Visualizzazione dei Vascolare e parenchimale rigenerazione dopo il 70% epatectomia parziale in topi normali

Visualizzazione della rigenerazione vascolare e parenchimale dopo epatectomia parziale al 70% in topi normali. Tradizionalmente, la rigenerazione epatica viene valutata misurando l'aumento del peso e del volume del fegato e determinando il tasso di proliferazione degli epatociti. Al giorno d'oggi, siamo interessati alla rigenerazione vascolare del fegato nei topi e vogliamo visualizzare e quantificare la crescita vascolare.

Pertanto, stabiliamo il flusso di lavoro per l'imaging della rigenerazione vascolare. Il flusso di lavoro consiste in quattro fasi: contrasto dell'albero vascolare, acquisizione di scansioni TC, ricostruzione 3D e analisi quantitativa e qualitativa delle immagini risultanti. Il flusso di lavoro inizia con il contrasto dell'albero vascolare.

Per prima cosa esponiamo il fegato, sia normale che resecato, quindi iniettiamo il composto di contrasto siliconico polimerizzante nella vena porta o nella vena epatica, a seconda del sistema vascolare di interesse. Successivamente, i fegati espiantati vengono sottoposti a scansione in una MicroCT. Dopo la scansione, eseguiamo una ricostruzione vascolare 3D utilizzando il software preclinico Imalytics.

Se la qualità tecnica delle immagini risultanti è sufficientemente buona, la ricostruzione 3D può essere eseguita utilizzando HepaVision. Questo programma viene utilizzato nelle cliniche per la pianificazione della chirurgia epatobiliare. Oltre alla visualizzazione 3D dell'albero vascolare, questo programma consente la visualizzazione e il calcolo del volume epatico, del fegato totale e di ciascun lobo, in base ai vasi di alimentazione e drenaggio.

Dopo la ricostruzione, possiamo determinare ulteriori parametri indicativi della crescita vascolare come la lunghezza e il diametro di un vaso specifico con l'aiuto di tecniche computazionali. Ciò consentirà una descrizione quantitativa della crescita vascolare. D'altra parte, i campioni di Microfil fissati in formalina possono essere tagliati in sezioni seriali.

Le sezioni seriali possono essere colorate e digitalizzate utilizzando uno scanner per vetrini interi. Dopo la registrazione rigida ed elastica delle sezioni seriali, è possibile ricostruire gli alberi vascolari 3D di entrambi i sistemi venoso portale ed epatico. In una fase futura, vogliamo esplorare la distribuzione spaziale degli eventi molecolari.

Un esempio di evento molecolare di interesse nella rigenerazione epatica è la comparsa del marcatore di proliferazione Ki-67 nei nuclei degli epatociti e la sua distribuzione spaziale negli alberi vascolari ricostruiti in 3D. Successivamente, forniremo un'introduzione dettagliata su come eseguire l'iniezione di Microfil. Preparazione dei reagenti.

Per la miscela di composti Microfil, abbiamo bisogno di diluente MV, composto MV, nel nostro caso, il blu MV-120 e agente indurente. Abbiamo anche bisogno di pipette, tubo e un pipettatore. Preparare due millilitri di MV-120 in un tubo da cinque millilitri.

Quindi diluirlo aggiungendo tre millilitri di diluente MV. Mescolatele agitando delicatamente. Per la soluzione salina di eparina, aggiungere 1 millilitro di eparina in 10 millilitri di soluzione fisiologica.

Preparazione del tavolo operatorio. In primo luogo, abbiamo bisogno di un microscopio, in secondo luogo, è necessario un set di materiali di consumo. Suture 6-0 in seta e 6-0 in polipropilene, siringhe da cinque millilitri e un millilitro, aghi da 30 e 21 calibri, tubo di prolunga per il collegamento di siringa e catetere, catetere da 26 gradi con inserimento dell'ago, punte di cotone e garza.

In terzo luogo, sono necessari strumenti chirurgici. Micro strumenti, pinze e coagulatore elettrico. In quarto luogo, è necessaria una pompa di perfusione.

Preparazione dell'animale. Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia e anestetizzare il topo con isoflurano al 2% e 0,3 millilitri al minuto di ossigeno. Fissare il mouse anestetizzato sul tavolo operatorio utilizzando dei nastri, con inalazione continua di isoflurano al 2% e 0,3 millilitri al minuto di ossigeno.

Iniezione di microfil, sistema venoso portale. Praticare un'incisione trasversale sull'addome utilizzando le forbici per lo strato cutaneo e un coagulatore elettrico per lo strato muscolare. Spostare l'intestino sul lato sinistro usando punte di cotone e coprire l'intestino con una garza imbevuta di soluzione salina.

Sezionare la vena porta al microscopio. Posizionare la sutura di seta 6-0 sotto la vena porta epatica extra a una distanza di circa un millimetro dalla sua biforcazione. Legalo senza stringere per un uso successivo.

Iniettare la soluzione salina di eparina attraverso una vena del pene per l'eparinizzazione sistemica per cinque minuti. Questa animazione dimostrerà la procedura di inserimento del catetere. Innanzitutto, posizionare la sutura di seta 6-0 sotto la vena porta epatica extra, quindi inserire il catetere calibro 26 nella vena porta e fissarlo utilizzando un morsetto.

