Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

L'obiettivo generale di questa procedura di dissezione delle ossa lunghe e di isolamento del midollo osseo è quello di rimuovere rapidamente e sistematicamente le ossa lunghe e di raccogliere il midollo osseo per ulteriori analisi a valle. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative alla biologia del midollo osseo, alle metastasi del cancro e all'immunologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il processo di dissezione è rapido e standardizzato, la procedura di isolamento del midollo osseo è abbastanza sterile, Inizia posizionando il topo in posizione supina.

Quindi appuntare tutti e quattro i cuscinetti delle zampe sotto l'articolazione della caviglia e spruzzare il mouse con etanolo al 70%, bagnando accuratamente le gambe. Quindi, fai una piccola incisione a destra della linea mediana nell'addome inferiore appena sopra l'anca ed estendi l'incisione lungo la gamba e oltre l'articolazione della caviglia. Tira indietro la pelle.

Quindi tagliare il muscolo quadricipite ancorato all'estremità prossimale del femore per esporre il lato anteriore del femore e bloccare il muscolo fuori dalla gamba con il perno a un angolo di 45 gradi dalla tavola. Con le forbici contro il lato posteriore del femore, taglia i muscoli posteriori della coscia lontano dall'articolazione del ginocchio. Quindi tirare indietro la pelle e i muscoli posteriori della coscia ancorati all'estremità prossimale del femore per esporre il lato posteriore dell'osso e bloccare i muscoli posteriori della coscia fuori dalla gamba, posizionando il perno con un angolo di 45 gradi.

Con il forcipe, afferrare l'estremità distale del femore appena sopra l'articolazione del ginocchio. Quindi guidare le lame delle forbici su entrambi i lati dell'asta femorale verso l'articolazione dell'anca. Dopo aver raggiunto la testa del femore, ruota le forbici, spostando la lama superiore direttamente sopra la testa del femore per dislocare il femore.

Ora afferra la parte superiore dell'asta femorale con la pinza e taglia il tessuto molle lontano dalla testa del femore per rilasciare il femore dall'acetabolo. Quindi tirare l'intero osso della gamba, compresi il femore, il ginocchio e la tibia, verso l'alto e lontano dal corpo e tagliare con cura il tessuto connettivo e il muscolo che attacca la gamba alla pelle. Quando tutto il tessuto connettivo è stato rimosso, estendere eccessivamente l'articolazione della caviglia e torcere le forbici come appena dimostrato per lussare la tibia.

Afferrando l'estremità distale della tibia e facendo attenzione a non recidere i tendini, tirare la tibia verso l'alto e allontanarla dal corpo e dalla bacheca. Quindi rimuovere qualsiasi tessuto connettivo rimanente attaccato all'osso lungo al ginocchio e qualsiasi muscolo aggiuntivo o tessuto connettivo attaccato al femore e alla tibia. Per preparare l'osso lungo all'isolamento del midollo, afferrare il femore con la rotula rivolta verso l'esterno e la testa del femore rivolta verso il basso.

Estendi eccessivamente l'articolazione del ginocchio e ruota le forbici per lussare la tibia dal femore. Quindi rimuovere il tessuto connettivo che tiene insieme il femore e la tibia. Quindi, afferra il femore con il lato anteriore rivolto verso l'esterno e la testa del femore rivolta verso il basso e guida le forbici lungo l'asta del femore fino ai condili.

Ruota delicatamente le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili, la rotula e l'epifisi, esponendo la metafisi. Quindi, usa il forcipe, le forbici e le salviette Kimwipe per rimuovere qualsiasi muscolo o tessuto connettivo aggiuntivo attaccato al femore. Quindi, afferra la tibia con il lato anteriore rivolto verso l'esterno e l'estremità della caviglia rivolta verso il basso.

Se l'epifisi tibiale è intatta, guidare le forbici lungo l'asta della tibia fino ai condili e ruotare delicatamente le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili e l'epifisi, esponendo la metafisi tibiale. Quindi rimuovere qualsiasi muscolo o tessuto connettivo aggiuntivo attaccato alla tibia, come appena dimostrato. Per raccogliere il midollo osseo, spingere prima un ago calibro 18 attraverso il fondo di una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri.

Quindi posizionare le ossa lunghe nel tubo, con l'estremità del ginocchio rivolta verso il basso e chiudere il coperchio. Annidare la provetta per microcentrifuga da 0,5 millilitri in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare le provette a una dose maggiore o uguale a 10.000 volte g in una microcentrifuga per 15 secondi. Verificare che il midollo osseo sia stato espulso dalle ossa mediante ispezione visiva.

Le ossa dovrebbero apparire bianche e un grosso pellet dovrebbe essere visibile nel tubo più grande. Quindi scartare le ossa nella provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri e sospendere il midollo osseo nella soluzione appropriata per l'analisi a valle desiderata. Questa tecnica di dissezione rapida è adatta per una serie di analisi a valle, tra cui l'istomorfometria e l'istologia.

Infatti, come dimostrato da questa ricostruttiva istomorfometrica micro-CT 3D, sia l'osso spongioso che il guscio corticale vengono mantenuti, consentendo un'accurata quantificazione dei parametri strutturali standardizzati per l'istomorfometria ossea. In questa sezione istologica rappresentativa di una tibia formale colorata H ed E e fissata e decalcificata, si può osservare il mantenimento dell'integrità sia dell'osso calcificato che del midollo osseo cellulare per l'analisi istologica. Inoltre, il midollo osseo isolato con questa procedura è adatto per molte applicazioni a valle, tra cui la coltura cellulare primaria di osteoclasti o osteoblasti.

Una volta padroneggiata, la tecnica può essere completata in circa sette minuti, dalla dissezione dell'osso lungo all'isolamento del midollo osseo, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire la procedura, è importante ricordarsi di posizionare il mouse per facilitare la dissezione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il FACS o altri processi a singola cellula per rispondere a ulteriori domande riguardanti le alterazioni nelle popolazioni di cellule del midollo osseo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare rapidamente le ossa lunghe dei topi e isolare il midollo osseo mediante centrifugazione.