Name: マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶマウス後肢長骨の迅速な解剖法と遠心法による骨髄単離技術。約7分で完了し、骨髄細胞の培養や組織学的解析に適した標準化された手法です。骨髄生物学や免疫学の研究に活用できます。

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この作業は、NCIの助成金番号U54CA143803、CA163124、CA093900、およびK.J.P.へのCA143055によって支援されました。著者らは、Weilbaecher研究室の現在および過去のメンバー、特にKatherine Weilbaecher氏、Michelle Hurchla氏、Hongju Deng氏、Brady Urological Instituteのメンバー、特に原稿の批判的な読解に対してPienta研究室のメンバーに感謝します。

すべての動物の作業は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用のためのガイドで概説勧告に従って施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 1.後肢長骨の解剖<ol><li>施設の指針に従ってマウスを安楽死させます。 </li><li>仰臥位でマウスを合わせ、足関節以下のマウスの足のパッドを介してすべての4脚を固定することによって貼り付けます。 </li><li>徹底的に足をdousing、70％エタノールでマウスをスプレーします。 </li><li>ちょうど腰の上に、下腹部正中線の右側に小さな切開を行います。 </li><li>脚のダウンと足首関節過去の切開を拡張します。 </li><li>皮膚を引いて、ボードから45度の角度でピンを配置し、大腿骨の前方側を露出させ、脚部からピンに大腿骨の近位端に固定された大腿四頭筋を切りました。 </li><li>宣伝ちらしと大腿骨の後部側面にはさみのeは、離れて膝関節からのハムストリングスにカット。 </li><li>ボードから45度の角度でピンを配置し、大腿骨の後側を露出させ、脚部からピンに大腿骨の近位端に固定され、皮膚とハムストリングの筋肉を引き戻します。 </li><li>ピンセットで、ちょうど膝関節の上に、大腿骨の遠位端部を保持します。大腿骨自体にカットしないように注意して、股関節に向かって大腿骨シャフトの両側にハサミの刃を案内します。 </li><li>少し開いハサミで示される大腿骨頭を、到達した後、大腿骨頭下の骨をスナップしないように注意して、大腿骨を脱臼する大腿骨頭の真上に移動ハサミのトップブレードではさみをねじります。 </li><li>ピンセットで大腿骨シャフトの上部をつかみ、寛骨臼からそれを解放するために離れて大腿骨頭から軟部組織を切断します。 </li><li>含め、全体の足の骨を引っ張りますアップや身体から離し大腿、膝、および脛骨、慎重に皮膚に足を接続する結合組織と筋肉を切り取ります。 </li><li>足首関節を使い過ぎると再び脛骨を脱臼するねじれ運動にはさみを使用しています。 </li><li> 、脛骨の遠位端を把握腱を切断しないように注意しながら、アップと離れて本体とピンボードから脛骨を引き出します。 </li><li>膝のマウスに、長骨を取り付ける任意の残りの結合組織をカット。 </li><li>任意の追加の筋肉や大腿骨と脛骨に付着した結合組織を削除します。 </li><li> （組織学、組織形態計測、生体力学的試験、 など 。）、無傷のままに骨を必要とするアプリケーションの場合、（4-7のように）標準的な社内のプロトコルを進めます。骨髄を単離するために、セクション2に進んでください。 </li></ol>骨髄の単離2.長骨の準備<ol><li>鉗子の使用、膝蓋骨は反対側で大腿骨を把握ndは近位端部（大腿骨頭）ダウン。 </li><li>膝関節を使い過ぎると脛骨と大腿骨を脱臼するねじれ運動にはさみを使用しています。 </li><li>一緒に大腿骨と脛骨を保持する任意の結合組織をカット。 </li><li>鉗子を使用して、反対の前方側と近位端（大腿骨頭端）ダウンして大腿骨を把握します。 </li><li>顆の大腿骨軸をはさみを導きます。 </li><li>ゆっくり顆、膝蓋骨、そして骨幹を公開する骨端を除去するために、前後にはさみを回転させます。 </li><li>任意の追加の筋肉や鉗子、はさみ、およびキムワイプを使用して大腿骨に付着し結合組織を削除します。 </li><li>鉗子を使用して、反対の前方側と先端（足首端）ダウンと脛骨を把握します。 </li><li>脛骨骨端が無傷である場合は、顆に脛骨の軸をはさみを導きます。 </li><li>ゆっくりmetaphを露出するように顆と骨端を除去するために、前後にはさみを回転させますysis。 </li><li>追加の筋肉または鉗子、はさみ、およびキムワイプを使用して脛骨に付着した結合組織を取り除きます。 </li></ol> 3.骨髄単離<ol><li> 0.5ミリリットルマイクロチューブの底から18 G針を押してください。 </li><li>チューブに長骨（2大腿骨の最大値と2脛骨）を配置し、膝エンドダウンダウン終了し、ふたを閉めます。 </li><li>ネスト1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中の0.5 mlのマイクロ遠心チューブ。 </li><li> 15秒間微量で≥10,000×gで、ネストされたチューブを遠心。 </li><li>骨髄は目視検査により骨のスピンアウトされていることを確認します。骨は白表示され、より大きなチューブに大きな視覚的にペレットがあるはずです。 </li><li>骨0.5 mlマイクロチューブを捨てます。 </li><li> 、適切な溶液中での骨髄（ 例えば 、PBS、培地、FACSバッファー）を中断し、実験プロトコル（DNA、RNA、またはタンパク質の分離を進めますFACS分析、または初代細胞培養）。 </li></ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+receptor+P2RY12+regulates+osteoclast+function+and+pathologic+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling.</a> J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).</li>
<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

