L'immobilizzazione di Multi-biocatalizzatori in perline alginato per cofattore Rigenerazione e migliorata Riusabilità

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è dimostrare l'uso di un sistema biocatalitico accoppiato a cellule intere immobilizzato in perle di alginato per migliorare la resa di produzione e la riutilizzabilità. Questo è il mio argomento, ho risposto a domande chiave nel campo della biocatalisi come i biocatalizzatori immobilizzanti, la stabilità, la rigenerazione dei cofattori e i biocatalizzatori a cellule intere. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un approccio semplice ma flessibile per migliorare la produzione di molte importanti biomolecole attraverso percorsi dipendenti dai cofattori.

In questo protocollo vengono utilizzati due ceppi ricombinanti di E coli. SpNOx E coli, che esprime NADH ossidasi, e HjLAD E coli, che esprime L-arabinitolo deidrogenasi. Poiché questa procedura è la stessa per entrambi i ceppi di E coli, sarà dimostrata solo per HjLAD E coli.

Inoculare una singola colonia di HjLAD E coli in tre millilitri di terreno LB, integrato con 15 microgrammi per millilitro di Ket-A-My-Sin, e incubare durante la notte in un agitatore per incubatrice. Il giorno seguente, diluire la coltura da uno a 100 in 200 millilitri di LB fresco contenente 15 microgrammi per millilitro di Ket-A-My-Sin, e incubare a 37 gradi Celsius a 250 RPM fino a quando l'OD 600 raggiunge circa 0,6. Indurre l'espressione della proteina HjLAD aggiungendo 0,1 millimolari di IPTG al terreno di coltura e incubando a 25 gradi Celsius, 200 giri/min, per sei ore.

Raccogliere le cellule indotte mediante centrifugazione a 3200 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Scartare il surnatante e procedere con la lavorazione del pellet di cella come dimostrato nel segmento successivo. Per iniziare questa procedura, sospendiamo separatamente i pellet cellulari di HjLAD E coli e SpNox E coli in 50 millimolari di tampone Tris-Hcl, a una densità cellulare di cinque grammi di peso di cellule secche per litro.

In una provetta a fondo tondo da 14 millilitri, mescolare 600 microlitri di cinque grammi di peso delle cellule secche per litro di HjLAD E coli, 600 microlitri di cinque grammi di peso delle cellule secche per litro di SpNOx E coli, 100 microlitri di 20 millimolari di NAD plus e 150 microlitri di L-aribinitolo a due molari. Portare il volume di reazione a due millilitri aggiungendo 550 microlitri di Tris-HCl da 50 millimolari. Incubare la miscela di reazione a 30 gradi Celsius e 200 giri/min per otto ore.

Dopo otto ore, centrifugare la miscela a 3200 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti e raccogliere il surnatante di reazione. Per quantificare la produzione di L-xilulosio mediante un saggio colorimetrico, aspirare 100 microlitri del surnatante raccolto in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 50 microlitri di cisteina all'1,5%, 900 microlitri di acido solforico al 70% e 50 microlitri di Kar-Piz-All allo 0,1% disciolto in etanolo e mescolare delicatamente capovolgendo il tubo tre volte.

Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per 20 minuti. Misurare l'assorbanza ottica della miscela di reazione a 560 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Iniziare il protocollo di immobilizzazione preparando una soluzione di alginato al 4%.

Aggiungere 0,8 grammi di alginato di sodio a 20 millilitri di acqua distillata e scaldare la miscela per sciogliere l'alginato di sodio. Aggiungere 600 microlitri di cinque grammi di peso delle cellule secche per litro di HjLAD E coli e 600 microlitri di cinque grammi di peso delle cellule secche per litro di SpNOx E coli a 1,2 millilitri della soluzione di alginato al 4%. Mescolare le cellule e l'alginato con un pipettaggio delicato per evitare la formazione di bolle.

Per garantire la formazione di perle di alginato con dimensioni, morfologia e rigidità uniformi, è fondamentale aggiungere la sospensione di alginato cellulare per una distanza ottimale in modo lento, goccia a goccia, in un volume sufficiente di soluzione di cloruro di calcio per coprire tutte le perle. Aspirare la sospensione di cellule di alginato in una siringa utilizzando un ago, quindi aggiungere la miscela goccia a goccia in una soluzione di cloruro di calcio 0,3 molare in un becher da 100 millilitri agitando continuamente. Lasciare le perle nella soluzione di cloruro di calcio per due o tre ore a temperatura ambiente senza mescolare per consentire la reticolazione.

