Name: Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Impara a isolare cellule staminali del follicolo pilifero e cheratinociti epidermici dalla pelle dorsale del topo. Questo metodo utilizza digestione enzimatica e analisi FACS per studiare la biologia delle cellule staminali adulte.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dalla sovvenzione NIH RO1GM60124 (a H.S.). H.S. è un ricercatore presso l'Howard Hughes Medical Institute. Y.F. è supportato dalla Deloro Career Advancement Chair e dalla German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. è supportato dalla borsa di studio post-dottorato Coleman-Cohen.

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni delineate nella guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio di Ministero della Salute di Israele. Tutti gli animali sono stati trattati secondo il protocollo approvato istituzionale cura degli animali IL-02.302-2015 del Technion Israel Institute of Technology. 1. Preparazione sperimentale <ol><li> Preparazione del chelato siero fetale bovino Nota: Le cellule epiteliali sono molto sensibili al calcio quindi è fondamentale per controllare l&#39;esposizione di queste cellule al calcio. Al fine di garantire che le cellule non sono esposti al calcio durante la chelazione processo di isolamento è utilizzato per rimuovere eventuali residui di calcio dal siero fetale bovino utilizzato per la preparazione di tampone colorazione 29. Il seguente protocollo prepara circa 1 L di calcio senza siero fetale bovino richiesto per il FACS buffer di colorazione preparazione. <ol><li> Aggiungere 400 g di materiale chelante secca, es., Chelex, in un 4 L bicchiere e aggiungere acqua distillata H 2 O per un volume totale 4 L. coperchio e mescolare continuamente con un agitatore magnetico. </li><li> Regolare il pH a 7,4 con 10 N soluzione di HCl mescolando. Continuare agitazione per 20 min e ri-regolare il pH se necessario fino a pH rimane stabile per più di 20 min. </li><li> Incubare becher a 4 ° C per una notte per consentire al materiale chelante per formare un pellet compatta. Accuratamente aspirato H 2 O e aggiungere H fresca distillata 2 O ad un volume totale di 4 L. </li><li> Ripetere la regolazione del pH come al punto 1.1.2. </li><li> Porre il becher a 4 ° C per 1 ora per consentire al materiale chelante per formare un pellet compatta. Attentamente aspirato H 2 O. </li><li> Aggiungere lentamente due bottiglie da 500 ml di siero fetale bovino al materiale chelante. Mescolare lentamente a 4 ° C per 1 ora in modo che la velocità non produce bolle. </li><li> Porre il becher a 4 ° C per 1 ora per consentire al materiale chelante per formare bozzettoagire in pellet. </li><li> trasferire con attenzione il siero in bottiglia di vetro da 1 L e filtrare attraverso un filtro bottiglia top in condizioni sterili. Conservare il siero chelato a -20 ° C o utilizzare immediatamente. </li></ol></li><li> Preparazione di colorazione tampone <ol><li> Preparare 100 ml di 3% chelato FBS in PBS senza Ca 2+ e Mg 2+ e tenere in ghiaccio. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento dei follicoli piliferi dall&#39;epidermide adulti <ol><li> Anestetizzare topo, utilizzando 5% isoflurano utilizzando una scatola di induzione. Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato con 50-80 giorni di età i topi che sono in fase telogen del ciclo HF. </li><li> Euthanize topi secondo le procedure standard di laboratorio. Qui, eutanasia topi utilizzando CO 2 overdose in una camera di eutanasia. </li><li> Radersi tutti i capelli dalla pelle dorsale usando tagliatori elettrici. Evitare di testa e gli arti. Mantenere il tagliaunghie più vicino possibile alla pelle. Evitare di danneggiare la pelle e lo strato sottocutaneo. </li&gt; <li> Quando tutti i capelli viene rimosso, utilizzare il 70% di etanolo per rimuovere eventuali residui capelli e per disinfettare la pelle dorsale. </li><li> Posizionare il mouse su un pad dissezione, e l&#39;utilizzo di una pinza tirare la pelle vicino alla coda e fare una piccola scalfittura con le forbici. Tagliare l&#39;intera pelle dorsale in direzione posteriore-anteriore con attenzione tagliando via la pelle separandola dalla fascia. Evitare di danneggiare lo strato sottocutaneo. </li><li> Posizionare la pelle su una stuoia di dissezione, lato capelli rivolto verso il basso, e definire con precisione due bordi adiacenti della pelle per fissare in posizione. Delicatamente togliere il grasso, utilizzando un bisturi smussato fino a quando il derma è chiaro e pulito. Nota: quando raschiando il grasso, utilizzare pinze curve di applicare una leggera pressione sulla pelle. Applicare una pressione sulla pelle con il lato curvo di pinze. Ciò impedirà la pelle da strappo. </li><li> Posizionare la pelle, derma lato verso il basso, in 100 mm piatto di coltura sterili, e raddrizzare la pelle per garantire che non vi siano pieghe. Aggiungere 10 ml di PBS senza Ca 2+ </sup&gt; e Mg 2+ (PBS -) al piatto cultura e raddrizzare la pelle, se necessario. </li><li> Aspirare il PBS e aggiungere 10 ml di 0,25% tripsina. Assicurarsi che la pelle è spiegato ed è liberamente fluttuante. Incubare un pezzo di pelle per 10 ml di 0,25% tripsina. </li><li> Incubare i campioni a 37 ° C per 30-120 min o a 4 ° C durante la notte. </li></ol> 3. Preparazione della sospensione singola cella da follicoli piliferi <ol><li> Raschiare tutti i capelli fuori la pelle con pinze curve e un bisturi, in una anteriori alla direzione posteriore. Tenere la pelle al suo posto con il lato curvo di pinze e usare il bisturi per raschiare i capelli. Nota: Raschiare i capelli nella soluzione tripsina aggiunto al punto 2.8. Inizia la coda e seguire la direzione di crescita dei capelli. Raschiando contro la direzione della crescita dei capelli si tradurrà in una perdita sostanziale di HFS e riduzione del rendimento delle cellule. HF tendono ad aderire ciascun insieme e formare piccoli grumi; per ridurre the dimensioni dei cespi HF cercare di raschiare una piccola area alla volta. </li><li> Trasferire la pelle glabra di nuovo piatto cultura e aggiungere 10 ml di PBS - per evitare che si secchi. Ispezionare la pelle e togliere tutti i capelli rimanenti. </li><li> Abbattere le HF utilizzando un bisturi e pinze fino ad ottenere una sospensione singola HF. Vigorosamente triturare la sospensione HF utilizzando 10 ml pipetta per qualche minuto per rompere tutti i grumi di capelli. Nota: eseguire tutti i seguenti passaggi su ghiaccio. </li><li> Trasferire la sospensione HF in tubo pre-etichettati 50 ml. </li><li> Aspirare il PBS - dalla pelle e utilizzarla per lavare il piatto di coltura cellulare che conteneva la sospensione HF; trasferire al tubo 50 ml. </li><li> Lavaggio <ol><li> Filtrare la sospensione passando attraverso un filtro cella 70 micron montata su un tubo da 50 ml. Lavare il tubo 50 ml iniziale e il filtro con 10 ml di tampone colorazione (PBS - con 3% chelato FBS). </li><li> Filtrare la sospensione passandoa 40 micron colino cella montata su un tubo da 50 ml. Lavare il tubo con 5-10 ml di tampone colorazione per garantire che tutte le cellule sono state trasferite al nuovo tubo. Mantenere la sospensione in ghiaccio fino a quando tutti gli animali sono stati elaborati. </li><li> Centrifugare per 15 min a 300 xg a 4 ° C. surnatante attentamente aspirare senza disturbare il pellet e risospendere pellet in 5 ml di tampone colorazione. