Name: Visualizzazione dei Vascolare e parenchimale rigenerazione dopo il 70% epatectomia parziale in topi normali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Scopri un workflow per visualizzare la rigenerazione vascolare epatica nei topi dopo epatectomia parziale. Questo metodo utilizza micro-CT e ricostruzione 3D per analizzare la crescita dei vasi sanguigni.

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Gli autori riconoscono il finanziamento da parte del Ministero tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF) tramite la rete di biologia dei sistemi "Virtual Liver", numero di sovvenzione 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS). Gli autori ringraziano anche Frank Schubert per il supporto tecnico.

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Germania. Poiché il sistema venoso portale è stato visualizzato separatamente dal sistema venoso epatica, erano necessari animali separate per i diversi alberi vascolari. 1. Reagenti Preparazione <ol><li> soluzione di eparina-salina <ol><li> Aggiungere 0,1 ml di eparina in 10 ml di soluzione salina (5 IU / ml). </li></ol></li><li> miscela composta silicone <ol><li> Aggiungere 2 ml di MV-120 in una provetta da 5 ml. Diluire MV-120 con l&#39;aggiunta di 3 ml MV diluente per ottenere una soluzione al 40%. </li></ol></li></ol> Iniezione 2. Portal venosa silicone sistema <ol><li> La laparotomia <ol><li> Posizionare il mouse nella camera di induzione dell&#39;anestesia e anestetizzare con 2% isoflurano e 0.3 L / min di ossigeno. </li><li> Fissare il mouse anestetizzato sul tavolo operatorio con del nastro con l&#39;inalazione continua del 2% èoflurane e 0.3 L / min di ossigeno. Controllare il toe-pinch ritiro riflesso del mouse e avviare il funzionamento se il riflesso è assente. </li><li> Effettuare una incisione trasversale sull&#39;addome con le forbici per lo strato di pelle e un coagulatore elettrica per lo strato muscolare. Spostare gli intestini verso il lato sinistro con punte di cotone e coprire l&#39;intestino con soluzione salina garza imbevuta. </li></ol></li><li> inserimento del catetere <ol><li> Sezionare vena porta al microscopio utilizzando micro-pinza. Posizionare un 6-0 sutura seta sotto la vena porta extraepatica, in circa 1 mm a distanza la sua biforcazione e legarlo liberamente per un uso successivo. </li><li> Iniettare soluzione preparata eparina-salina attraverso pene vena (maschio) o vena cava inferiore (femmina) per eparinizzazione sistemica per 5 min. </li><li> Inserire il 26-gauge (26 G) catetere con ago nella vena porta e fissarlo con una fascetta </li></ol></li><li> Eparina-soluzione salina e composti di silicone perfusione <ol><li> Carico eparina-salino solution in siringa da 5 ml e accendere dispositivo di perfusione. Riempire il catetere completamente con la soluzione salina eparina per evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Collegare tubo di prolunga al catetere e fissarli saldamente. Inizia perfusione eparina-salina con un tasso di perfusione di 0,4 ml / min. </li><li> Legare sutura 6-0 seta pre-posizionato per doppia fissa il catetere e bloccando il flusso di sangue dalla vena splenica e vena mesenterica. L&#39;eutanasia il mouse per dissanguamento mediante perfusione sotto anestesia. </li><li> Risciacquare fegato utilizzando salina durante l&#39;intera procedura di perfusione per mantenerlo umido. </li><li> Aggiungere 0,1 ml Catalizzatore nel tubo MV-120. Cambiare siringa eparina-salina per la siringa in silicone. </li><li> Inizia perfusione silicone con un tasso di perfusione di 0,2 ml / min per circa 1 min per precompilare il sistema catetere e per riempire il sistema della vena porta. Smettere di perfusione silicone quando i vasi sulla superficie diventano blu. </li></ol></li><li> campionatura <ol><li> Mantenere il fegato in situ untIl silicone è completamente polimerizzato dopo circa 15 a 30 min. Sezionare i legamenti che collegano il fegato e gli organi adiacenti con cura per mantenere intatto il fegato. Espiantare il fegato e metterlo in formalina per il fissaggio. </li></ol></li></ol> Iniezione 3. epatica venosa silicone sistema <ol><li> Eseguire laparotomia come eseguito nella fase 2.1 e completamente esposti campo operatorio. </li><li> inserimento del catetere <ol><li> Sezionare vena porta al microscopio utilizzando micro-pinza. Posizionare un 6-0 sutura seta sotto la vena porta extraepatica, in circa 1 mm a distanza la sua biforcazione e legarlo liberamente per un uso successivo. </li><li> Iniettare soluzione preparata eparina-salina attraverso pene vena (maschio) o