Visualizzazione dei Vascolare e parenchimale rigenerazione dopo il 70% epatectomia parziale in topi normali

Visualizzazione della rigenerazione vascolare e del parenchima dopo epatectomia parziale del 70% in topi normali. Tradizionalmente, la rigenerazione epatica viene valutata misurando l'aumento del peso e del volume del fegato, nonché determinando il tasso di proliferazione degli epatociti. Oggi siamo interessati alla rigenerazione vascolare del fegato nei topi e desideriamo visualizzare e quantificare la crescita vascolare.

Pertanto, illustriamo il flusso di lavoro per l'imaging della rigenerazione vascolare. Il flusso di lavoro comprende quattro fasi: contrasto dell'albero vascolare, acquisizione di scansioni TC, ricostruzione 3D e analisi qualitativa e quantitativa delle immagini ottenute. Il flusso di lavoro inizia con il contrasto dell'albero vascolare.

Per prima cosa esponiamo il fegato, normale o resecato, quindi iniettiamo il composto di contrasto in silicone polimerizzante nella vena porta o nella vena epatica, a seconda del sistema vascolare di interesse. Successivamente, i fegati asportati vengono sottoposti a scansione mediante MicroCT. Dopo la scansione, eseguiamo una ricostruzione vascolare tridimensionale utilizzando il software preclinico Imalytics.

Se la qualità tecnica delle immagini ottenute è sufficiente, è possibile eseguire la ricostruzione 3D utilizzando HepaVision. Questo programma viene utilizzato nelle cliniche per la pianificazione della chirurgia epatobiliare. Oltre alla visualizzazione tridimensionale dell'albero vascolare, il programma consente la visualizzazione e il calcolo del volume epatico, del fegato totale e di ciascun lobo, in base ai vasi di afflusso e deflusso.

Dopo la ricostruzione, possiamo determinare ulteriori parametri indicativi della crescita vascolare, come la lunghezza e il diametro di un vaso specifico, con l'aiuto di tecniche computazionali. Questo permetterà una descrizione quantitativa della crescita vascolare. D'altro canto, campioni di Microfil fissati in formalina possono essere tagliati in sezioni seriali.

Le sezioni seriali possono essere colorate e digitalizzate utilizzando uno scanner per intere diapositive. Dopo la registrazione rigida ed elastica delle sezioni seriali, è possibile ricostruire gli alberi vascolari tridimensionali sia del sistema venoso portale che di quello venoso epatico. In una fase successiva, intendiamo esplorare la distribuzione spaziale degli eventi molecolari.

Un esempio di evento molecolare di interesse nella rigenerazione epatica è la comparsa del marcatore di proliferazione Ki-67 nei nuclei degli epatociti e la sua distribuzione spaziale negli alberi vascolari ricostruiti in 3D. Successivamente, forniremo un'introduzione dettagliata su come eseguire l'iniezione di Microfil. Preparazione dei reagenti.

Per la miscela del composto Microfil, abbiamo bisogno del diluente MV, del composto MV, nel nostro caso il MV-120 blu, e dell'agente indurente. Abbiamo inoltre bisogno di pipette, tubo e una pipetta. Preparare due millilitri di MV-120 in un tubo da cinque millilitri.

Quindi diluirlo aggiungendo tre millilitri di diluente MV. Mescolare agitando delicatamente. Per la soluzione di eparina salina, aggiungere 1 millilitro di eparina a 10 millilitri di soluzione salina.

Preparazione del tavolo operatorio. Innanzitutto, è necessario un microscopio; in secondo luogo, è richiesto un set di materiali monouso: sutura in seta 6-0 e sutura in polipropilene 6-0, siringhe da cinque millilitri e da un millilitro, aghi da 30 e da 21, tubo di estensione per collegare siringa e catetere, catetere da 26 con inserimento dell'ago, bastoncini di cotone e garza.

Terzo, sono necessari strumenti chirurgici. Microstrumenti, pinze e coagulatore elettrico. Quarto, è necessaria una pompa di perfusione.

Preparazione dell'animale. Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia e anestetizzarlo con isoflurano al 2% e ossigeno a 0,3 millilitri al minuto. Fissare il topo anestetizzato sul tavolo operatorio utilizzando del nastro adesivo, mantenendo l'inalazione continua di isoflurano al 2% e ossigeno a 0,3 millilitri al minuto.

Iniezione di microfil nel sistema venoso portale. Praticare un'incisione trasversale sull'addome utilizzando forbici per lo strato cutaneo e un coagulatore elettrico per lo strato muscolare. Spostare l'intestino verso il lato sinistro utilizzando bastoncini di cotone e coprire l'intestino con garza inumidita con soluzione fisiologica.

Dissezionare la vena porta al microscopio. Posizionare un punto di sutura in seta 6-0 sotto la vena porta extraepatica a circa un millimetro dalla sua biforcazione. Annodarlo in modo lento per un uso successivo.

Iniettare la soluzione salina eparinizzata attraverso una vena peniena per l'eparinizzazione sistemica per cinque minuti. Questa animazione illustrerà la procedura di inserimento del catetere. In primo luogo, posizionare il filo di seta 6-0 sotto la vena porta extraepatica, quindi inserire il catetere di calibro 26 nella vena porta e fissarlo utilizzando una pinza.

