Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare DNA e RNA di alta qualità dai tamponi e quindi determinare la loro composizione batterica utilizzando il sequenziamento genico dell'rRNA 16S. Questo metodo può aiutare un ricercatore a identificare quali batteri sono contenuti all'interno di un determinato campione umano e determinare le associazioni tra particolari batteri e le caratteristiche dell'ospite o lo stato della malattia. Sebbene questo metodo sia stato progettato per fornire informazioni sulle comunità batteriche vaginali umane, il metodo può essere applicato anche per studiare le comunità batteriche di altri siti del corpo, come le narici, la bocca, la pelle e il retto e da altri organismi.

Si noti che questo video evidenzia le parti più complicate del protocollo e non copre la parte di sequenziamento o l'analisi di sequenziamento. Brittany Bowman, un tecnico del mio laboratorio, dimostrerà. Iniziare questa procedura con tamponi ectocervicali raccolti e conservati su ghiaccio umido come descritto nel documento di accompagnamento.

In preparazione per l'estrazione dell'acido nucleico, pulire tutte le superfici della cappa e tutti gli oggetti portati nella cappa con candeggina seguita da un decontaminante che rimuove RNasi, DNasi e DNA. Nel cappuccio, posizionare un tubo per perline per campione. A ogni provetta, aggiungere 500 microlitri di tampone NaCl-Tris-EDTA, 210 microlitri di SDS al 20% e 500 microlitri di alcol isoamilico fenolo cloroformio.

Un'attenta manipolazione dei tamponi è fondamentale per ottenere risultati chiari con questo protocollo. Ci vuole un po' di pratica per trasferire il tampone senza farlo cadere ed è più facile se si utilizza un tampone ad albero cavo come questo. Utilizzando una pinza sterile, trasferire il tampone dalla fiala di trasporto nel tubo di perlinatura.

Strofinare accuratamente la testa del tampone contro le pareti interne della provetta per almeno 30 secondi. Metti il tubo sul ghiaccio. Quindi cambiare i guanti e ripetere la procedura di tampone con il campione successivo.

Una volta che tutti i campioni sono stati strofinati energicamente, lasciarli raffreddare sul ghiaccio per almeno 10 minuti. Trascorsi 10 minuti per rimuovere il tampone, afferrare l'impugnatura con una pinzetta sterile e, utilizzando una punta P200 pulita, premere la testina contro l'interno della parete del tubo. Questo processo libera il liquido dal tampone, aumentando il recupero dell'acido nucleico.

Posizionare il tubo di perline nel perlina e omogeneizzare il campione per due minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, centrifugare il tubo di perline a 6.000 g e quattro gradi Celsius per tre minuti per pellettare i detriti e separare le fasi acquosa e fenolica. Dopo la rotazione, di solito si possono vedere tre fasi.

Lo strato superiore è la fase acquosa, contenente il DNA e l'RNA. Lo strato inferiore è la fase organica, contenente lipidi e detriti dalle cellule e dai tamponi. Il sottile strato intermedio bianco, chiamato interfase, contiene proteine.

Trasferire la fase acquosa, circa 500-600 microlitri, in una provetta sterile da 1,5 millilitri. Aggiungere un volume uguale di alcol isoamilico fenolo cloroformio. Mescolare per inversione e breve vortice.

Centrifugare la provetta per cinque minuti. Dopo la centrifuga, trasferire la fase acquosa in una nuova provetta sterile da 1,5 millilitri. Fare attenzione a non trasferire materiale dall'interfase o dalla fase fenolica sottostante.

Annotare il volume trasferito e conservare la fase fenolica per il futuro isolamento delle proteine. Successivamente, aggiungere 0,8 volumi di isopropanolo e 0,1 volumi di acetato di sodio a tre molari. Mescolare accuratamente per inversione e vorticare brevemente.

Far precipitare l'acido nucleico raffreddando il tubo a 20 gradi Celsius per almeno due ore e per tutta la notte. Dopo la precipitazione, centrifugare la provetta per 30 minuti. Dopo la centrifuga, utilizzare con cura una pipetta per rimuovere il surnatante, lasciando intatto il pellet.

Aggiungere 500 microlitri di etanolo al 100%. Staccare il pellet con un leggero vortice o pipettandolo senza toccarlo. Centrifugare per cinque minuti.

Utilizzando una pipetta P10, rimuovere ed eliminare quanto più etanolo possibile senza disturbare il pellet. Asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente per 15 minuti. Risospendere il pellet in 20 microlitri di tampone UltraPure 0.1X-Tris-EDTA.

Lasciare raffreddare il campione con ghiaccio per 10 minuti e pipettare ripetutamente per garantire una risospensione completa. Misurare la concentrazione di acido nucleico utilizzando uno spettrofotometro. Se lo si desidera, separare il DNA dall'RNA utilizzando un kit di pulizia della colonna seguendo il protocollo del produttore.

L'impostazione della PCR è un passaggio fondamentale in questa procedura. È molto importante ridurre al minimo la contaminazione garantendo la sterilità dei reagenti, del cappuccio della PCR e dei guanti. Lavora rapidamente ma con attenzione e usa la tecnica corretta quando sposti gli oggetti dentro e fuori dal cofano.