Legare la sutura pre-posizionata per fissare il catetere e bloccare il flusso sanguigno dalla vena splenica e dalla vena mesenterica. Qui dimostreremo la procedura chirurgica. Inserire il catetere calibro 26 con l'ago.

Inserire ulteriormente il catetere e allo stesso tempo estrarre lentamente l'ago. Fissare il catetere utilizzando una pinza. Riempire completamente il catetere con una soluzione salina di eparina per evitare bolle d'aria.

Collegare il tubo di prolunga al catetere e fissarli saldamente. Accendere la pompa di perfusione. Avviare la perfusione salina con eparina con una portata di 0,4 millilitri al minuto.

Osservare i lobi destri che diventano pallidi subito dopo la perfusione. Sciacquare il fegato con soluzione salina per mantenerlo umido durante l'intera procedura di perfusione. Eutanasia del topo mediante dissanguamento tramite perfusione in anestesia.

Continuare la perfusione di eparina per diversi minuti fino a quando l'intero fegato diventa pallido. Prima della perfusione Microfil, aggiungere 0,1 millilitri di agente indurente al composto Microfil preparato per accelerare la procedura di polimerizzazione. Caricare il composto Microfil in una siringa da cinque millilitri e in un tubo di prolunga.

Elimina le bolle d'aria iniettando la soluzione salina di eparina nel catetere, come prima. Collegare il tubo con il catetere e fissarlo saldamente. Iniziare l'iniezione di Microfil con una portata di 0,2 millilitri al minuto per circa uno o due minuti.

Osserva l'agente blu che si diffonde lentamente nei rami della vena porta. Arrestare la perfusione quando la struttura dei vasi blu appare sulla superficie di ciascun lobo del fegato come indicato da un cerchio rosso. Lasciare il fegato per almeno 15 minuti per la polimerizzazione del composto Microfil.

Iniezione di microfil, sistema venoso epatico. La procedura segue sostanzialmente gli stessi passaggi dell'iniezione nel sistema venoso portale. Posizionare una sutura di seta 6-0 sotto la vena porta epatica extra a una distanza di circa un millimetro dalla sua biforcazione.

Quindi inserire un catetere nella vena porta e fissarlo tramite morsetto. Inserire un altro catetere nella vena cava inferiore e fissarlo con una pinza. Legare la sutura pre-posizionata per fissare il catetere e bloccare il flusso sanguigno dalla vena splenica e dalla vena mesenterica.

Posizionare una pinza sulla vena cava inferiore sopraepatica per ostruire il deflusso del fegato. Rami ligati della vena cava inferiore, comprese entrambe le vene renali e l'estremità distale della vena cava inferiore. Lavare il fegato usando una soluzione salina di eparina tramite catetere uno.

Perfondere il sistema venoso epatico con il composto Microfil tramite il catetere due. Risultati, ricostruzione Micro CT. Abbiamo ottenuto ricostruzioni vascolari 3D utilizzando il software preclinico Imalytics dopo la scansione Micro CT.

La rigenerazione vascolare sia nel sistema portale che in quello venoso epatico è apparsa come allungamento e allargamento delle principali strutture vascolari in combinazione con una ramificazione dei vasi più piccoli. Il secondo giorno post-operatorio, gli alberi vascolari dei lobi rimanenti si allungavano. Entro il settimo giorno post-operatorio, sono diventati visibili ulteriori piccoli rami della stessa vena porta principale e della vena epatica.

Risultati, ricostruzione 3D con codice colore dell'albero vascolare epatico e dei territori epatici dipendenti. Ogni lobo del fegato è stato facilmente visualizzato in tutte e tre le dimensioni dopo la ricostruzione codificata a colori da HepaVision. Come indicato nella tabella, i volumi epatici del fegato totale e di ciascun lobo sono stati determinati, come mostrato qui, per il sistema venoso epatico di un fegato normale.

Risultati, sezioni seriali e ricostruzione. D'altra parte, il campione di Microfil fissato in formalina è stato sottoposto a sezionamento seriale. Le sezioni seriali colorate sono state digitalizzate utilizzando uno scanner per vetrini interi e utilizzate per la ricostruzione dell'albero vascolare di entrambi i sistemi.

Si tratta di sezioni trasversali di una pila di sezioni seriali di fegato di topo prima e dopo la registrazione rigida ed elastica. Dopo la registrazione al computer, i sistemi venoso portale e venoso epatico possono essere ricostruiti in un unico modello 3D. Questo passaggio manuale e computazionale, che richiede molto tempo, richiede un'ulteriore ottimizzazione.

Il prossimo passo, vale a dire la visualizzazione della distribuzione spaziale degli eventi molecolari rispetto agli alberi vascolari, è attualmente in fase di sviluppo. Questo passaggio può essere immaginato come una fusione delle informazioni Micro CT derivate dall'albero vascolare contrastato con le informazioni istologiche o come una visualizzazione 3D di informazioni puramente istologiche. In questo caso, le informazioni della Micro CT servirebbero come controllo di qualità per l'impegnativa ricostruzione 3D basata sull'istologia.

Una volta raggiunto, abbiamo uno strumento per studiare meglio la rigenerazione del fegato. In particolare la distribuzione spaziale degli eventi molecolari e il parenchima epatico rispetto alla rigenerazione vascolare.