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 300 xg a 4 ° C. Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 800 ml di buffer di colorazione. Nota: I volumi di cui sopra è sufficiente per la colorazione cellule derivate da due topi adulti. </li></ol></li><li> Trasferimento sospensione in pre-etichettati FACS Tubes. <ol><li> Per i tubi controlli, prendere 25-50 ml di sospensione cellulare (o di qualsiasi residuo di sinistro dalla sospensione cellulare) e portare a un volume totale di 300 ml con tampone colorazione. Nota: Preparare le provette di controllo (volume totale 300 ml) per la senza macchia (senza anticorpie non DAPI); solo DAPI; Integrina β1; Integrina α6; SCA-1; CD34. </li></ol></li><li> Aggiungere gli anticorpi primari e DAPI (vedi tabella Materiali per diluizioni appropriate) alle concentrazioni desiderate al tubo appropriato. flick delicatamente i tubi per miscelare la sospensione cellulare. Rientro sul ghiaccio e coprire con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. </li><li> Incubare per 30 min in ghiaccio e delicatamente flick tubi ogni 10 minuti per garantire cellule sono tenuti in sospensione. </li><li> Lavare le cellule compilando ogni tubo FACS con tampone colorazione (circa 4 ml per provetta); centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 800 ml di buffer di colorazione. </li><li> Trasferire sospensione di cellule nel tubo FACS con tappi colino cella per garantire la sospensione singola cella. </li></ol> 4. Flusso Analisi Citometria <ol><li> Procedere alla separazione delle cellule immediatamente utilizzando un citofluorimetro con filtri appropriati per signal rilevamento. Utilizzare 405 nm viola (per le misurazioni di DAPI), 488 nm blu (per le misure di FSC, SSC, PE, PE-Cy7 e FITC) e 633 nm laser rossi (per l&#39;eccitazione di APC) Nota: Assicurarsi che lo strumento sta registrando da rilevatori per tutti e tre i canali fluorescenti. </li><li> cancelli Situato fluorescenza sulla base di campioni non colorati e la compensazione per la sovrapposizione spettrale che utilizzano singoli controlli macchiato. Nota: utilizzare i singoli controlli colorate per regolare la compensazione tra i canali in modo da eliminare qualsiasi sovrapposizione nei segnali fluorescenti. regolazione della compensazione dipende dal sorter FACS utilizzato. </li><li> Impostare porte principali sulla base di DAPI di escludere le cellule morte. </li><li> Regolare il grafico a dispersione (SSC-A vs FSC-A) per selezionare gli eventi di singoletto. </li><li> Impostare FSC e l&#39;altezza SSC e parametri di larghezza per eliminare per doppiette e discriminare gli eventi di singoletto. </li><li> cellule cancello con elevata α6 ed espressione β1 e da questa popolazione cellule cancello con entrambi i CD34 alta espressione o alta espressione Sca1. </li><li> cellule ordinarli in tubo FACS pre-etichettati. Nota: due popolazioni generali di cellule possono essere isolate; α6 + / β1 + / CD34 + / Sca-1 - e α6 + / + β1 / Sca-1 + / CD34 -. Cellule separate devono essere tenuti in ghiaccio in ogni momento fino a quando non vengono utilizzate applicazioni a valle come la cultura cellulare o l&#39;isolamento di RNA </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare

Il protocollo qui descritto è ben consolidata per isolare HFSCs dalla pelle dorsale di topi adulti, ma può essere ugualmente applicata per l&#39;isolamento di altre popolazioni all&#39;interno della struttura HF, basato sulla selezione dei marcatori 2,16,23,28,29. Questo metodo è notevolmente vantaggioso rispetto ad altri metodi di isolamento cellulare, come la dissociazione dei tessuti, dal fatto che un tipo di cellula specifico può essere selezionato e raccolto da una miscela di popolazioni cellulari eterog...

Le cellule staminali adulte (SCS) sono essenziali per mantenere l&#39;omeostasi tissutale, sostituendo le cellule che muoiono e riparare tessuti danneggiati su lesioni. Questi SC sono definite dalla loro capacità di subire un continuo auto-rinnovamento e di differenziarsi in varie linee cellulari 1-3. I sistemi più studiati, che dipendono SCs adulti per il rifornimento, includono il sistema ematopoietico, l&#39;intestino ed il 1,2,4 pelle. Durante l&#39;embriogenesi, la pelle inizia come un singolo strato di cellule epidermiche. Morfogenesi del follicolo pilifero (HF) inizia quando le cellule mesenchimali popolano la pelle e formano un sottostante derma collagene 5. Specializzato cellule mesenchimali, che poi costituiscono la papilla dermica (DP), organizzano direttamente sotto lo strato epidermico e stimolano l&#39;epitelio di formare placodi capelli che iniziano a crescere verso il basso 6. Altamente cellule proliferanti della matrice, situato nella parte inferiore del HF,busta queste cellule mesenchimali e formare il bulbo pilifero, mentre lo strato interno comincia a differenziarsi in cilindri concentrici per formare il fusto del capello (HS) e nelle vicinanze della guaina interna della radice (IRS) 2,3. Nella vita postnatale l&#39;epidermide della pelle è composta da tre vani: l&#39;epidermide interfollicolare (IFE), la ghiandola sebacea (SG) e l&#39;HF. In contrasto con la IFE e SG che sono in un costante stato di omeostasi, l&#39;HF è un mini-organo dinamico che subisce continui cicli di crescita (anagen), la distruzione (catagen) e di riposo (telogen) 4,7. Le cellule staminali del follicolo pilifero (HFSCs) che il carburante questo ciclo perpetuo, risiedono in una nicchia specializzata all&#39;interno della HF conosciuto come il rigonfiamento 4. Durante anagen i HFSCs uscire dal rigonfiamento, a seguito di segnali di attivazione dal DP, iniziare proliferare e scendere verso il basso creando così una lunga scia lineare di cellule conosciute come la guaina esterna radice (ORS) 8-10. Le celle di matrice, checircondare il DP alla base della HF, rapidamente ciclo e migrare verso l&#39;alto subire differenziazione terminale generando l&#39;HS e l&#39;IRS 10 (Figura 1). La durata di anagen determina la lunghezza dei capelli e dipende dalla capacità proliferativa e la differenziazione delle cellule della matrice 6. Quando l&#39;HF entra catagen, le celle di matrice transito di amplificazione nel bulbo cessano di proliferare, apoptosi e regrediscono completamente tirando la DP verso l&#39;alto fino a raggiungere la parte non bicicletta della HF 8,11. Durante questa retrazione HF forma una struttura temporanea noto come il filamento epiteliale, che è caratteristica di catagen, e contiene molte cellule apoptotiche. Nei topi, catagen dura tra 3-4 giorni ed è altamente sincronizzato nel primo ciclo del capello. Quando la HF raggiunge telogen tutti HFSCs diventano quiescenti. Le fasi distinte del ciclo HF sono inoltre caratterizzati da cambiamenti nel colore della pelle del topo causa mla produzione elanin. I cambiamenti della pelle dal nero durante anagen al grigio scuro durante catagen al rosa durante telogen 6,7,12,13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig1.jpg" /> Figura 1: Il ciclo dei capelli follicolo. Il HF è composto da una parte superiore permanente e una porzione ciclismo inferiore costantemente rimodellamento che subisce continui cicli di rapida crescita (anagen), la distruzione (catagen) e una fase di quiescenza parente o di riposo (telogen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53931/53931fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.</a> SCS mantenendo la HF sono stati inizialmente identificati utilizzando esperimenti Chase, con timidina triziata, che ha rivelato una popolazione di cellule di sostegno etichette ciclismo lento (LRC) che risiedevano nella regione permanente del HF appena sotto la SG 14. I progressi nella HFSCCaratterizzazione rivelato un piccolo numero di marcatori che possono essere utilizzati per identificare e isolare SCs specifici dalla nicchia HF 15. Forse il miglior marcatore per l&#39;arricchimento di HFSCs è CD34, un marker superficie cellulare anche identificato come un marcatore SC ematopoietiche negli esseri umani 16. All&#39;interno di questo CD34 + popolazioni due distinte popolazioni sono stati anche isolati sulla base di espressione α6 integrina 2. Un altro indicatore è la cheratina 15 (K15), che è altamente espresso nella regione bulge, co-localizza con espressione CD34 e un promotore K15 viene utilizzato per il targeting e isolare HFSCs in animali transgenici 15,17-19. Negli ultimi dieci anni sono stati segnalati anche diversi altri distinte popolazioni di HFSCs e