Name: Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Scopri la dissezione rapida delle ossa lunghe dell'arto posteriore nei topi e l'isolamento del midollo osseo per centrifugazione. Questa tecnica standardizzata preserva l'integrità del tessuto per analisi istologiche e colture cellulari.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NCI n. U54CA143803, CA163124, CA093900 e CA143055 a K.J.P. Gli autori ringraziano i membri attuali e passati del laboratorio Weilbaecher, in particolare Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla e Hongju Deng, e i membri del Brady Urological Institute, in particolare i membri del laboratorio Pienta per la lettura critica del manoscritto.

Tutto il lavoro animale è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa in conformità con le raccomandazioni delineate nella guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. La dissezione 1. arto posteriore delle ossa lunghe <ol><li> Euthanize il mouse in conformità con le linee guida istituzionali. </li><li> Posizionare il mouse in posizione supina e apporre da appuntare tutte e quattro le gambe attraverso le pastiglie del mouse zampa sotto l&#39;articolazione della caviglia. </li><li> Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo, accuratamente dousing le gambe. </li><li> Fai una piccola incisione a destra di linea mediana nel basso addome, appena sopra l&#39;anca. </li><li> Estendere l&#39;incisione lungo la gamba e oltre la caviglia. </li><li> Tirare indietro la pelle e tagliare il muscolo quadricipite ancorato all&#39;estremità prossimale del femore per esporre il lato anteriore del femore e il pin out dalla gamba, posizionando il perno con un angolo di 45 gradi dalla scheda. </li><li> Con la fogliae delle forbici contro il lato posteriore del femore, tagliare i femorali dal ginocchio. </li><li> Tirare indietro la pelle ed i muscoli adduttori ancorati alla estremità prossimale del femore per esporre il lato posteriore del femore e il pin dalla gamba, mettendo il perno in un angolo di 45 gradi dalla scheda. </li><li> Con la pinza, tenere l&#39;estremità distale del femore, appena sopra il ginocchio. Guida lame delle forbici su entrambi i lati del femore verso l&#39;anca, facendo attenzione a non tagliare nel femore stesso. </li><li> Dopo aver raggiunto la testa del femore, indicato dalle forbici apertura leggermente, ruotare le forbici con lama superiore delle forbici muovono direttamente sopra la testa femorale di dislocare femore, facendo attenzione a non scattare l&#39;osso sotto della testa femorale. </li><li> Afferrare la parte superiore del femore con la pinza, tagliare il tessuto molle dalla testa del femore per liberarla dal dell&#39;acetabolo. </li><li> Estrarre l&#39;intero osso della gamba, tra cuifemore, ginocchio e tibia, alto e lontano dal corpo, accuratamente tagliando via il tessuto connettivo e muscolare che collega la gamba alla pelle. </li><li> Sovraccaricare l&#39;articolazione della caviglia e di nuovo usare le forbici in un movimento rotatorio di dislocare la tibia. </li><li> Afferrando l&#39;estremità distale della tibia, facendo attenzione a non recidere i tendini, tirare la tibia alto e lontano dal corpo e la lavagna. </li><li> Tagliare qualsiasi tessuto connettivo restante fissaggio del osso lungo al mouse al ginocchio. </li><li> Rimuovere qualsiasi muscolo supplementare o tessuto connettivo attaccata al femore e la tibia. </li><li> Per tutte le applicazioni che richiedono l&#39;osso di mantenere intatte (istologia, istomorfometria, test biomeccanico, ecc.), Procedere con protocolli standard in-house (come nel 4-7). Per isolare il midollo osseo, passare alla sezione 2. </li></ol> 2. Preparazione delle ossa lunghe per isolamento di midollo osseo <ol><li> Utilizzando le pinze, afferrare il femore con la rotula rivolto verso unND l&#39;estremità prossimale (testa del femore) verso il basso. </li><li> Sovraccaricare l&#39;articolazione del ginocchio e usare le forbici in un movimento rotatorio di dislocare la tibia e il femore. </li><li> Tagliare qualsiasi tessuto connettivo che tiene il femore e tibia insieme. </li><li> Utilizzando le pinze, afferrare il femore con il lato anteriore rivolto