considerati come biologicamente omogenea e altamente proliferative, è diventato evidente che il cancro al seno è geneticamente e clinicamente eterogenea. La resistenza ai farmaci antitumorali prevalenti è una caratteristica dei tumori al seno avanzato, che porta alla mortalità nella maggior parte dei pazienti attraverso la sua facilitazione della progressione del cancro e le metastasi a distanza 3. I microRNA (miRNA) sono una classe di piccole molecole di RNA lunghi circa 22 nucleotidi che regolano l&#39;espressione genica bloccando traduzione dell&#39;mRNA o mediare mRNA degrado 4. Più di 2.000 differenti miRNA sono stati finora identificati nell&#39;uomo, che sono collegati a malattie umane 5. Una crescente serie di studi have ha dimostrato che miRNA possono funzionare come oncogeni e soppressori tumorali e sono spesso disregolazione nei tumori 6. miRNA impatto fortemente tutta la tumorigenesi primaria controllando i principali regolatori del ciclo cellulare, la senescenza, l&#39;apoptosi e autofagia, insieme a quelli della motilità delle cellule tumorali, invasione e metastasi 7. Espressione aberrante miRNA è stata anche associata con implicazioni cliniche, come fase, la differenziazione, la prognosi e la risposta alla terapia adiuvante 8. In particolare, l&#39;aumento di espressione di miR-146 è correlato con una scarsa prognosi nei pazienti affetti da cancro del polmone 9. Un altro studio ha dimostrato che l&#39;espressione perduto di miRNA-let7b è legata a fenotipi maligni e, di conseguenza, scarsa sopravvivenza 6. Capire i tipi di cellule e strutture che esprimono miRNA è una parte importante di comprensione dei meccanismi attraverso i quali alterazioni delle cellule miRNA espressione e influenzatessuto fenotipi 10. Alcuni miRNA trovati ad essere secreto nelle cellule stromali sono prese in dalle cellule epiteliali e in particolare agiscono sui loro obiettivi. Allo stesso modo, miR-212 e miR-132 sono secreti dalle stroma e regolano le interazioni epiteliali-stromale necessari per l&#39;escrescenza duttale durante lo sviluppo della ghiandola mammaria 11. L&#39;obiettivo generale di questo articolo è quello di spiegare un protocollo dettagliato per rilevare miRNA nei tessuti di cancro al seno attraverso miRNA ibridazione in situ. Abbiamo ottimizzato tutte le condizioni per saggiare i livelli di espressione miRNA-489 nei campioni dei pazienti di cancro al seno. A tal fine, abbiamo utilizzato uno scavo con l&#39;etichetta bloccato sonda di acido nucleico (LNA) nel nostro esperimento. Alcuni dei suoi nucleotidi avevano una modifica LNA, cioè, un ponte che collega metilene &#39;atomo di ossigeno e 4&#39; del 2 atomi di carbonio dello scheletro ribosio che fissa il nucleotide tale che rimanga &quot;blocchi&quot; dopo ibridazione. Come risultato, è molto più difficileper il complesso ibridizzato denaturare 12,13.

<table><tbody><tr><td>Tecnologia ELF-97</td><td>Life</td><td>E6604</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhard't&nbsp;</td><td>Tecnologia per la vita&nbsp;</td><td></td><td></td>750018</tr><tr><td>t-RNA</td><td>Roche</td><td>109541</td><td>ricostituire in acqua DEPC</td></tr><tr><td>Aringa Sperma DNA</td><td>Promega</td><td>D1815</td><td></td></tr><tr><td>Roche Blocco&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>RVC</td><td>Fisher</td><td>50-812-650</td><td>Prima dell'uso girarlo a 16,1 RCF e prendere il surnatante&nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda miR-489</td><td>Exiqon</td><td>38599-01</td><td></td></tr><tr><td>Senza nucleasi BSA</td><td>Roche</td><td></td><td></td>711454</tr><tr><td>Anticorpo primario-anti DIG</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11093274910</tr><tr><td>Pirocarbonato di dietile&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>1609478</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi clinicopatologica di mirna espressione in breast cancer tessuti mediante l&#39;utilizzo di mirna<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato per il rilevamento dei miRNA nel tessuto del cancro al seno utilizzando l'ibridazione in situ con una sonda LNA (Locked Nucleic Acid) marcata con digoxigenina. La sonda è stata riconosciuta dagli anticorpi anti-fosfatasi alcalina DIG e successivamente sviluppata utilizzando un substrato di fosfatasi alcalina che produce segnali di fluorescenza. Qui abbiamo utilizzato la tecnica di ibridazione in situ (MISH) dei miRNA per analizzare l'espressione di miR-489 nei tessuti di pazienti con carcinoma mammario. Questa tecnica è in grado di rilevare la localizzazione di miRNA di interesse in singoli campioni di tessuto. Questa tecnica può essere utilizzata per confrontare l'espressione del miRNA desiderato nel tessuto tumorale con quella nel tessuto normale adiacente e per identificare le strutture specifiche responsabili dell'espressione di questo miRNA. Questa tecnica può essere molto utile per rispondere ad alcune domande cliniche, come il ruolo di specifici miRNA nello sviluppo del cancro. I nostri risultati indicano che le cellule epiteliali mammarie esprimono livelli significativamente più elevati di miR-489 rispetto alle cellule tumorali adiacenti.