マウスの後長骨を除去し、その後の骨髄を分離するための簡単で効率的な方法を紹介します。この方法は、骨と骨髄の高い構造的および細胞的完全性を維持し、処理時間が短いため、下流の分析に影響を与える可能性のあるユーザー誘発性骨折や骨スコアリングの可能性が最小限に抑えられます。さらに、骨髄を分離するための遠心分離法では、骨を切断して骨髄空間を露出させたり、骨髄を洗い流すために液体を流したりする必要がないため、潜在的な汚染点が減少します。さらに、遠心分離機技術は、他の方法よりもハンズオン時間が短く、比較的高スループットであるため、処理時間が短縮されます。
マウス間の表現型の変動が大きいため、in vivo マウス研究には高い変動が固有です。高価で労働集約的なマウス研究の研究効果を最大化するためには、技術的な実験エラーを最小限に抑えることが重要です9,10。動物の犠牲から下流の分析または組織固定までの時間は、微妙な変化を克服し、グループ間の大きな違いを減らす可能性のある実験的変動をもたらします。したがって、正確なデータ分析にはサンプルの迅速な処理が不可欠です。ここで説明する長骨解剖および骨髄分離技術は、技術的なばらつきを減らすために、動物やサンプルの迅速な処理に最適化されています。
このプロトコルは、骨組織自体の調査や骨髄の細胞の調査など、多くの研究分野に広く適用できます。さらに、長い骨解剖に対するこの単純なアプローチにより、関連分野の研究者は、他の方法では十分に研究されていない病状における骨髄機能障害に関する知識を広げるために、骨の寄与を直接調査できるようになります。

長骨と骨髄の細胞の研究は、骨生物学、癌生物学、免疫学、血液学、生体力学など、無数の研究分野の中心です。骨は非常にダイナミックな器官であり、軟骨とともに骨格を形成し、内臓の負荷と保護に対する機械的サポートを提供します。さらに、骨のミネラル成分は、重要なシグナル伝達分子であるカルシウムとリン、およびその他の因子の貯蔵シンクです1。最後に、骨は骨髄を収容し、代謝活性のある骨形成骨芽細胞および骨吸収性破骨細胞とともに、造血細胞およびリンパ細胞集団の維持に必要な幹細胞ニッチを提供します。
骨髄は多くの障害で影響を受け、しばしば骨髄機能障害、重度の骨痛、病的骨折を引き起こします。骨は、多くの固形腫瘍、特に乳がんや前立腺がんによく見られる転移部位であり、腫瘍細胞が骨髄ニッチに直接関与して骨転移の悪循環を開始し、造血幹細胞を置換します2,3。骨髄腫や白血病などの造血器悪性腫瘍は、骨髄機能障害と健康な骨リモデリングの調節緩和を特徴としています1。変形性関節症、骨粗鬆症、脊柱側弯症、くる病など、他の非悪性骨格障害も活発な研究分野です。他の点では健康な個人でさえ、骨の生体力学的障害は痛みを伴う骨折につながります。これらの障害はすべて、罹患率と死亡率を減らすための新しい予防策と治療計画を特定することを目的とした活発な研究分野を表しています。
骨髄の広範な役割を研究するためには、大規模なin vivo実験を迅速に処理するために、研究者がマウスの長骨を解剖するためのシンプルで効率的な標準化された方法を持つことが重要です。ここで概説されている解剖プロトコルは、ex vivoイメージング、組織学、組織形態測定、強度試験など、すべての長骨分析に適しています。同様に、蛍光活性化セルソーティング(FACS)や定量PCR(qPCR)などの実験的解析や、骨髄細胞の初代細胞培養などのダウンストリームアプリケーションには、骨髄細胞の回収率が高く、ユーザー間のばらつきが少ない標準化された骨髄単離法が重要です。