Decantare la soluzione di cloruro di calcio senza disturbare le perle versando accuratamente la soluzione di cloruro di calcio in un tubo conico da 15 millilitri. Trasferire le perle rimanenti in un altro tubo conico da 50 millilitri. Per rimuovere l'eccesso di cloruro di calcio e le cellule non incapsulate, lavare le perle con tampone Tris-HCl da 50 millimolari.

Aggiungere 10 millilitri di tampone alle perle e lasciare riposare la sospensione indisturbata per tre o cinque minuti. Una volta che le perline si sono depositate sul fondo, decantare il tampone in un altro contenitore. In questo modo, lavate le perline tre volte.

Non centrifugare le perle in un dato passaggio o si romperanno. Non gettare il tampone di lavaggio Tris-HCl usato. Estrarre i 30 millilitri di tampone di lavaggio usato con la soluzione di cloruro di calcio usata raccolta in precedenza.

Pellettare le cellule di E coli non immobilizzate mediante centrifugazione della soluzione di cloruro di calcio estratto e Tris-HCl a 3200 volte G per 20 minuti. Trasferisci le perline lavate in un tubo. Successivamente, valutare la biosintesi dell'L-xilulosio seguendo la procedura dimostrata per i pellet cellulari, ma utilizzando tutte le perle lavate al posto dei pellet cellulari.

Per valutare la stabilità dei biocatalizzatori immobilizzati per la produzione di L-xilulosio, raccogliere le perle dopo che si sono formate. E lavare due volte con 10 millilitri di tampone Tris-HCl da 50 millimolari senza centrifugazione come mostrato in precedenza. Utilizzare tutte le perle lavate per eseguire la reazione per la produzione di L-xilulosio come dimostrato in precedenza.

Quantificare la produzione di L-xilulosio mediante un saggio colorimetrico, come dimostrato in precedenza. Ripetere la reazione di produzione di L-xilulosio per il numero desiderato di cicli di produzione e misurare la quantità di L-xilulosio prodotta nel surnatante di reazione in ogni ciclo. La produzione di L-xilulosio è potenziata da questo sistema biocatalitico accoppiato a cellule intere.

A partire da una concentrazione iniziale di 150 millimolari di L-aribinitolo, l'uso del biocatalizzatore HjLAD E coli da solo ha prodotto una resa del 79% di L-xilulosio. In confronto, l'uso delle cellule HjLAD E coli e SpNOx E coli in un rapporto di uno a uno ha prodotto una resa del 96% di L-xilulosio. Una valutazione dei parametri che influenzano l'efficienza di immobilizzazione del biocatalizzatore ha rivelato che l'efficienza aumenta con l'aumentare della concentrazione di alginato di sodio nell'intervallo dall'uno al tre percento.

Tuttavia, concentrazioni di alginato di sodio superiori al 2% determinano una diminuzione della resa di L-xilulosio. Utilizzando una concentrazione di alginato di sodio del 2%, la concentrazione ottimale di cloruro di calcio per l'immobilizzazione e la resa di L-xilulosio è stata determinata come 0,3 molare. È stata valutata la riutilizzabilità del biocatalizzatore.

In questo grafico, la produzione di L-xilulosio per sette cicli successivi di riutilizzo di biocatalizzatori a cellule intere immobilizzati e accoppiati liberi è mostrata rispettivamente in grigio scuro e chiaro. Sebbene la resa massima di L-xilulosio con biocatalizzatori a cellule intere accoppiate immobilizzate sia inferiore a quella di un sistema a cellule intere accoppiate libere, la riutilizzabilità è migliorata dall'immobilizzazione. Al termine di sette cicli di riutilizzo successivi, i biocatalizzatori immobilizzati hanno mantenuto la loro stabilità e hanno mantenuto il 65% della resa originale di L-xilulosio.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biocatalisi per esplorare le rese dei biocatalizzatori multicellulari completi e le principali reazioni che coinvolgono i cofattori.