Posizionare un rack di raffreddamento da banco pulito per provette per microcentrifuga e un dispositivo di raffreddamento per piastre PCR nella cappa. Etichettare le provette a 8 pozzetti con tappi individuali e posizionarle nel refrigeratore PCR. L'amplificazione deve essere eseguita in triplice copia e per ogni coppia di primer deve essere incluso un controllo dell'acqua senza stampo.

Mettere una provetta da microcentrifuga nel refrigeratore per la miscela master. Quindi, per ogni campione, combinare acqua ultrapura, tampone HF 5X, DNTP, primer diretto 515F e DMSO al 3% come descritto nel documento di accompagnamento. Quindi, aggiungere la polimerasi alla miscela master e miscelare mediante pipettaggio.

Al primo pozzetto aggiungere 90 microlitri di master mix e due microlitri di reverse primer, mescolare bene. Quindi al quarto pozzetto, che funge da controllo senza modello, aggiungere 23 microlitri di master e due microlitri di acqua e mescolare. Quindi, aggiungere sei microlitri del campione appropriato al primo pozzetto.

Mescolare accuratamente e trasferire 25 microlitri nel secondo pozzetto. Cambiare le punte, quindi trasferire altri 25 microlitri dal primo pozzetto al terzo pozzetto. Tappare bene ogni pozzo.

Fare attenzione a non toccare l'interno dei pozzetti o il tappo. Quindi, ripetere questo processo per ogni campione. Una volta preparati tutti i campioni, centrifugare rapidamente le provette a strisce, trasferirle su un termociclatore ed eseguire il programma.

Al termine della corsa, far girare rapidamente i tubi per raccogliere il liquido dalle pareti. Quindi, su un banco da laboratorio pulito, combinare le reazioni di PCR triplicate di ciascun campione in una provetta per microcentrifuga sterile etichettata. Trasferire 25 microlitri di ciascun controllo senza modello in una provetta sterile separata.

Non combinare ancora ampliconi di campioni diversi. Per convalidare l'avvenuta amplificazione della PCR, caricare cinque microlitri di ciascun campione su un gel di agarosio all'1,5% ed eseguire l'elettroforesi a 120 volt per 30-60 minuti. Guarda il gel sotto la luce UV.

Verificare l'amplificazione riuscita di ciascun campione annotando una singola banda forte intorno a 380 coppie di basi. Se c'è una doppia banda, riamplificare il campione con un diverso codice a barre inverso. Se non c'è alcuna banda, riamplificare il campione utilizzando lo stesso codice a barre inverso o un primer con un nuovo codice a barre inverso.

Se la riamplificazione non ha successo, gli inibitori della PCR possono essere presenti nel campione, nel qual caso eseguire una pulizia del DNA basata su colonna per rimuovere gli inibitori della PCR. Conservare i restanti 70 microlitri di amplicone a 20 gradi Celsius. Scartare i restanti 20 microlitri del controllo senza modello, supponendo che non abbia prodotto una banda.

Per creare la piscina dell'amplificatore, combinare da due a cinque microlitri di ciascun amplicone in un unico tubo sterile. Se la banda di un campione è debole, aggiungere il doppio del volume rispetto al resto dei campioni. Quindi rimuovere i primer PCR utilizzando un kit.

Se applicabile, combina le pool di ampliconi prive di primer per creare la libreria finale. Determinare la concentrazione di DNA della libreria utilizzando uno spettrofotometro o un sistema fluorimetrico. Infine, diluire i campioni a due nanomolari e inviarli per il sequenziamento.

Informazioni dettagliate sull'analisi delle sequenze sono fornite nel documento di accompagnamento. Il DNA e l'RNA di alta qualità sono stati isolati e il DNA è stato utilizzato come modello per l'amplificazione PCR della regione V4 del gene 16S rRNA, come descritto in questo video. L'elettroforesi su gel è stata utilizzata per confermare la presenza di una singola banda, circa 380 coppie di basi, in ogni campione che è stato amplificato con il modello.

I controlli no template eseguiti in parallelo con la stessa coppia di primer non avevano una banda presente. Gli ampliconi della PCR sono stati quindi combinati in un'unica provetta, quantificati e ulteriormente diluiti prima del sequenziamento. Di seguito è mostrato un grafico a barre rappresentativo dei punteggi di qualità della sequenza in ogni posizione della lettura.

È normale che la qualità della sequenza diminuisca dopo 200 coppie di basi. Ma il punteggio medio di qualità dovrebbe rimanere superiore a 30. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare il DNA e l'RNA dai tamponi utilizzando un'estrazione a base di cloroformio fenolico, amplificare la regione V4 del gene dell'RNA ribosomiale 16SR e preparare una libreria per il sequenziamento ad alto rendimento.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prestare molta attenzione per prevenire la contaminazione durante la raccolta del campione, l'estrazione dell'acido nucleico e l'amplificazione della PCR. Non dimenticare che lavorare con il cloroformio fenolo può essere estremamente pericoloso e precauzioni come lavorare in un cappuccio ventilato e indossare guanti impermeabili, occhiali di sicurezza con protezioni laterali e un camice da laboratorio dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.