vena cava inferiore (femmina) per eparinizzazione sistemica per 5 min. </li><li> Inserire un catetere 26 G (catetere 1) con ago nella vena porta e fissarlo con una fascetta. Inserire un altro 26 G catetere (catetere 2) con l&#39;ago in vena cava inferiore e fissarlo con una fascetta. </li><li> Legare i rami di vena cava inferiore (tra cui vene renali sinistro e destro) e la sua estremità distale utilizzando 6-0 sintetici, monofilamento, non assorbibile sutura in polipropilene. </li></ol></li><li> Eparina-soluzione salina e composti di silicone perfusione <ol><li> Caricare soluzione di eparina-salina in siringa da 5 ml e accendere dispositivo di perfusione. Riempire il catetere 1 completamente con la soluzione salina eparina per evitare bolle d&#39;aria. Collegare tubo di prolunga al catetere 1 e fissarlo saldamente. Inizia perfusione eparina-salina ad una velocità di 0,4 ml / min. </li><li> Legare sutura 6-0 seta pre-posizionato per doppia fissa il catetere e bloccando il flusso di sangue dalla vena splenica e vena mesenterica. L&#39;eutanasia il mouse per dissanguamento mediante perfusione sotto anestesia. </li><li> Risciacquare fegato utilizzando salina durante l&#39;intera procedura di perfusione per mantenerlo umido. Aggiungere 0,1 ml Catalizzatore nel tubo MV-120. Scambio eparina-salino siringa con la siringa in silicone. </li><li> Posizionare un morsetto sul suprahepatic vena cava inferiore per ostacolare il deflusso del fegato. </li><li> Collegare il tubo di estensione per catetere 2 e iniziare perfusione silicone con un tasso di perfusione di 0,2 ml / min per circa 2 minuti per raggiungere un volume vascolare epatica obiettivo come riportato. Smettere di perfusione silicone quando i vasi sulla superficie diventano blu. </li></ol></li><li> campionatura <ol><li> Sezionare i legamenti epatici evitando qualsiasi danno al fegato. Espiantare il fegato e metterlo in formalina per il fissaggio. </li></ol></li></ol> 4. Micro-CT (μCT) Scansione Per eseguire la scansione del campione di fegato espiantato utilizzando μCT, sono necessari i seguenti passaggi. <ol><li> Prelevare il campione fegato dalla soluzione di fissaggio. Posizionare il fegato sul letto μCT. Mettere il letto μCT con il campione di fegato nel μCT. </li><li> Acquisire topogram prima di avviare la scansione. Utilizzare uno subscan per il campione di fegato piccolo e due subscans per grandi campioni. </li><li> Seleziona un81; protocollo CT ad alta risoluzione (ad esempio, HQD-6565-390-90). Questo protocollo acquisisce 720 proiezioni con 1.032 x 1.012 pixel durante una rotazione completa con il tempo di scansione di 90 secondi per ogni sub-scan. Avviare la scansione μCT. </li></ol> 5. istologiche sezioni seriali <ol><li> Incorporare il campione del fegato in paraffina nel suo complesso dopo la scansione μCT. Tagliare intero campione paraffina in sezioni 4μm, risultante in una serie di 2.000 a 2.500 sezioni. </li><li> sezioni macchia con tecnica di colorazione appropriata per visualizzare eventi molecolari di interesse come Ki-67 come marker di proliferazione e HMGB1 come marker di danno ischemico. Determinare sequenza di colorazione rispetto alla questione scientifica. </li><li> Utilizzare uno scanner intera diapositiva per digitalizzare le sezioni colorate. </li><li> Eseguire 3D-ricostruzione dell&#39;albero vascolare (s) (già possibile) e visualizzare 3D-distribuzione di eventi molecolari rispetto nell&#39;albero vascolare (ricerca in corso). </li></ol>

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<li>Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+vasculature+for+liver+surgical+planning%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.Med.Imaging%22%5BJournal%5D)">Analysis of vasculature for liver surgical planning.</a> IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).</li>
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<li>Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+systemic+and+hepatic+hemodynamic+parameters+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice.</a> J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Contrasto dell&#39;albero vascolare mediante iniezione di silicone e scansione μCT è stata introdotta in modelli tumorali e modelli di malattie neurologiche frequentemente per studiare la progressione angiogenico 5,7,8,10. Miglioramenti nella metodologia di iniezione di silicone sono state fatte in questo studio per la visualizzazione e la quantificazione di crescita vascolare dopo epatectomia parziale in topi. Ci sono un certo numero di passaggi critici che richiedono attenzione ...