Legare il punto pre-posizionato per fissare il catetere e bloccare il flusso sanguigno dalla vena splenica e dalla vena mesenterica. Qui illustreremo la procedura chirurgica. Inserire il catetere da 26 gauge con ago.

Inserire ulteriormente il catetere ed estrarre lentamente l'ago contemporaneamente. Fissare il catetere utilizzando una pinza. Riempire completamente il catetere con soluzione di eparina salina per evitare bolle d'aria.

Collegare il tubo di estensione al catetere e fissarli saldamente. Accendere la pompa di perfusione. Iniziare la perfusione di soluzione salina eparinizzata con una portata di 0,4 millilitri al minuto.

Osservare i lobi destri che diventano pallidi immediatamente dopo la perfusione. Sciacquare il fegato utilizzando soluzione fisiologica per mantenerlo umido durante l'intera procedura di perfusione. Eutanasia del topo mediante esanguinazione tramite perfusione sotto anestesia.

Continuare la perfusione con eparina per alcuni minuti fino a quando l'intero fegato diventa pallido. Prima della perfusione con Microfil, aggiungere 0,1 millilitro di agente indurente al composto Microfil preparato per accelerare il processo di polimerizzazione. Caricare il composto Microfil in una siringa da cinque millilitri e nel tubo di estensione.

Eliminare le bolle d'aria iniettando la soluzione eparinata salina nel catetere, come in precedenza. Collegare il tubo al catetere e fissarlo saldamente. Iniziare l'iniezione di Microfil con una portata di 0,2 millilitri al minuto per circa uno o due minuti.

Osservare lentamente l'agente blu diffondersi nei rami della vena porta. Arrestare la perfusione quando la struttura vascolare blu appare sulla superficie di ciascun lobo epatico, come indicato da un cerchio rosso. Lasciare il fegato a riposo per almeno 15 minuti per consentire la polimerizzazione del composto Microfil.

Iniezione di microfil, sistema venoso epatico. La procedura segue fondamentalmente gli stessi passaggi dell'iniezione nel sistema venoso portale. Posizionare una sutura in seta 6-0 al di sotto della vena porta extraepatica a una distanza di circa un millimetro dalla sua biforcazione.

Quindi inserire un catetere nella vena porta e fissarlo mediante una pinza. Inserire un altro catetere nella vena cava inferiore e fissarlo anch'esso con una pinza. Legare il filo già posizionato per fissare il catetere e bloccare il flusso sanguigno proveniente dalla vena splenica e dalla vena mesenterica.

Posizionare una pinza sulla vena cava inferiore sopraepatica per ostruire il deflusso del fegato. Legare i rami della vena cava inferiore, inclusi entrambi i vene renali e l'estremità distale della vena cava inferiore. Lavare il fegato utilizzando soluzione salina eparinizzata tramite il catetere uno.

Perfondere il sistema venoso epatico con il composto Microfil tramite il catetere due. Risultati, ricostruzione Micro CT. Abbiamo ottenuto ricostruzioni vascolari tridimensionali utilizzando il software preclinico Imalytics dopo la scansione Micro CT.

La rigenerazione vascolare nei sistemi venosi portale ed epatico è apparsa come allungamento e allargamento delle principali strutture vascolari in combinazione con la formazione di rami collaterali di vasi più piccoli. Al secondo giorno post-operatorio, gli alberi vascolari dei lobi rimanenti si sono allungati. Entro il settimo giorno post-operatorio, sono diventati visibili ulteriori piccoli rami provenienti dalla stessa vena porta principale e dalla vena epatica.

Risultati, ricostruzione tridimensionale codificata a colori dell'albero vascolare epatico e dei territori epatici dipendenti. Ogni lobo epatico è stato facilmente visualizzato in tutte e tre le dimensioni dopo la ricostruzione codificata a colori mediante HepaVision. Come indicato nella tabella, i volumi epatici del fegato totale e di ciascun lobo sono stati determinati, come mostrato qui, per il sistema venoso epatico di un fegato normale.

Risultati, sezioni seriali e ricostruzione. D'altro canto, il campione Microfil fissato con formalina è stato sottoposto a sezione seriale. Le sezioni seriali colorate sono state digitalizzate utilizzando uno scanner per vetrini interi e impiegate per la ricostruzione dell'albero vascolare di entrambi i sistemi.

Queste sono sezioni trasversali di una serie di sezioni seriali di fegato di topo prima e dopo la registrazione rigida ed elastica. Dopo la registrazione computerizzata, i sistemi venoso portale e venoso epatico possono essere ricostruiti in un singolo modello 3D. Questo passaggio, che richiede molto tempo sia manualmente che computazionalmente, necessita di ulteriori ottimizzazioni.

Il passo successivo, ossia la visualizzazione della distribuzione spaziale degli eventi molecolari in relazione agli alberi vascolari, è attualmente in fase di sviluppo. Questo passaggio può essere concepito come una fusione delle informazioni ottenute dalla Micro CT dell'albero vascolare contrastato con informazioni istologiche oppure come una visualizzazione tridimensionale di informazioni puramente istologiche. In questo caso, le informazioni della Micro CT servirebbero come controllo di qualità per la complessa ricostruzione tridimensionale basata sull'istologia.

Ottenuto ciò, disponiamo di uno strumento per indagare meglio la rigenerazione epatica, in particolare la distribuzione spaziale degli eventi molecolari e del parenchima epatico in relazione alla rigenerazione vascolare.