Name: Procedura per valutare lefficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Impara a valutare l'efficienza dei flocculanti per rimuovere particelle disperse da estratti vegetali usando un approccio DoE. Questo metodo ottimizza i polimeri e i parametri di processo per migliorare la filtrazione.

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Vorrei ringraziare il Dr. Thomas Rademacher per aver fornito i semi di tabacco transgenico e Ibrahim Al Amedi per aver coltivato le piante di tabacco. Desidero ringraziare il Dr. Richard M. Twyman per l'assistenza editoriale e il Prof. Dr. Rainer Fischer per le fruttuose discussioni. Questo lavoro è stato finanziato in parte dall'European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', proposta numero 269110, dalla Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) e dai programmi interni Fraunhofer-Gesellschaft nell'ambito della sovvenzione n. Attira 125-600164.

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L&#39;autore non ha conflitti di interesse da dichiarare.

L&#39;aspetto più importante da considerare quando si imposta un DoE per caratterizzare flocculazione delle particelle è che il design deve in linea di principio essere in grado di individuare e descrivere gli effetti attesi o possibili 36,38, come ad esempio l&#39;influenza del pH, tipo di polimero e la concentrazione di polimero 16. Pertanto, è importante valutare la frazione di spazio di progettazione (FDS) prima di iniziare gli esperimenti reali. L&#39;FDS è la frazione di spazio speri...

Le piante sono ampiamente utilizzati per la produzione di prodotti alimentari quali succhi di frutta, ma possono anche essere sviluppati come piattaforme per la fabbricazione di maggior valore biofarmaceutici 1-3. In entrambi i casi, la lavorazione a valle (DSP) spesso inizia con l&#39;estrazione di liquidi dai tessuti come foglie o frutti, seguita dalla chiarificazione di estratti di particelle cariche 4,5. Per la fabbricazione dei prodotti biofarmaceutici, i costi di DSP possono rappresentare fino al 80% dei costi di produzione complessivi 6,7 e ciò in parte riflette l&#39;alta pressione di particelle presenti negli estratti preparati con metodi di disturbo come omogeneizzazione blade basato 8,9 . Sebbene la scelta razionale di strati filtranti per abbinare la distribuzione granulometrica nell&#39;estratto può aumentare la capacità filtrante e ridurre i costi 10,11, il miglioramento può non superare il limite di capacità di assoluta definito dal numero di particelle che devono essere conservati perunità di superficie filtrante per ottenere chiarimenti. Il soffitto può essere sollevato se meno particelle raggiungono la superficie dei migliori filtri nel treno filtrazione, e questo può essere raggiunto se particelle disperse sono miscelati con polimeri noti come flocculanti che promuovono l&#39;aggregazione a formare grandi flocculi 12. Tali fiocchi possono essere conservati più a monte da filtri a maniche grossolane e meno costosi, riducendo il carico di particelle di raggiungere il più fine e filtri di profondità più costosi. I polimeri devono avere profili di sicurezza adeguati per le loro applicazioni, ad esempio per prodotti biofarmaceutici devono essere conformi alle buone pratiche di fabbricazione (GMP), e in genere devono avere un molare di massa&gt; 100 kDa e possono essere sia neutro o addebitato 13. Considerando flocculanti neutri genere agiscono mediante reticolazione particelle disperse causando la loro aggregazione e la formazione dei fiocchi di diametro&gt; 1 mm 11, polimeri applicati neutralizzare la carica di dparticelle ispersed, riducendo la loro solubilità e provocando così la precipitazione 14. Flocculazione può essere migliorata regolando parametri quali tampone di pH o conducibilità, e il tipo di polimero o di concentrazione, in base alle proprietà dell&#39;estratto 15,16. Per gli estratti di tabacco pretrattati con 0,5-5,0 g L -1 polietilenimmina (PEI), un incremento maggiore di 2 volte della capacità di filtro di profondità è stato segnalato in un processo su scala pilota 100-L. Il costo di questo polimero è inferiore a 10 kg -1 così la sua introduzione nel processo portato a risparmi di costo di circa € 6.000 per filtri e materiali di consumo per lotto 16 o anche di più se combinato con filtro a base di cellulosa aiuti 17. Anche così, modelli predittivi sono necessari per valutare i benefici economici a priori flocculanti perché la loro inclusione può richiedere fasi di attesa di 15-30 min 16,18, con conseguente ulteriore costi di investimento per lo stoccaggiocarri armati. Tuttavia, attualmente non esistono modelli meccanicistici disponibili che possono predire l&#39;esito di tali esperimenti a causa della natura complessa di flocculazione. Pertanto, un approccio 19 esperimenti progettazione di-più appropriati (DoE) è stato sviluppato come descritto in questo articolo. Un protocollo per la procedura generale DoE è stato recentemente pubblicato 20. Dispositivi di piccole dimensioni sono ora disponibili per l&#39;high-throughput screening di condizioni di flocculazione 21. Tuttavia, questi dispositivi non possono realisticamente simulare le condizioni durante la flocculazione di estratti vegetali perché le dimensioni del recipiente di reazione (~ 7 mm per pozzetti su una piastra a 96 pozzetti) e le particelle o fiocchi possono essere inferiore ad un ordine di grandezza a parte. Questo può influenzare i modelli e quindi il potere predittivo del modello di miscelazione. Inoltre, può essere difficile per scalare i processi che coinvolgono precipitazioni dovute a variazioni non lineari nel comportamento di miscelazione e precipitato stabilità 22. Pertanto, questo articolo illustra un sistema di screening banco scala con una portata di 50-75 campioni al giorno, producendo risultati che sono scalabile dal volume iniziale reazione 20 ml ad un processo su scala pilota 100 L 16. Quando combinato con un approccio DoE, questo permette ai modelli predittivi da utilizzare per l&#39;ottimizzazione del processo e la documentazione come parte di un concetto di qualità by design. Il metodo descritto di seguito può anche essere adattato alle biofarmaceutici prodotte nei processi basati su colture cellulari, in cui flocculanti sono anche essere considerato come uno strumento di risparmio di costi 23. Può anche essere usata per modellare la precipitazione delle proteine ​​target da un estratto grezzo come parte di una strategia di purificazione, come dimostrato per β-glucuronidasi prodotto in canola, soia e granoturco 24,25. Una descrizione dettagliata delle proprietà flocculanti può essere trovato altrove 16,26 ed è importante per garantire che il polimero Concni sono o non tossici o nocivi di sotto dei livelli nel prodotto finale 11.