tessuto del cancro al seno umano è stato utilizzato per determinare l&#39;espressione miRNA-489. Mammaria condotto ghiandola e cellule epiteliali sono stati trovati per esprimere significativamente più elevati miRNA-489 livelli di tessuto adiacente tumorale in due pazienti (Figura 1A e 1B). Ciò dimostra chiaramente che l&#39;espressione miRNA-489 è stato perso nel tessuto tumorale, suggerendo tumore attività soppressiva di miRNA-489. Ad ulteriore conferm...

Qui presentiamo un protocollo per rilevare l'espressione di miRNA in campioni di pazienti con cancro al seno utilizzando l'ibridazione in situ di miRNA.

Analisi clinicopatologica di miRNA espressione in Breast Cancer tessuti mediante l&#39;utilizzo di miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; ibridazione

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

L'obiettivo generale di questa ibridazione in situ dell'RNA micro è rilevare la localizzazione dell'RNA micro di interesse nel tessuto del cancro al seno, in modo che il risultato possa rispondere a domande fondamentali nel campo del cancro al seno, come ad esempio se l'RNA micro di interesse abbia un ruolo oncogenico o di soppressore tumorale.Il principale vantaggio di questa tecnica è che può rilevare la nuclearizzazione cellulare di interesse nel tessuto del cancro al seno. Iniziare la preparazione del tessuto rimuovendo la paraffina da sezioni di tessuto mammario precedentemente preparate. Immergere i vetrini in un barattolo di Coplin contenente xilene fresco due volte per dieci minuti ciascuna.Riidratare la sezione di tessuto mediante incubazioni in concentrazioni decrescenti di etanolo in acqua doppio-distillata per cinque minuti ciascuna. Successivamente, immergere il tessuto in acqua trattata con dietilpirocarbonato o DEPC per cinque minuti. Mentre il tessuto è immerso, delimitare attorno alla sezione di tessuto un contorno mediante una penna a barriera idrofoba.Dopo l'immersione in DEPC, fissare il tessuto con PFA al 4% per 15 minuti. Proseguire con un lavaggio in PBS. Successivamente, immergere il tessuto in Triton X-100 allo 0,3% in PBS per dieci minuti.Incubare il campione con una soluzione di Proteinasi K a 50 microgrammi per microlitro per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, incubare le sezioni di tessuto con trietanolammina e anidride acetica per cinque minuti a temperatura ambiente. Procedere quindi con un lavaggio in PBS.Lavare accuratamente il tessuto. Quindi incubare la sezione di tessuto con 120 microlitri di buffer di ibridazione per due ore a temperatura ambiente. Successivamente, diluire la sonda NLA marcatata con DIG al capo 5' a una concentrazione finale di 3 picomolari in 120 microlitri di soluzione di ibridazione.Quindi aggiungere tre microlitri di soluzione madre da 40 nanogrammi per microlitro ai 120 microlitri di tampone di ibridazione. Incubare la miscela a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Inserire la sezione di tessuto in un contenitore da 10 per 8 pollici e ricoprire il tessuto con 120 microlitri della sonda, in modo che sia completamente coperto.Inumidire due tovaglioli di carta e coprire il contenitore per creare una camera di umidità. Incubare il campione di tessuto tutta la notte a 54 gradi Celsius. Dopo l'ibridazione, lavare il tessuto con tampone salino citrato di sodio 5 X o SSC per sette minuti a 57 gradi Celsius.Successivamente, lavare la sezione di tessuto due volte con SSC 1X. E lavare la sezione di tessuto con SSC 0,2X. Quindi, lavare la sezione di tessuto con SSC 0,2X per sette minuti a temperatura ambiente.Incubare il campione di tessuto in PBS per dieci minuti. Incubare il campione di tessuto con il buffer di blocco a temperatura ambiente per un'ora in una camera umidificata. Diluire l'anticorpo anti DIG AP uno a 300 nel buffer di blocco.E incubare il taglio di tessuto con l'anticorpo a 4 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare i tagli con la soluzione di lavaggio tre volte per cinque minuti ciascuna. Seguire le istruzioni del kit commerciale ELF 97 per sviluppare il taglio di tessuto con fosfatasi alcalina che produce una luce fluorescente di dimensione tre.Successivamente, lavare il campione con il buffer di lavaggio per cinque minuti. Colorare il campione con 100 microlitri di colorante Hoechst a 2,5 nanogrammi per microlitro per cinque minuti. Proseguire con un ulteriore lavaggio di cinque minuti con il buffer di lavaggio.Utilizzare 15 microlitri di soluzione di montaggio per ogni sezione di tessuto. Rimuovere con un fazzoletto la soluzione di montaggio in eccesso. Quindi, sigillare il vetrino con smalto trasparente per unghie per evitare perdite.Infine, osservare il campione al microscopio a fluorescenza con un ingrandimento totale di 100 X. Tessuto di cancro al seno umano proveniente da due pazienti è stato utilizzato per determinare l'espressione del Micro RNA 489. Dotti ghiandolari e cellule epiteliali hanno mostrato livelli significativamente più elevati di Micro RNA 489 rispetto al tessuto tumorale adiacente. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della procedura per eseguire l'ibridazione in situ del Micro RNA utilizzando campioni di pazienti con cancro al seno.