verso e l&#39;estremità prossimale (lato testa del femore) verso il basso. </li><li> Guida le forbici la diafisi femorale ai condili. </li><li> Delicatamente ruotare le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili, rotula, e l&#39;epifisi per esporre metafisi. </li><li> Rimuovere ogni muscolo supplementare o del tessuto connettivo attaccato al femore usando pinze, forbici, e Kimwipes. </li><li> Utilizzando le pinze, afferrare la tibia con il lato anteriore rivolto verso e l&#39;estremità distale (fine caviglia) verso il basso. </li><li> Se l&#39;epifisi tibiale è intatto, guidare le forbici il pozzo tibia ai condili. </li><li> Delicatamente ruotare le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili e dell&#39;epifisi per esporre la MetYsis. </li><li> Rimuovere ogni muscolo supplementare o del tessuto connettivo attaccato alla tibia usando pinze, forbici, e Kimwipes. </li></ol> Isolamento 3. midollo osseo <ol><li> Inserire un ago G 18 attraverso il fondo di un tubo di 0,5 ml microcentrifuga. </li><li> Posizionare le ossa lunghe (massimo 2 femori e tibie 2) nel tubo, ginocchio-end verso il basso end verso il basso e chiudere il coperchio. </li><li> Nest il tubo di 0,5 ml microcentrifuga in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare le provette annidati a ≥10,000 xg in una microcentrifuga per 15 sec. </li><li> Verificare che il midollo osseo è stata filata su ossa mediante ispezione visiva. Le ossa dovrebbero apparire bianco e ci dovrebbe essere una grande pellet visivo nel tubo più grande. </li><li> Scartare il tubo di 0,5 ml microcentrifuga con le ossa. </li><li> Sospendere il midollo osseo in soluzione appropriata (ad esempio, PBS, terreni di coltura, di buffer FACS) e procedere con il protocollo sperimentale (DNA, RNA, o isolamento delle proteine,analisi FACS, o colture cellulari primarie). </li></ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+receptor+P2RY12+regulates+osteoclast+function+and+pathologic+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling.</a> J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).</li>
<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Presentiamo un metodo semplice ed efficiente per la rimozione delle ossa lunghe posteriori del topo e il successivo isolamento del midollo osseo. Questo metodo mantiene l'elevata integrità strutturale e cellulare delle ossa e del midollo osseo e ha un basso tempo di manipolazione, riducendo al minimo la probabilità di fratture indotte dall'utente o di punteggi ossei che possono influenzare le analisi a valle. Inoltre, il metodo di centrifugazione per isolare il midollo osseo non richiede il taglio dell'osso per esporre lo spazio del midollo osseo o il fluido per lavare il midollo osseo, riducendo i potenziali punti di contaminazione. Inoltre, la tecnica della centrifuga ha una produttività relativamente elevata con un tempo di utilizzo inferiore rispetto ad altri metodi, riducendo così i tempi di lavorazione.
L'elevata variazione è inerente agli studi sui topi in vivo a causa dell'elevata variazione fenotipica da topo a topo. Al fine di massimizzare l'impatto della ricerca di studi sui topi costosi e laboriosi, è fondamentale ridurre al minimo l'errore tecnico sperimentale9,10. Il tempo che intercorre tra il sacrificio animale e l'analisi a valle o la fissazione dei tessuti introduce variazioni sperimentali che possono superare sottili cambiamenti e ridurre grandi differenze tra i gruppi. Pertanto, l'elaborazione rapida dei campioni è essenziale per un'analisi accurata dei dati. Le tecniche di dissezione delle ossa lunghe e di isolamento del midollo osseo qui descritte sono ottimizzate per l'elaborazione rapida di animali e campioni per ridurre le variazioni tecniche.
Questo protocollo può essere ampiamente applicato a molti campi di ricerca, tra cui l'indagine del tessuto osseo stesso o l'interrogazione delle cellule del midollo osseo. Inoltre, questo approccio diretto alla dissezione delle ossa lunghe consentirà ai ricercatori in campi correlati di interrogare direttamente i contributi ossei al fine di espandere la nostra conoscenza della disfunzione del midollo osseo in patologie altrimenti poco studiate.