Rigenerazione epatica è spesso determinato misurando l&#39;aumento del peso del fegato e del volume e valutando il tasso di proliferazione epatociti 16. Tuttavia, la rigenerazione del fegato è non solo induce la rigenerazione parenchimale ma anche la rigenerazione vascolare 6. Pertanto, crescita vascolare debbano esaminare ulteriormente rispetto al suo ruolo nella progressione della rigenerazione epatica. La visualizzazione del sistema vascolare epatico è fondamentale per far progredire la nostra comprensione della rigenerazione vascolare. Numerosi metodi indiretti sono stati sviluppati per studiare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione vascolare epatico. Tradizionalmente, l&#39;individuazione di citochine (fattore di crescita vascolare endoteliale, VEGF) 14, chemochine ei loro recettori (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) 4 sono stati il pilastro per studiare la rigenerazione vascolare. Tuttavia, un modello 3D insieme con l&#39;analisi quantitativa del sistema vascolare aggiungerebbe anatomica criticainformazioni per ottenere una migliore comprensione del rapporto importante tra la parenchima epatico e la rigenerazione vascolare. Per visualizzare il sistema vascolare epatica, che richiede contrasto alberi vascolari, i topi sono stati iniettati con un agente di contrasto radiopaco gomma siliconica direttamente nel portale o dell&#39;albero vascolare venosa epatica. Dopo la polimerizzazione del silicone e espianto dell&#39;organo, i campioni di fegato sono stati sottoposti a scansione μCT utilizzando uno scanner CT. Le scansioni hanno portato nelle rappresentazioni di immagini voxel del silicone-iniezione esemplari 9. Per controllo di qualità, il sistema vascolare è stato visualizzato in 3D utilizzando il software preclinico. Segmentazione stata eseguita impostando una soglia tra l&#39;intensità tessuto molle e l&#39;intensità nave. La maschera nave risultante è stato visualizzato usando il rendering di superficie. Il software ha permesso anche di determinare manualmente la due parametri di vasculla crescita ar: lunghezza dell&#39;imbarcazione massima e raggio. Un software preclinico è stato poi utilizzato per la ricostruzione 3D di alberi vascolari e successivo calcolo dei forniscono o drenanti territori vascolari 13. Inoltre, questo software determinato automaticamente alcuni parametri di crescita vascolare, come la lunghezza totale di tutte le strutture vascolari visibili noto anche come la lunghezza bordo o il volume totale del serbatoio. La procedura di perfusione silicone è stata eseguita in topi naive e nei topi che hanno subito il 70% epatectomia parziale (PH). I fegati sono stati raccolti in diversi momenti di osservazione dopo resezione per analizzare la rigenerazione del fegato e vascolare parenchimale utilizzando la suddetta tecnica di visualizzazione e la quantificazione. Gli obiettivi principali di questo film sono: (1) dimostrare la delicata iniezione-tecnica necessaria per raggiungere contrasto ottimale e (2) dimostrare il potenziale beneficio derivante from una dettagliata analisi del campione derivanti utilizzando μCT e sezioni seriali istologiche. Dopo aver visto questo film, il lettore dovrebbe avere una migliore comprensione di come iniettare composto di silicone in un sistema vascolare specifico e l&#39;utilità e applicabilità della tecnica.