<table><tbody><tr><td>Torbidimetro portatile 2100P</td><td>Hach</td><td>4650000</td><td>Torbidimetro</td></tr><tr><td>2G12 anticorpo</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>Anticorpo di riferimento</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td>Dispositivo SPR</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Furh</td><td>2632410001</td><td>Filtro a maniche</td></tr><tr><td>Catiofast VSH</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>Agente</td></tr> <tr><td>flocculanteCentrifuga 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>Centrifuga</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga 15 ml</td><td>Labomedic</td><td>2017106</td><td>Provetta di reazione</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga 50 ml autoportante</td><td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>Provetta di reazione</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5375.1</td><td>Agente flocculante</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.Software</td> <td>DoE</td></tr><tr><td>Fosfato disodico</td><td>Carl Roth GmbH</td><td> 4984,3&nbsp;</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Fertilizzante</td></tr><tr><td>Forma -86C ULT congelatore</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore Serra</td><td>n.a.n.a.Per</td><td></td> <td>la coltivazione di piante</td></tr><tr><td>Grodan Rockwool Cubs 10 x 10 cm</td><td>Grodan</td><td>102446</td><td>Rockwool block</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>Media component</td></tr><tr><td>K700P 60D</td><td>Pall</td><td>5302305</td><td>Strato filtrante di profondità</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>Pall</td><td>B12486</td><td>Strato filtrante di profondità</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Labomedic</td><td>475855-1R</td><td>Tessuto filtrante</td></tr><tr><td>MultiLine Multi 3410 IDS</td><td>WTW</td><td>WTW_2020</td><td>pHmetro / conduttimetro</td></tr><tr><td>Osram bianco freddo 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Sorgente luminosa</td></tr><tr><td>Phytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.Per</td> <td>la coltivazione di piante</td></tr><tr><td>Polymin P</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>Agente flocculante</td></tr><tr><td>POLYTRON PT 6100 D</td><td>Kinematica</td><td>11010110</td><td>Dispositivo di omogeneizzazione con utensile a lama personalizzato</td></tr><tr><td>Proteina A</td><td>Life technologies</td><td>10-1006</td><td>Proteina legante gli anticorpi</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>Lettore di piastre a fluorescenza</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>Pall</td><td>VP60G03KNH4</td><td>Alloggiamento del filtro</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>Misurazione della distribuzione granulometrica DLS</td></tr></tbody></table>