cellule progenitrici di risiedere all&#39;interno del HF 17,20-27. Una caratteristica interessante aggiuntiva di HFSCs è il loro contributo alla riparazione della pelle. In condizioni normali HFSCs ricostituire l&#39;HF e non prendono parte a IFE omeostasi. However, in risposta a ferita, queste cellule uscire la loro nicchia SC e di aiuto nel ripopolare l&#39;IFE 9. Abbiamo recentemente dimostrato che i topi cancellati per il display gene Sept4 / ARTS pro-apoptotica un aumento del numero di CD34, K15 e Sox9 + HFSCs, che dimostrano una resistenza all&#39;apoptosi. HFSCs sono stati isolati da Sept4 / ARTS - / - pelli dorsali utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) e c&#39;era più di due volte maggiore del numero di cellule CD34 + e K15 + HFSCs. Questi Sept4 / arte - / - HFSCs sono state espanse in vitro e non hanno dato luogo a solo più colonie, ma sono stati anche in grado di resistere a condizioni più severe rispetto ai controlli 28. Come risultato di avere un maggior numero di HFSCs, Sept4 / arte - / - mice guarite significativamente più veloce in risposta alle lesioni asportazione della pelle. Sorprendentemente, Sept4 / arte - / - mice displayeda gran numero di HF rigenerate dal letto della ferita, e cicatrici significativamente più piccoli. Inoltre, i topi cancellati per XIAP (inibitore della X-linked di apoptosi), il target biochimico di ARTI, hanno dimostrato ridotta guarigione 28. I nostri risultati e il lavoro svolto in altri laboratori hanno dimostrato che HFSCs servire come un modello ideale per lo studio della biologia e della funzione della SCS adulti. Qui, descriviamo la metodologia per l&#39;arricchimento e l&#39;isolamento di HFSCs e cheratinociti epidermici in base alla espressione di quattro marcatori: α6 integrina; β1 integrine; Sca-1 (un marker per cheratinociti epidermici) e CD34. Isolamento analogo di K15 + HFSCs può essere eseguita anche con il giornalista del mouse K15-GFP 19.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>Terapia intensiva primordiale</td><td>&nbsp; 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Anidride carbonica</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio elettrico</td><td>Oster&nbsp;</td><td>Golden A5</td><td>Shaver di qualsiasi altra azienda potrebbe essere utilizzato</td></tr><tr><td>al 70% di etanolo</td><td>Gadot Lab</td><td>830000051</td><td>al 96% di ehtanol diluito con acqua distillata.</td></tr><tr><td>Tappetino</td><td></td><td></td> di dissezione Gli <td>strumenti di dissezione di qualsiasi fornitore possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td>Foreceps di qualsiasi altra azienda possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>Forbici&nbsp;</td><td>Dumont</td><td>14094-11</td><td>Si potrebbero usare forbici di qualsiasi altra azienda</td></tr><tr><td>Aghi/Perni</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Albion</td><td>10</td><td>Assicurarsi che il bisturi abbia un'estremità smussata</td></tr><tr><td>Piatto di coltura tissutale 60 mm x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>PBS-In</td><td></td><td></td> <td>house PBS senza calcio e magnesio</td></tr><tr><td>0,25% tripsina/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-050-1A</td><td>La tripsina ottenuta da un'azienda diversa potrebbe avere un'attività diversa e la durata del digestato della tripsina deve essere regolata di conseguenza</td></tr><tr><td>Pipette 10 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4488</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>50 ml provette da centrifuga sterili</td><td>Minplast Ein-shemer</td><td>35050-43</td><td></td></tr><tr><td>70 &; m Filtro cellulare</td><td>Fisher</td><td>22362548</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Filtro cellulare</td><td>Fisher</td><td>22362549</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di colorazione-Centrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Eppendorf 5804 R</td><td>5805 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Provette FACS con tappi filtro cellulare&nbsp;</td><td>Falco</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>tubi FACS&nbsp;</td><td>Falco</td><td></td><td></td>352063</tr><tr><td>Integrina & beta; 1</td><td>eBioscience</td><td>25-0291</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Integrina &alfa; 6</td><td>eBioscience</td><td>15-0495</td><td>1:600</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>eBioscience</td><td>11-5981</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>eBioscience</td><td>9011-0349</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Bicchiere Chelex</td><td>BioRad</td><td>142-2842</td><td></td></tr> secco<tr><td>&nbsp;</td><td>H</td><td></td>2O&nbsp distillato in pirex<td></td></tr><tr><td>.</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NHCl</td><td>BioLab</td><td>1903059</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Beit Haemek Biological Industries</td><td>400718</td><td>FBS ottenuto da un'altra azienda può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Flacone di vetro da 1 litro</td><td>Ilmabor</td><td>Boro 3.3</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per flacone</td><td>Autofil</td><td>1102-RLS</td><td></td></tr></tbody></table>

isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Il follicolo pilifero (HF) è un sistema ideale per studiare la biologia e la regolazione delle cellule staminali adulte (SC). Questo mini organo dinamico è rifornito da pool distinti di SC, che si trovano nella parte permanente dell'HF, una regione nota come rigonfiamento. Queste SC multipotenti sono state inizialmente identificate come cellule di ritenzione dell'etichetta a ciclo lento; tuttavia, il loro isolamento è stato reso possibile dopo l'identificazione di specifici marcatori cellulari, come il CD34 e la cheratina 15 (K15). Qui, descriviamo un metodo robusto per isolare le SC di rigonfiamento e i cheratinociti epidermici dagli HF di topo utilizzando la tecnologia di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Le SC isolate del follicolo pilifero (HFSC) possono essere utilizzate in vari modelli di innesto in vivo e sono un prezioso modello in vitro per studiare i meccanismi che regolano la multipotenza, la quiescenza e l'attivazione.

Questo protocollo descrive in dettaglio l&#39;arricchimento e l&#39;isolamento di due tipi di popolazioni:. Rigonfiamento SC e cheratinociti epidermici Figura 2 illustra le principali fasi del protocollo. Utilizzando pelle rimossa dalla dorsale posteriore di 8 settimane di età topi, abbiamo arricchito SC rigonfiamento utilizzando il marcatore CD34, che si esprime solo in HFSCs; e Sca-1, che le etichette cheratinociti epidermici. La figura 3 mostra divers...

Un modello ideale per studiare la biologia delle cellule staminali adulte è il follicolo pilifero del topo. Qui presentiamo un protocollo per isolare diverse popolazioni di cellule staminali dei follicoli piliferi e cheratinociti epidermici, impiegando la digestione enzimatica della pelle dorsale del topo seguita dall'analisi FACS.