<table><tbody><tr><td>PERFUSOR&reg; VI</td><td>B.BRAUN</td><td>87 222/0</td><td></td></tr><tr><td>Pipetus&reg;-akku</td><td>Hirschmann</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>Pipets</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>micro forbici</td><td>Strumenti di scienze fini (F&middot; S&middot; L)</td><td>No. 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>micro serrefine</td><td>Strumenti per le scienze fini (F&middot; S&middot; L)</td><td>No.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Micro morsetti applicatore</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>No. 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinze diritte</td><td>Strumenti per la scienza fine (F&middot; S&middot; L)</td><td>No. 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinze curve</td><td>Strumenti per la scienza fine (F&middot; S&middot; L)</td><td>No. 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>portaaghi</td><td>Strumenti per le scienze fini (F&middot; S&middot; L)</td><td>No. 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>B.Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 ml</td><td>B.Braun</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>Linee di prolunga e di collegamento</td><td>B.Braun</td><td>4256000</td><td>30 cm, interno &oslash; 1,2 mm</td></tr><tr><td>6-0 seta (Perma-Hand Seide)</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 prolene</td><td>Ethicon</td><td>8711H</td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg; Diluente MV</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg; MV - 120</td><td>FLOW TECH, INC</td><td>MV - 120 (blu)</td><td></td></tr><tr><td>Agente indurente VV</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eparina 2500 I.E./5 ml</td><td>Rotexmedica</td><td>ETI3L318-15</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td>E15117/D DE</td><td></td></tr><tr><td>Imalytics Software preclinico</td><td>Imaging molecolare sperimentale, RWTH Università di Aquisgrana, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepaVision</td><td>Fraunhofer MEVIS, Brema, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0-HT&nbsp; Scanner digitale per vetrini</td><td>Hamamatsu Electronic Press, Giappone&nbsp;</td><td>C9600</td><td></td></tr><tr><td>Tomoscopio Duo CT&nbsp;</td><td>CT Imaging GmbH, Erlangen, Germania</td><td>TomoScope&reg; &nbsp; Sinergia</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione dei vascolare e parenchimale rigenerazione dopo il 70% epatectomia parziale in topi normali

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Una procedura di iniezione silicone modificato è stato utilizzato per la visualizzazione dell&#39;albero vascolare epatica. Questa procedura consisteva di iniezione in vivo del composto siliconico, tramite un catetere di G 26, nel portale o vena epatica. Dopo l&#39;iniezione di silicone, organi sono stati espiantati e preparate per la scansione ex-vivo micro-CT (μCT). La procedura di iniezione di silicone è tecnicamente impegnativo. Il raggiungimento di un risultato di successo richiede una vasta esperienza microchirurgico dal chirurgo. Una delle sfide di questa procedura consiste nel determinare il tasso di perfusione adeguata per il composto di silicone. Il tasso di perfusione per il composto di silicone deve essere definito in base al emodinamica del sistema vascolare di interesse. tasso di perfusione inappropriato può portare ad una perfusione incompleta, la dilatazione artificiale e rottura di alberi vascolari. La ricostruzione 3D del sistema vascolare era basato su TAC e stata ottenuta utilizzandosoftware preclinica quali HepaVision. La qualità dell&#39;albero vascolare ricostruito era direttamente correlato alla qualità di perfusione silicone. parametri vascolari Successivamente calcolati indicativi di crescita vascolare, come il volume vascolare totale, sono stati calcolati sulla base delle ricostruzioni vascolari. Contrasto dell&#39;albero vascolare con silicone consentito per il successivo work-up istologico del campione dopo la scansione μCT. Il campione possono essere sottoposti a sezioni seriate, analisi istologica e scansione scivolo intero, e successivamente alla ricostruzione 3D degli alberi vascolari basati su immagini istologiche. Questo è il presupposto per la rilevazione di eventi molecolari e la loro distribuzione rispetto alla dell&#39;albero vascolare. Questa procedura di iniezione silicone modificato può anche essere utilizzato per visualizzare e ricostruire i sistemi vascolari di altri organi. Questa tecnica ha il potenziale per essere applica estesamente agli studi riguardanti l&#39;anatomia vascolare e la crescita in vari un animalemodelli di malattia ND.