<table><tbody><tr><td>ピンボード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖はさみ&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipesキン</td><td>バリークラーク</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>16 G針</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mlマイクロ遠心チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mlマイクロ遠心チューブ</td>マイクロ遠心分離機<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

骨髄の調査は、基礎骨生物学、免疫学、血液学、癌転移、生体力学、幹細胞生物学など、多くの研究分野で重要です。しかし、健康で病的な状態における骨の重要性にもかかわらず、骨解剖と骨髄分離の専門知識が不足しているため、骨はほとんど研究されていない臓器です。マウスは、骨および骨髄への影響を研究するための一般的なモデル生物であり、大規模な実験コホートの処理のために、長骨解剖および骨髄分離のための標準化された効率的な方法が必要です。大腿骨と脛骨を切除するための簡単な解剖手順について説明し、組織形態学的分析や強度試験など、下流のアプリケーションに適しています。さらに、細胞選別、初代細胞培養、DNA、RNA、タンパク質抽出に最適な、限られた処理時間で遠心分離により長骨から骨髄を分離するための迅速な手順を概説します。このプロトコルは、サンプルの迅速な処理のために合理化され、実験エラーを制限し、ユーザー間のばらつきを最小限に抑えるために標準化されています。

ここで説明するプロトコルは、骨組織への損傷を最小限に抑えて、マウスの大腿骨と脛骨の迅速な解剖のために最適化されています。 、および組織学（ 図1C）4,7 -この技術はバイオメカニクス研究、組織形態計測（B図1A）を含む下流の分析の数、に適しています。代表histomophometric micoCT 3D再構成（ 図1A - B）は、海綿骨と皮質シェルの両方が小柱数、厚さ、及び間隔を含む骨組織形態計測のための標準化された構造パラメータの正確な定量が可能になり、その維持されていることを示しています。骨量;その他の措置8の中で、皮質の厚さ、。代表的な組織学的セクションでは、H＆E染色したホルマリン固定し、脱灰脛骨（ 図1C）を示しています。画像は石灰化bの両方の完全性を実証します1および組織学的分析のための細胞の骨髄。 骨髄の単離手順は、骨髄空間の無菌性を維持し、汚染を低減するために低い処理を有し、したがって、骨髄収率の損失を低減すること、長骨の切断を必要としません。この骨髄5及びPCR分析、フローサイトメトリーを含む多くの下 ​​流の用途に適しています。 4,6 -また、この手順は、破骨細胞および骨芽細胞（B図2A）を含む骨髄細胞の初代細胞培養物のための骨髄を単離することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" /> 図1.組織形態学的およびマウスの長骨の組織学的分析。（A）は、外側皮質殻を示すマウスの脛骨の3次元マイクロCT再構成および（B </s<html> trong&gt;）骨梁（スケールバー= 0.5ミリメートル）。 （C）脱灰と切片脛骨（4倍）の組織学的H＆E染色。画像キャサリンWeilbaecher、医学、アメリカのワシントン大学の礼儀。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" /> 破骨細胞と骨芽細胞の分化のための図2.初代骨髄細胞培養。破骨細胞形成メディア（4倍速）で7日後の多核破骨細胞のための（A）TRAP染色。 （B）骨芽細胞および骨形成培地で21日後の石灰化のためのアリザリンレッド（赤色）染色のためのアルカリホスファターゼ（紫色）。キャサリンWeilbaecher、医学、アメリカのワシントン大学の画像が礼儀。ジル/ ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ここでは、実験用マウスから後肢の長骨(大腿骨と脛骨)を解剖するためのプロトコルを提示します。さらに、骨髄空間から骨髄を除去するために遠心分離を利用する、これらの骨からの骨髄分離のための迅速な技術について説明します。