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare diverse popolazioni di cellule staminali e cheratinociti epidermici dalla pelle dorsale del topo. Questo protocollo consente all'utente di isolare contemporaneamente più popolazioni cellulari dalla pelle dorsale del topo. I principali vantaggi di questa tecnica sono la rapidità, l'affidabilità e la possibilità di isolare tipi cellulari specifici di interesse da una miscela di popolazioni cellulari cutanee eterogenee.La procedura sarà dimostrata dal dottor Yahav Yosefzon del mio laboratorio. Iniziare utilizzando un rasoio elettrico per rimuovere tutti i peli della pelle dorsale da un topo di età compresa tra 50 e 80 giorni in fase telogen del ciclo del follicolo pilifero, tenendo il rasoio il più vicino possibile alla pelle senza danneggiare lo strato cutaneo e sottocutaneo. Successivamente, utilizzare etanolo al 70% per disinfettare la pelle ed eliminare eventuali residui di pelo.Posizionare il topo su un vetrino da dissezione. Quindi utilizzare una pinzetta per sollevare la pelle vicino alla coda e praticare un'incisione nella pelle con le forbici. Per prelevare l'intera pelle dorsale, tagliare con attenzione il tessuto in direzi

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui mostriamo il nostro metodo per isolare il mouse epidermiche cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC). Tecnica prevede micro-dissezione follicoli baffi, isolando il rigonfiamento e placeing in colture di tessuti. EPI-NCSC iniziano a emigrare da espianti rigonfiamento sul substrato entro 3 - 4 giorni.

Topo Epidermal cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC) Culture

Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

Tessuto-specifica analisi di un modello di rigenerazione del follicolo usando lentivirus mediare guadagno o perdita di funzione.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Il mouse in continua crescita incisivo fornisce un modello per lo studio rinnovamento dei tessuti dentali da cellule staminali epiteliali dentali (desc). Un sistema robusto per modo coerente e affidabile l'ottenimento di tali cellule dal incisivo e in espansione in vitro è riportato qui.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Il comportamento dei fibroblasti è alla base di uno spettro di entità cliniche, ma rimangono scarsamente caratterizzate, in gran parte a causa della loro intrinseca eterogeneità. La ricerca tradizionale sui fibroblasti si basa sulla manipolazione in vitro, mascherando il comportamento dei fibroblasti in vivo. Descriviamo un protocollo basato su FACS per l'isolamento di fibroblasti cutanei di topo che non richiede colture cellulari.

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

I cheratinociti epidermici formano una barriera cutanea funzionale e sono posizionati nella prima linea di difesa dell'ospite contro gli insulti ambientali esterni. Qui descriviamo i metodi per l'isolamento e la coltura primaria di cheratinociti epidermici dalla cute del neonato e dell'adulto, e l'induzione della differenziazione dei terminali e la risposta infiammatoria innescata da UVB da cheratinociti.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i cheratinociti epidermici dalla pelle dorsale dei topi adulti per una varietà di applicazioni a valle come la biologia molecolare, la biochimica, lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza e gli usi primari in vitro (ad esempio, clonogenici cheratinociti).

Isolamento dei Keratinociti Epidermimi del topo e della loro cultura clonogenica in vitro

Questo protocollo descrive come isolare i cheratinociti cutanei dai modelli murinari, per macchiare con anticorpi con tag metallici e analizzare le cellule colorate per citometria di massa al fine di profilare il modello di espressione delle proteine di interesse nelle diverse fasi del ciclo cellulare.

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di cheratinociti orali derivati dal palato del topo adulto. Viene anche riportato un metodo di valutazione che utilizza l'immunocolorazione.

Isolamento e coltura di cheratinociti orali primari dal palato del topo adulto

Lo studio della guarigione delle ferite associata a lesioni muscoloscheletriche richiede spesso la valutazione delle interazioni in vitro tra cellule di Schwann (SC), cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo descrive l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione di queste cellule primarie dal prepuzio umano.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

Impara a isolare cellule staminali del follicolo pilifero e cheratinociti epidermici dalla pelle dorsale del topo. Questo metodo utilizza digestione enzimatica e analisi FACS per studiare la biologia delle cellule staminali adulte.

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

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