Criteri di qualità La qualità di iniezione di silicone può essere giudicato ad occhio nudo durante la procedura. I piccoli vasi sulla superficie del fegato riempiono gradualmente con il composto blu. Se la struttura vascolare normale è stato osservato sulla superficie epatica, la qualità iniezione gomma siliconica era buono. Se il volume di perfusione era insufficiente, i piccoli vasi sulla superficie epatica ...

Gli strumenti utilizzati per visualizzare la rigenerazione vascolare richiedono metodi per contrastare gli alberi vascolari. Questo film ha dimostrato una delicata tecnica di iniezione utilizzata per ottenere un contrasto ottimale degli alberi vascolari e illustra i potenziali benefici derivanti da un'analisi dettagliata del campione risultante utilizzando μCT e sezioni istologiche seriali.

Visualizzazione dei Vascolare e parenchimale rigenerazione dopo il 70% epatectomia parziale in topi normali

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Visualizzazione della rigenerazione vascolare e del parenchima dopo epatectomia parziale del 70% in topi normali. Tradizionalmente, la rigenerazione epatica viene valutata misurando l'aumento del peso e del volume del fegato, nonché determinando il tasso di proliferazione degli epatociti. Oggi siamo interessati alla rigenerazione vascolare del fegato nei topi e desideriamo visualizzare e quantificare la crescita vascolare.Pertanto, illustriamo il flusso di lavoro per l'imaging della rigenerazione vascolare. Il flusso di lavoro comprende quattro fasi: contrasto dell'albero vascolare, acquisizione di scansioni TC, ricostruzione 3D e analisi qualitativa e quantitativa delle immagini ottenute. Il flusso di lavoro inizia con il contrasto dell'albero vascolare.Per prima cosa esponiamo il fegato, normale o resecato, quindi iniettiamo il composto di contrasto in silicone polimerizzante nella vena porta o nella vena epatica, a seconda del sistema vascolare di interesse. Successivamente, i fegati asportati vengono sottoposti a scansione mediante MicroCT. Dopo la scansione, eseguiamo una ricostruzione vascolare tridimensionale utilizzando il software preclinico Imalytics.Se la qualità tecnica delle immagini ottenute è sufficiente, è possibile eseguire la ricostruzione 3D utilizzando HepaVision. Questo programma viene utilizzato nelle cliniche per la pianificazione della chirurgia epatobiliare. Oltre alla visualizzazione tridimensionale dell'albero vascolare, il programma consente la visualizzazione e il calcolo del volume epatico, del fegato totale e di ciascun lobo, in base ai vasi di afflusso e deflusso.Dopo la ricostruzione, possiamo determinare ulteriori parametri indicativi della crescita vascolare, come la lunghezza e il diametro di un vaso specifico, con l'aiuto di tecniche computazionali. Questo permetterà una descrizione quantitativa della crescita vascolare. D'altro canto, campioni di Microfil fissati in formalina possono essere tagliati in sezioni seriali.Le sezioni seriali possono essere colorate e digitalizzate utilizzando uno scanner per intere diapositive. Dopo la registrazione rigida ed elastica delle sezioni seriali, è possibile ricostruire gli alberi vascolari tridimensionali sia del sistema venoso portale che di quello venoso epatico. In una fase successiva, intendiamo esplorare la distribuzione spaziale degli eventi molecolari.Un esempio di evento molecolare di interesse nella rigenerazione epatica è la comparsa del marcatore di proliferazione Ki-67 nei nuclei degli epatociti e la sua distribuzione spaziale negli alberi vascolari ricostruiti in 3D. Successivamente, forniremo un'introduzione dettagliata su come eseguire l'iniezione di Microfil. Preparazione dei reagenti.Per la miscela del composto Microfil, abbiamo bisogno del diluente MV, del composto MV, nel