procedura per valutare l&#39;efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Le piante sono importanti per gli esseri umani non solo perché forniscono materie prime come cibo, mangimi e materie prime, ma sempre più perché possono essere utilizzate come piattaforme di produzione per prodotti a valore aggiunto come i biofarmaci. In entrambi i casi, potrebbe essere necessario chiarificare gli estratti vegetali liquidi per rimuovere il particolato. Una chiarificazione ottimale riduce i costi di filtrazione e centrifugazione aumentando la capacità e la longevità. Ciò può essere ottenuto introducendo polimeri carichi noti come flocculanti, che reticolano le particelle disperse per facilitare la separazione solido-liquido. Non esistono modelli meccanicistici di flocculazione per miscele complesse come gli estratti vegetali, quindi vengono utilizzati modelli empirici. Qui viene descritta una procedura di progettazione degli esperimenti che consente lo screening rapido di diversi flocculanti, ottimizzando la chiarificazione degli estratti vegetali e riducendo significativamente la torbidità. I modelli predittivi risultanti consentono l'identificazione di condizioni di processo robuste e di insiemi di polimeri con proprietà complementari, ad esempio un'efficace flocculazione in estratti con conducibilità specifiche. I risultati presentati per gli estratti di foglie di tabacco possono essere facilmente adattati ad altre specie vegetali o tessuti e faciliteranno quindi lo sviluppo di processi a valle più efficienti in termini di costi per le materie prime e i prodotti farmaceutici di origine vegetale.

Flocculazione di estratto di tabacco con diversi polimeri Il metodo sopra descritto è stato usato con successo per sviluppare un processo per la flocculazione di estratti di tabacco durante la produzione di un anticorpo monoclonale (anticorpi HIV-neutralizzanti 2G12) e una proteina fluorescente (DsRed) (Figura 1) 16, e da allora è stato trasferito ad altre proteine, tra cui lectine, malaria candidat...

La procedura di progettazione degli esperimenti qui presentata consente la valutazione di diversi flocculanti in termini della loro capacità di aggregare particelle disperse in estratti vegetali, riducendo così la torbidità e i costi del trattamento a valle.