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

この長骨解剖および骨髄分離手順の全体的な目的は、長骨を迅速かつ体系的に取り除き、その後の詳細な解析のために骨髄を回収することです。この手法は、骨髄生物学、癌転移、および免疫学に関連する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、解剖プロセスが迅速かつ標準化されており、骨髄分離手順がかなり無菌的に行えることです。まず、マウスを仰臥位に配置することから始めてください。次に、4つの足底パッドをすべて足関節より下の位置で固定し、マウスに70% ethanolをスプレーして、脚全体を十分に濡らします。続いて、下腹部の股関節直上の正中線右側に小さな切開を加え、その切開線を脚に沿って足関節を越えるまで延長します。その後、皮膚を剥ぎ取ります。次に、大腿骨近位端に付着している大腿四頭筋を切断して大腿骨の前面を露出させ、ピンをボードから45度の角度に刺して、筋肉を脚から外側に固定します。ハサミを大腿骨の背面にあて、膝関節からハムストリングを切除します。その後、大腿骨近位端に付着している皮膚とハムストリングを後方に引き、骨の背面を露出させ、ピンを45度の角度に刺してハムストリングを脚から外側に固定します。ピンセットを用いて、膝関節の直上の大腿骨遠位端を把持します。次に、大腿骨幹の両側にハサミの刃を添えて、股関節に向かって進めます。大腿骨頭に達したら、ハサミをひねり、上の刃を大腿骨頭の真上に移動させて大腿骨を脱臼させます。次に、鉗子で大腿骨幹部の上端を掴み、大腿骨頭から軟部組織を切り離して、大腿骨を寛骨臼から解放します。その後、大腿骨、膝、脛骨を含む脚の骨全体を体から上方へ引き離し、脚を皮膚に付着させている結合組織と筋肉を慎重に切り離します。すべての結合組織が除去されたら、足関節を過伸展させ、今デモンストレーションしたようにハサミをひねって脛骨を脱臼させます。脛骨の遠位端を把握し、腱を切断しないように注意しながら、脛骨を体およびピンボードから引き離して上に持ち上げます。次に、膝関節部の長骨に付着している残りの結合組織、および大腿骨と脛骨に付着している追加の筋肉や結合組織を除去します。骨髄分離に向けて長骨を準備するため、膝蓋骨を外側に向け、大腿骨頭を下に向けた状態で大腿骨を把握します。膝関節を過伸展させ、ハサミをひねって脛骨を大腿骨から脱臼させます。次に、大腿骨と脛骨を繋いでいる結合組織を除去します。続いて、大腿骨の前側を外に向け、大腿骨頭を下に向けた状態で大腿骨を把握し、ハサミを大腿骨幹に沿って顆粒まで移動させます。ハサミをゆっくりと前後に動かして、顆 {condyles}、膝蓋骨 {patella}、および骨端 {epiphysis} を除去し、骨幹端 {metaphysis} を露出させます。次に、鉗子、ハサミ、およびキムワイプを使用して、大腿骨に付着している不要な筋肉や結合組織を取り除きます。続いて、脛骨の前側を外側に向け、足首側を下にして把持します。脛骨骨端が完全な状態である場合は、ハサミを脛骨幹から顆部に向かって導き、ハサミを前後にゆっくりと回転させて顆部と骨端を取り除き、脛骨骨幹端を露出させます。次に、今実演したように、脛骨に付着しているその他の筋肉や結合組織を取り除きます。骨髄を採取するには、まず18ゲージの針を0.5 mLマイクロ遠心チューブの底に刺し通します。次に、長管骨の膝側を下にしてチューブに入れ、蓋を閉じます。0.5 mLマイクロセントリフュージチューブを1.5 mLマイクロセントリフュージチューブに入れ、マイクロセントリフュージを用いて10,000 ×g以上の条件で15秒間遠心分離します。目視により、骨髄が骨から完全に抽出されたことを確認してください。骨は白く見え、大きなチューブ内には大きなペレットが確認できるはずです。次に、0.5 milliliter マイクロ遠心チューブ内の骨を廃棄し、骨髄を目的の下流解析に適した溶液に懸濁させます。この迅速な解剖技術は、組織形態計測法や組織学を含む多くの下流解析に適しています。実際に、この代表的な組織形態計測用マイクロCT 3D再構築像で示されているように、海綿骨と皮質骨の両方が維持されており、骨組織形態計測のための標準化された構造パラメータの正確な定量化が可能です。H&amp;E染色を施し、ホルマリン固定および脱灰を行った脛骨のこの代表的な組織切片では、組織学的解析のための石灰化骨と細胞性骨髄の両方の完全性が維持されていることが観察できます。さらに、この手順で分離された骨髄は、破骨細胞や骨芽細胞の初代細胞培養を含む、多くのダウンストリームアプリケーションに適しています。適切に行えば、長骨の解剖から骨髄の分離まで、この手法に習熟すれば約7分で完了できます。処置を行う際は、解剖しやすいようにマウスを配置することが重要です。本手順の後、FACSやその他のシングルセル解析などの手法を用いることで、骨髄細胞集団の変化に関するさらなる疑問を解明することができます。このビデオを視聴することで、マウスの長管骨を迅速に解剖し、遠心分離によって骨髄を分離する方法について十分に理解できるはずです。

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