Lo studio delle ossa lunghe e delle cellule del midollo osseo è fondamentale per una miriade di discipline di ricerca, tra cui, ma non solo, la biologia ossea, la biologia del cancro, l'immunologia, l'ematologia e la biomeccanica. L'osso è un organo altamente dinamico che, insieme alla cartilagine, forma lo scheletro per fornire supporto meccanico contro il carico e protezione degli organi interni. Inoltre, i componenti minerali dell'osso sono un pozzo di stoccaggio per le molecole di segnalazione critiche calcio e fosforo, così come per altri fattori1. Infine, le ossa ospitano il midollo osseo e, insieme agli osteoblasti che formano l'osso metabolicamente attivi e agli osteoclasti che riassorbono l'osso, forniscono la nicchia di cellule staminali necessaria per il mantenimento delle popolazioni di cellule ematopoietiche e linfoidi.
L'osso e il midollo osseo sono colpiti da molti disturbi, che spesso portano a disfunzione del midollo osseo, forte dolore osseo e frattura patologica. L'osso è un sito comune di metastasi in molti tumori solidi, in particolare il cancro al seno e il cancro alla prostata, in cui le cellule tumorali coinvolgono direttamente la nicchia del midollo osseo per avviare il circolo vizioso delle metastasi ossee e spostare le cellule staminali ematopoietiche2,3. Le neoplasie ematopoietiche, tra cui il mieloma e la leucemia, sono caratterizzate da disfunzione del midollo osseo e da deregolazione del rimodellamento osseo sano1. Anche altri disturbi scheletrici non maligni sono aree di ricerca attive, come l'osteoartrite, l'osteoporosi, la scoliosi e il rachitismo. Anche in un individuo altrimenti sano, il fallimento biomeccanico in un osso porta a una frattura dolorosa. Tutti questi disturbi rappresentano aree di ricerca attive con l'obiettivo di identificare nuove misure preventive e regimi di trattamento per ridurre la morbilità e la mortalità.
Per ricercare la pletora di ruoli dell'osso e del midollo osseo, sia in condizioni fisiologiche che patologiche, è fondamentale per i ricercatori avere un metodo standardizzato semplice ed efficiente per la dissezione delle ossa lunghe del topo per una rapida elaborazione di grandi esperimenti in vivo. Il protocollo di dissezione qui descritto è adatto a tutte le analisi delle ossa lunghe, tra cui l'imaging ex vivo, l'istologia, l'istomorfometria e i test di forza. Allo stesso modo, un metodo standardizzato di isolamento del midollo osseo con un elevato recupero delle cellule del midollo osseo e una bassa variabilità tra gli utenti è importante per analisi sperimentali come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) o la PCR quantitativa (qPCR), nonché per applicazioni a valle come la coltura cellulare primaria di cellule del midollo osseo.

<table><tbody><tr><td>Spille per bacheca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% forbici per dissezione etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td></td><td></td><td></td>per dissezione</tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr>Ago <td></td><td></td><td></td><td>da 16 G</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml Provetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>per<td>microcentrifuga da 0,5 ml</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

L'indagine sull'osso e sul midollo osseo è fondamentale in molti campi di ricerca, tra cui la biologia ossea di base, l'immunologia, l'ematologia, le metastasi del cancro, la biomeccanica e la biologia delle cellule staminali. Nonostante l'importanza dell'osso negli stati sani e patologici, tuttavia, è un organo in gran parte poco studiato a causa della mancanza di conoscenze specialistiche sulla dissezione ossea e sull'isolamento del midollo osseo. I topi sono un organismo modello comune per studiare gli effetti sull'osso e sul midollo osseo, richiedendo un metodo standardizzato ed efficiente per la dissezione dell'osso lungo e l'isolamento del midollo osseo per l'elaborazione di grandi coorti sperimentali. Descriviamo una procedura di dissezione semplice per la rimozione del femore e della tibia adatta per applicazioni a valle, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'analisi istomorfologica e il test di resistenza. Inoltre, descriviamo una procedura rapida per l'isolamento del midollo osseo dalle ossa lunghe tramite centrifugazione con tempo di manipolazione limitato, ideale per la selezione cellulare, la coltura cellulare primaria o l'estrazione di DNA, RNA e proteine. Il protocollo è semplificato per l'elaborazione rapida dei campioni per limitare l'errore sperimentale ed è standardizzato per ridurre al minimo la variabilità da utente a utente.