Procedura per valutare l&#39;efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare i flocculanti che possono migliorare la rimozione delle particelle disperse dagli estratti vegetali. Ciò viene ottenuto impostando un disegno sperimentale per identificare i polimeri più efficaci e i parametri che controllano l'aggregazione di queste particelle disperse. Il secondo passaggio definisce il flusso di lavoro, che corrisponde alle operazioni unitarie utilizzate in un'applicazione su larga scala.Successivamente, gli estratti fogliari vengono preparati come flocculanti in diverse condizioni e analizzati per misurare la torbidezza e il recupero del prodotto. I risultati mostrano le condizioni ottimali di flocculazione e i polimeri sulla base di una valutazione del modello di progettazione degli esperimenti, che abbreviamo in DoE. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla chiarificazione tradizionale mediante filtrazione in profondità esclusivamente è che la capacità del filtro può aumentare di diversi ordini di grandezza, riducendo i costi complessivi del processo.La flocculazione può aumentare il diametro efficace delle particelle e facilitarne la rimozione mediante centrifugazione o filtrazione. Pertanto, è necessario identificare innanzitutto i parametri del processo ambientale rilevanti per la procedura di flocculazione. In genere, esistono diversi parametri di questo tipo.Pertanto, un approccio DoE è appropriato data l'assenza di modelli meccanicistici. Il DoE viene impostato selezionando parametri basati su dati letterari e conoscenze pregresse. Parametri tipici includono il tempo di incubazione, nonché il tipo e la concentrazione del polimero.Gli esiti sperimentali utilizzati per valutare l'efficienza della flocculazione, come la filtrabilità, vengono definiti anche prima dell'esperimento. Queste informazioni vengono quindi inserite in un disegno sperimentale (DoE) di tipo appropriato al numero di fattori da indagare e al livello di conoscenza già accumulato sul sistema. Viene sviluppato un flusso di lavoro che comprende tutti i passaggi rilevanti per la flocculazione e la lavorazione su scala di laboratorio degli estratti vegetali.Il volume dell’aliquota deve essere sufficientemente ridotto da permettere un’elevata produttività del campione. Le prestazioni dell’equipaggiamento di laboratorio devono essere correlate a quelle dei dispositivi su scala di processo. Le piante vengono coltivate in modo da rappresentare il processo finale.Tutte le attrezzature vengono preparate prima di iniziare gli esperimenti di estrazione e flocculazione. Le soluzioni madri del flocculante vengono preparate con attenzione, tenendo conto di eventuali pre-diluizioni effettuate dal produttore. La scelta della stessa concentrazione madre per tutti i flocculanti semplifica le successive operazioni di pipettaggio, riducendo la probabilità di errori.I componenti del tampone, il pH e la conducibilità di ogni soluzione madre fresca di flocculante vengono preparati in modo da corrispondere alle condizioni degli estratti. Il piano sperimentale (DoE) viene convertito in uno schema di pipettaggio che indica i volumi di soluzioni madri da aggiungere ai campioni di estratto vegetale. I campioni di estratto vegetale vengono preparati a partire da foglie di tabacco raccolte, utilizzando tamponi che riproducono le condizioni da testare nel piano sperimentale (DoE).Mentre si mescola l'estratto, si preparano aliquote corrispondenti al volume predefinito. Ciò garantirà una distribuzione omogenea delle particelle in tutti i campioni. Si aggiunge il tampone di estrazione a ciascuna aliquota in modo che ogni campione abbia lo stesso volume una volta aggiunta la soluzione madre di flocculante.Il volume di soluzione madre definito nel DoE viene aggiunto al campione in modo sequenziale, come indicato dall'ordine casuale delle prove. Il polimero viene distribuito omogeneamente in tutto il campione agitando immediatamente il tubo dopo l'aggiunta del polimero, il che garantisce anche la riproducibilità dei risultati della flocculazione. Il metodo può essere facilmente modificato per testare combinazioni di flocculanti o l'aggiunta ripetuta dello stesso flocculante.Ma questo deve essere implementato nel DoE. La formazione dei fiocchi richiede tipicamente da tre a 30 minuti di tempo di incubazione. È necessario rispettare i tempi di incubazione definiti nel DoE per ottenere risultati riproducibili.Per valutare le prestazioni del flocculante, si può utilizzare o la velocità di sedimentazione dei fiocchi o la torbidità dei filtrati e le capacità del filtro. È inoltre importante verificare che i polimeri non interferiscano con prodotti come le proteine. Una volta confermata la qualità dei dati, le informazioni possono essere trasferite nel software DoE.I dati sperimentali vengono analizzati utilizzando gli strumenti integrati nel software DoE, inclusi strumenti di trasformazione dei dati, selezione dei fattori e controllo della qualità. Oltre all'uso di questi strumenti, il modello finale deve anche essere conforme alle leggi fondamentali della fisica e della termodinamica. Una volta confermata la qualità del modello, questo può essere utilizzato per prevedere le condizioni ottimali per la flocculazione.In base alle previsioni del modello, lo spazio di progettazione può essere ridotto alla regione più rilevante per la quale può essere definito un nuovo DoE, ripetendo la procedura descritta in precedenza. I risultati possono quindi essere confermati su scala pilota o produttiva. In questo studio rappresentativo, le prestazioni di 23 flocculanti sintetici diversi e di quattro flocculanti naturali sono state testate per la loro capacità di flocculare estratti di foglie di tabacco mediante un approccio DoE.Considerando parametri specifici del polimero come concentrazione e tipo di polimero, ma anche parametri del processo, come tempo di incubazione, temperatura, pH del buffer e conducibilità. Mediante una sequenza di quattro disegni IV-ottimali annidati, comprendenti in totale circa 200 aliquote di estratto da 20 mL, abbiamo riscontrato che Polymin P era il flocculante più efficace per gli estratti di tabacco nell'intervallo di pH compreso tra quattro e otto, purché la temperatura fosse compresa tra quattro e 30 gradi Celsius. Un tempo di incubazione di 15 minuti era sufficiente per la flocculazione, ma l'efficacia diminuiva a conducibilità superiori a 40 mS per cm.Tuttavia, l'approccio DoE ha dimostrato che Catiofast VSH era complementare a Polymin P, consentendo una flocculazione efficace a conducibilità superiori a 40 mS per cm. Quando questi flocculanti sono stati introdotti nel processo a valle degli estratti di tabacco, la capacità dei filtri a profondità impiegati è aumentata da 3,2 a 5,7 volte, riducendo di conseguenza il costo dei beni per questa fase. Abbiamo confermato che i flocculanti non riducevano il recupero delle proteine bersaglio, inclusi un anticorpo monoclonale, una proteina fluorescente, una lectina e diversi candidati vaccini.Le condizioni ottimali di flocculazione sono state inoltre confermate in un lotto pilota da 100 L. I risultati del DoE sono stati trasferiti con successo anche a estratti di tabacco preparati con una pressa a vite anziché con un omogeneizzatore a lame, evidenziando l'ampia applicabilità delle informazioni raccolte. Abbiamo inoltre adattato il metodo per testare combinazioni di flocculanti, che si sono rivelate altrettanto efficaci.Dopo aver visto questo video, dovresti comprendere come impostare esperimenti di flocculazione per estratti vegetali utilizzando un approccio DoE.

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Procedura per valutare l'efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante

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