nostro caso il MV-120 blu, e dell'agente indurente. Abbiamo inoltre bisogno di pipette, tubo e una pipetta. Preparare due millilitri di MV-120 in un tubo da cinque millilitri.Quindi diluirlo aggiungendo tre millilitri di diluente MV. Mescolare agitando delicatamente. Per la soluzione di eparina salina, aggiungere 1 millilitro di eparina a 10 millilitri di soluzione salina.Preparazione del tavolo operatorio. Innanzitutto, è necessario un microscopio; in secondo luogo, è richiesto un set di materiali monouso: sutura in seta 6-0 e sutura in polipropilene 6-0, siringhe da cinque millilitri e da un millilitro, aghi da 30 e da 21, tubo di estensione per collegare siringa e catetere, catetere da 26 con inserimento dell'ago, bastoncini di cotone e garza.Terzo, sono necessari strumenti chirurgici. Microstrumenti, pinze e coagulatore elettrico. Quarto, è necessaria una pompa di perfusione.Preparazione dell'animale. Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia e anestetizzarlo con isoflurano al 2% e ossigeno a 0,3 millilitri al minuto. Fissare il topo anestetizzato sul tavolo operatorio utilizzando del nastro adesivo, mantenendo l'inalazione continua di isoflurano al 2% e ossigeno a 0,3 millilitri al minuto.Iniezione di microfil nel sistema venoso portale. Praticare un'incisione trasversale sull'addome utilizzando forbici per lo strato cutaneo e un coagulatore elettrico per lo strato muscolare. Spostare l'intestino verso il lato sinistro utilizzando bastoncini di cotone e coprire l'intestino con garza inumidita con soluzione fisiologica.Dissezionare la vena porta al microscopio. Posizionare un punto di sutura in seta 6-0 sotto la vena porta extraepatica a circa un millimetro dalla sua biforcazione. Annodarlo in modo lento per un uso successivo.Iniettare la soluzione salina eparinizzata attraverso una vena peniena per l'eparinizzazione sistemica per cinque minuti. Questa animazione illustrerà la procedura di inserimento del catetere. In primo luogo, posizionare il filo di seta 6-0 sotto la vena porta extraepatica, quindi inserire il catetere di calibro 26 nella vena porta e fissarlo utilizzando una pinza.Legare il punto pre-posizionato per fissare il catetere e bloccare il flusso sanguigno dalla vena splenica e dalla vena mesenterica. Qui illustreremo la procedura chirurgica. Inserire il catetere da 26 gauge con ago.Inserire ulteriormente il catetere ed estrarre lentamente l'ago contemporaneamente. Fissare il catetere utilizzando una pinza. Riempire completamente il catetere con soluzione di eparina salina per evitare bolle d'aria.Collegare il tubo di estensione al catetere e fissarli saldamente. Accendere la pompa di perfusione. Iniziare la perfusione di soluzione salina eparinizzata con una portata di 0,4 millilitri al minuto.Osservare i lobi destri che diventano pallidi immediatamente dopo la perfusione. Sciacquare il fegato utilizzando soluzione fisiologica per mantenerlo umido durante l'intera procedura di perfusione. Eutanasia del topo mediante esanguinazione tramite perfusione sotto anestesia.Continuare la perfusione con eparina per alcuni minuti fino a quando l'intero fegato diventa pallido. Prima della perfusione con Microfil, aggiungere 0,1 millilitro di agente indurente al composto Microfil preparato per accelerare il processo di polimerizzazione. Caricare il composto Microfil in una siringa da cinque millilitri e nel tubo di estensione.Eliminare le bolle d'aria iniettando la soluzione eparinata salina nel catetere, come in precedenza. Collegare il tubo al catetere e fissarlo saldamente. Iniziare l'iniezione di Microfil con una portata di 0,2 millilitri al minuto per circa uno o due minuti.Osservare lentamente l'agente blu diffondersi nei rami della vena porta. Arrestare la perfusione quando la struttura vascolare blu