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Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Questo articolo viene descritto un protocollo in situ ottimizzato per il rilevamento colorimetrico di espressione microRNA nelle sezioni di rene fisse formalina.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione per tessuti renali fissati in formalina

Molecular segnalazione sia attraverso gli estrogeni e microRNA sono fondamentali nello sviluppo del cancro al seno e la crescita. Estrogeni attiva i recettori degli estrogeni, che sono fattori di trascrizione. Molti fattori di trascrizione in grado di regolare l'espressione dei microRNA, e microRNA regolati dagli estrogeni possono essere profilato utilizzando diverse tecniche su larga scala.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Qui descriviamo un protocollo semplificato per l'analisi dell'espressione di microRNA (miRNA) in tessuti clinici archiviati Fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) o in tessuti clinici freschi congelati per il cancro alla prostata (PCa) che impiegano la PCR quantitativa in tempo reale (RT-PCR) e l'ibridazione in situ (ISH).

Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

Degradazione dell'acido nucleico in tessuto archivistico, eterogeneità del tumore e una mancanza di campioni di tessuto fresco congelato può influire negativamente sulle servizi di diagnostica del cancro nei laboratori di patologia in tutto il mondo. Questo manoscritto descrive l'ottimizzazione di un pannello di biomarcatori usando un'analisi multiplex Beads magnetiche per classificare i tumori al seno.

Ottimizzazione di un'analisi di espressione di RNA-ha basato multisala usando materiale archivistico di cancro al seno

Esemplari di paraffina-incastonati formalina-fisse rappresentano una preziosa fonte di biomarcatori molecolari delle malattie umane. Qui presentiamo un protocollo di preparazione libreria cDNA laboratorio-basato, inizialmente progettato con RNA congelato fresco e ottimizzato per l'analisi dei microRNA archiviati dai tessuti stored fino ai 35 anni.

Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso

micro-RNA (Mirna) è brevi e altamente omologhi sequenze di RNA, che serve come regolatori trascrizionali di RNA messaggeri (mRNA). Attuali metodi di rilevazione di miRNA variano nella sensibilità e specificità. Descriviamo un protocollo che unisce l'ibridazione in situ e immunostaining per il rilevamento simultaneo di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo.

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

Vi presentiamo un protocollo per valutare i livelli di espressione di microRNA (Mirna) di circolazione nei campioni del plasma dai malati di cancro. In particolare, abbiamo utilizzato un kit disponibile in commercio per estrazione di miRNA e trascrizione d'inversione di circolazione. Infine, abbiamo analizzato un panel di miRNA selezionati 24 utilizzando targhe personalizzate in tempo reale sonda pre-maculato.

Rilevamento di un pannello personalizzato di MicroRNA circolanti in pazienti con cancro colorettale metastatico

Il protocollo descrive un test di ibridazione in immunofluorescenza tandem con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina per rilevare e quantificare contemporaneamente microRNA e proteine multiplexate.

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

Vi presentiamo un protocollo per l'analisi strutturale e compositiva delle risorse naturali biofilm orale da apparecchi ortodontici...

Analisi biofilm orale di espansori palatali da Fluorescence In Situ-ibridazione e microscopia confocale a scansione laser

Scopri l'ibridazione in situ di miRNA per rilevare l'espressione di micro RNA nei tessuti di cancro al seno. Questo metodo consente di localizzare cellularmente i miRNA e chiarire il loro ruolo nella soppressione tumorale.

Analisi clinicopatologica di miRNA espressione in Breast Cancer tessuti mediante l'utilizzo di miRNA

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