Il protocollo qui descritto è ottimizzato per una rapida dissezione del femore e della tibia del mouse con un minimo di danni al tessuto osseo. Questa tecnica è adatta per un numero di analisi a valle, compresi gli studi biomeccanica, istomorfometria (Figura 1A - B), e l&#39;istologia (Figura 1C) 4,7. Il histomophometric rappresentante ricostruzione micoCT 3D (Figura 1A - B) dimostra che sia l&#39;osso spongioso e corticale guscio sono mantenuti che consente la precisa quantificazione dei parametri strutturali standardizzate per Istomorfometria ossa, compreso il numero trabecolare, lo spessore e la spaziatura; volume osseo; e lo spessore corticale, tra le altre misure 8. La sezione istologica mostra un rappresentante fissati in formalina e decalcificata tibia H &amp; E macchiato (Figura 1C). L&#39;immagine dimostra l&#39;integrità sia del calcificata buno e del midollo osseo cellulari per l&#39;analisi istologica. La procedura di midollo osseo isolamento conserva la sterilità dello spazio midollare, ha bassa movimentazione per ridurre la contaminazione, e non richiede il taglio del osso lungo, riducendo così la perdita di resa midollo osseo. Questo midollo osseo è adatta a molte applicazioni a valle, tra cui citometria a flusso 5 e PCR analisi. Inoltre, questa procedura può essere utilizzata per isolare midollo osseo per colture primarie di cellule di midollo osseo, tra osteoclasti e osteoblasti (Figura 2A - B) 4,6. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" /> Figura 1. istomorfologiche e analisi istologiche di mouse osso lungo. Ricostruzione microCT tridimensionale di una tibia del mouse mostrando (A) il guscio corticale esterno e (B </s<html> Trong&gt;) dell&#39;osso trabecolare (scala bar = 0,5 mm). (C) istologico H &amp; E macchia di una tibia decalcificata e sezionato (4x). Immagini per gentile concessione di Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, Stati Uniti d&#39;America. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" /> Figura 2. primaria midollo osseo coltura cellulare per la differenziazione degli osteoclasti e gli osteoblasti. Colorazione (A) trappola per osteoclasti multinucleate dopo 7 giorni in mezzi osteoclastogenico (4x). (B) La fosfatasi alcalina (colore viola) per osteoblasti e alizarin rosso (colore rosso) della macchia per la mineralizzazione dopo 21 giorni di mezzi osteogenico. Immagini per gentile concessione di Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, Stati Uniti d&#39;America.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Qui presentiamo un protocollo per la dissezione delle ossa lunghe degli arti posteriori (femori e tibie) dal topo di laboratorio. Descriviamo inoltre una tecnica rapida per l'isolamento del midollo osseo da queste ossa che utilizza la centrifugazione per la rimozione del midollo osseo dallo spazio del midollo osseo.

Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

L'obiettivo generale di questa procedura di dissezione dell'osso lungo e di isolamento del midollo osseo è rimuovere rapidamente e in modo sistematico le ossa lunghe e raccogliere il midollo osseo per ulteriori analisi successive. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali relative alla biologia del midollo osseo, alla metastasi tumorale e all'immunologia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il processo di dissezione è rapido e standardizzato, e la procedura di isolamento del midollo osseo è abbastanza sterile. Iniziare posizionando il topo in posizione supina.Quindi fissare tutti e quattro i cuscinetti plantari al di sotto dell'articolazione della caviglia e spruzzare l'etanolo al 70% sul topo, bagnando accuratamente le zampe. Successivamente, praticare un piccolo taglio a destra della linea mediana nell'addome inferiore appena sopra l'anca, quindi estendere il taglio lungo la gamba oltre l'articolazione della caviglia. Tirare indietro la pelle.Quindi, tagliare il muscolo quadricipite ancorato all'estremità prossimale del femore per esporre la faccia anteriore del femore, e fissare il muscolo lontano dalla gamba con un perno inserito ad un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie. Con le forbici poste contro la faccia posteriore del femore, staccare i muscoli ischiocrurali dall'articolazione del ginocchio. Poi, tirare indietro la pelle e i muscoli ischiocrurali ancorati all'estremità prossimale del femore per esporre la faccia posteriore dell'osso, e fissare i muscoli ischiocrurali lontano dalla gamba, posizionando il perno ad un angolo di 45 gradi.Con la pinza, afferrare l'estremit&agrave; distale del femore appena al di sopra dell'articolazione del ginocchio. Quindi guidare le lame delle forbici su entrambi i lati del diafisi femorale verso l'articolazione dell'anca. Dopo aver raggiunto la testa del femore, ruotare le forbici, spostando la lama superiore direttamente sopra la testa del femore per dislocare il femore.Ora afferrare la parte superiore della diafisi femorale con la pinzetta ed eliminare i tessuti molli dalla testa del femore per staccare il femore dall'acetabolo. Quindi tirare verso l'alto e lontano dal corpo l'intero osso della gamba, compresi femore, ginocchio e tibia, e rimuovere con attenzione il tessuto connettivo e i muscoli che collegano la gamba alla pelle. Quando tutto il tessuto connettivo &egrave; stato rimosso, iperestendere l'articolazione della caviglia e ruotare le forbici come appena dimostrato per dislocare la tibia.Afferrare l'estremità distale della tibia avendo cura di non recidere i tendini, quindi sollevare la tibia verso l'alto e lontano dal corpo e dalla bacheca dei perni. Rimuovere quindi ogni tessuto connettivo residuo attaccato all'osso lungo a livello del ginocchio e qualsiasi muscolo o tessuto connettivo aggiuntivo attaccato al femore e alla tibia. Per preparare l'osso lungo all'isolamento del midollo, afferrare il femore con la rotula rivolta verso l'esterno e la testa femorale rivolta verso il basso.Estendere eccessivamente l'articolazione del ginocchio e ruotare le forbici per dislocare la tibia dal femore. Rimuovere quindi qualsiasi tessuto connettivo che unisce femore e tibia. Successivamente, afferrare il femore con il lato anteriore rivolto verso l'esterno e la testa femorale rivolta verso il basso, guidando le forbici lungo il diafisi femorale fino ai condili.Ruotare delicatamente le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili, la rotula e l'epifisi, esponendo così la metafisi. Successivamente, utilizzare pinze, forbici e salviette Kimwipe per rimuovere qualsiasi muscolo o tessuto connettivo residuo attaccato al femore. Poi, afferrare la tibia con il lato anteriore rivolto verso l'esterno e l'estremità della caviglia rivolta verso il basso.Se l'epifisi della tibia è integra, guidare le forbici lungo il diafisi della tibia fino ai condili e ruotare delicatamente le forbici avanti e indietro per rimuovere i condili e l'epifisi, esponendo così la metafisi tibiale. Rimuovere quindi qualsiasi muscolo o tessuto connettivo residuo attaccato alla tibia, come appena dimostrato. Per prelevare il midollo osseo, spingere innanzitutto un ago da 18 gauge attraverso il fondo di una microprovetta da 0,5 millilitri.Quindi posizionare le ossa lunghe nel tubo, con l'estremit&agrave; del ginocchio verso il basso, e chiudere il coperchio. Inserire il tubo microcentrifugo da 0,5 millilitri in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri e centrifugare i tubi a una forza maggiore o uguale a 10.000 &times;g in una microcentrifuga per 15 secondi. Verificare mediante ispezione visiva che il midollo osseo sia stato espulso dalle ossa.Le ossa devono apparire bianche e un pellet di grandi dimensioni dovrebbe essere visibile nel tubo più grande. Quindi scartare le ossa nel tubo microcentrifugo da 0,5 millilitri e sospendere il midollo osseo nella soluzione appropriata per l'analisi successiva desiderata. Questa tecnica di dissezione rapida è adatta per diverse analisi successive, inclusa l'istomorfometria e l'istologia.Effettivamente, come dimostrato da questa rappresentativa ricostruzione tridimensionale mediante micro-TC di tipo istomorfometrico, sia l'osso trabecolare sia la corticale sono preservati, consentendo una quantificazione accurata dei parametri strutturali standardizzati per l'istomorfometria ossea. In questa sezione istologica rappresentativa di una tibia fissata in formalina, colorata con ematossilina ed eosina e decalcificata, è possibile osservare il mantenimento dell'integrità sia dell'osso calcificato sia del midollo osseo cellulare per l'analisi istologica. Inoltre, il midollo osseo isolato mediante questa procedura è adatto a numerose applicazioni successive, inclusa la coltura primaria di osteoclasti o osteoblasti.Una volta padroneggiata, la tecnica può essere completata in circa sette minuti, dalla dissezione dell'osso lungo all'isolamento del midollo osseo, se eseguita correttamente. Durante il tentativo della procedura, è importante ricordare di posizionare il topo in modo da facilitare la dissezione. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la FACS o altri processi a singola cellula, per rispondere ad ulteriori domande riguardanti le alterazioni nelle popolazioni cellulari del midollo osseo.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissezionare rapidamente le ossa lunghe dei topi e isolare il midollo osseo mediante centrifugazione.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