appare sulla superficie di ciascun lobo epatico, come indicato da un cerchio rosso. Lasciare il fegato a riposo per almeno 15 minuti per consentire la polimerizzazione del composto Microfil.Iniezione di microfil, sistema venoso epatico. La procedura segue fondamentalmente gli stessi passaggi dell'iniezione nel sistema venoso portale. Posizionare una sutura in seta 6-0 al di sotto della vena porta extraepatica a una distanza di circa un millimetro dalla sua biforcazione.Quindi inserire un catetere nella vena porta e fissarlo mediante una pinza. Inserire un altro catetere nella vena cava inferiore e fissarlo anch'esso con una pinza. Legare il filo già posizionato per fissare il catetere e bloccare il flusso sanguigno proveniente dalla vena splenica e dalla vena mesenterica.Posizionare una pinza sulla vena cava inferiore sopraepatica per ostruire il deflusso del fegato. Legare i rami della vena cava inferiore, inclusi entrambi i vene renali e l'estremità distale della vena cava inferiore. Lavare il fegato utilizzando soluzione salina eparinizzata tramite il catetere uno.Perfondere il sistema venoso epatico con il composto Microfil tramite il catetere due. Risultati, ricostruzione Micro CT. Abbiamo ottenuto ricostruzioni vascolari tridimensionali utilizzando il software preclinico Imalytics dopo la scansione Micro CT.La rigenerazione vascolare nei sistemi venosi portale ed epatico è apparsa come allungamento e allargamento delle principali strutture vascolari in combinazione con la formazione di rami collaterali di vasi più piccoli. Al secondo giorno post-operatorio, gli alberi vascolari dei lobi rimanenti si sono allungati. Entro il settimo giorno post-operatorio, sono diventati visibili ulteriori piccoli rami provenienti dalla stessa vena porta principale e dalla vena epatica.Risultati, ricostruzione tridimensionale codificata a colori dell'albero vascolare epatico e dei territori epatici dipendenti. Ogni lobo epatico è stato facilmente visualizzato in tutte e tre le dimensioni dopo la ricostruzione codificata a colori mediante HepaVision. Come indicato nella tabella, i volumi epatici del fegato totale e di ciascun lobo sono stati determinati, come mostrato qui, per il sistema venoso epatico di un fegato normale.Risultati, sezioni seriali e ricostruzione. D'altro canto, il campione Microfil fissato con formalina è stato sottoposto a sezione seriale. Le sezioni seriali colorate sono state digitalizzate utilizzando uno scanner per vetrini interi e impiegate per la ricostruzione dell'albero vascolare di entrambi i sistemi.Queste sono sezioni trasversali di una serie di sezioni seriali di fegato di topo prima e dopo la registrazione rigida ed elastica. Dopo la registrazione computerizzata, i sistemi venoso portale e venoso epatico possono essere ricostruiti in un singolo modello 3D. Questo passaggio, che richiede molto tempo sia manualmente che computazionalmente, necessita di ulteriori ottimizzazioni.Il passo successivo, ossia la visualizzazione della distribuzione spaziale degli eventi molecolari in relazione agli alberi vascolari, è attualmente in fase di sviluppo. Questo passaggio può essere concepito come una fusione delle informazioni ottenute dalla Micro CT dell'albero vascolare contrastato con informazioni istologiche oppure come una visualizzazione tridimensionale di informazioni puramente istologiche. In questo caso, le informazioni della Micro CT servirebbero come controllo di qualità per la complessa ricostruzione tridimensionale basata sull'istologia.Ottenuto ciò, disponiamo di uno strumento per indagare meglio la rigenerazione epatica, in particolare la distribuzione spaziale degli eventi molecolari e del parenchima epatico in relazione alla rigenerazione vascolare.

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