Questo video descrive un protocollo dettagliato per isolare il midollo osseo intero fresco dagli arti posteriori del topo per studiare i difetti dell'intero midollo osseo per i pazienti con malattie del sangue come la leucemia.

Raccolta del midollo osseo dall'arto posteriore del topo

Questo protocollo descrive una procedura per il campionamento seriale del midollo osseo femorale (BM) senza richiedere il sacrificio di topi. Questa procedura facilita gli studi longitudinali della composizione del midollo osseo dei topi nel tempo e fornisce un accesso seriale alle cellule all'interno del midollo osseo per studi ex vivo e di trapianto.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l'osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l'isolamento, la coltivazione e quantificare l'attività degli osteoclasti in vitro.

Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo

Qui presentiamo un protocollo che genera grandi quantità di monociti murini da midollo osseo eterogeneo per applicazioni traduzionali. Rispetto ad altri, questo nuovo metodo aiuta a ridurre il numero di animali sacrificati e abbassa i costi evitando metodi costosi come la separazione cellulare magnetica ad alto gradiente (MACS).

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

Le cellule del midollo osseo coltivate con il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF) generano una coltura eterogenea contenente macrofagi e cellule dendritiche (DC). Questo metodo evidenzia l'utilizzo del legame MHCII e ialuronano (HA) per differenziare i macrofagi dalle DC nella coltura GM-CSF. I macrofagi in questa cultura hanno molte somiglianze con i macrofagi alveolari.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Descriviamo tre metodi di trapianto di midollo osseo (BMT): BMT con irradiazione totale del corpo, BMT con irradiazione schermata e metodo BMT senza precondi condizionamento (BMT adottivo) per lo studio dell'ematopoiesi clonale nei modelli di topo.

Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Il successo della trascrittomica e della multiomica a singola cellula/singolo nucleo dipende in gran parte dalla qualità delle cellule/nuclei. Pertanto, l'isolamento di cellule/nuclei dai tessuti e la loro purificazione devono essere altamente standardizzati. Questo protocollo descrive la preparazione di nuclei dal cervello e dal midollo osseo per il test multioma a singolo nucleo a valle.

Preparazione di nuclei cerebrali e del midollo osseo di alta qualità per saggi multiomi a nucleo singolo

Qui, viene descritto un metodo basato sulla citometria a fosfoflusso per analizzare la segnalazione a valle delle vie mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK in cellule di leucemia mieloide umana acuta xenotrapiantate in topi e ottenute da aspirati di midollo osseo. I livelli di p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 vengono misurati simultaneamente utilizzando un citometro a flusso spettrale di nuova generazione ad alta sensibilità.

Citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta Xenotrapianti derivati da pazienti

Scopri la dissezione rapida delle ossa lunghe dell'arto posteriore nei topi e l'isolamento del midollo osseo per centrifugazione. Questa tecnica standardizzata preserva l'integrità del tessuto per analisi istologiche e colture cellulari.

Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

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