La valutazione primaria neurogenesi in Xenopus Embrioni Utilizzando Immunocolorazione

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di consentire una visualizzazione rapida e conveniente di diverse popolazioni di cellule neuronali nel cervello embrionale xenopus in via di sviluppo. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurogenesi primaria, come l'osservazione del processo di regolazione della differenziazione neuronale nel sistema nervoso centrale xenopus. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'osservazione simultanea del pool progenitore delle cellule staminali neurali, nonché di un pool neurale primario differenziato all'interno di un singolo esperimento.

Per iniziare questa procedura, aspirare con cura da cinque a dieci embrioni dalla fiala di vetro utilizzando una pipetta di plastica o di vetro senza introdurre bolle d'aria. Trasferire gli embrioni nella camera di montaggio e osservare sotto uno stereoscopio. Riempire la camera di montaggio con una soluzione di gelatina per garantire la rigidità del blocco di sezione.

Quindi, disponi gli embrioni uno accanto all'altro usando un paio di pinze a punta fine. Segna l'orientamento della testa disegnando una freccia sul bordo della camera utilizzando un pennarello compatibile con la criogenia. Per più gruppi di embrioni, scrivere la descrizione di ciascun gruppo sul bordo della camera corrispondente.

Quindi, posizionare con cura la camera orizzontalmente in una scatola di schiuma riempita a metà con ghiaccio secco. Chiudere il coperchio e lasciare che la camera di montaggio si congeli una alla volta per cinque-dieci minuti. Successivamente, procedere con la criosezione o conservare i campioni congelati a 80 gradi Celsius per almeno una o due settimane senza perdere l'immunogenicità.

In questa procedura, rimuovere il blocco campione congelato dalla camera premendo il fondo della camera con un bastoncino smussato o un dito. Quindi, aggiungere diverse gocce di terreno di congelamento dei tessuti sul disco di supporto del campione. Montare il blocco del campione con l'estremità anteriore degli embrioni rivolta verso l'alto e lasciare il blocco montato all'interno della camera del criostato per circa un minuto, o fino a quando il mezzo di congelamento dei tessuti diventa opaco.

Installare immediatamente il disco portacampione sul microtomo con il lato inferiore del blocco campione rivolto verso l'alto. Tagliare una parte del blocco campione utilizzando una lama quando il blocco campione è ancora relativamente morbido. Quindi, lasciare il disco portacampione sul microtomo per almeno cinque minuti per consentire alla sua temperatura di raggiungere l'equilibrio.

Successivamente, tagliare gradualmente il blocco del campione fino a quando le teste dei girini sono visibili attraverso la gelatina traslucida. Per aumentare la velocità di taglio, aumentare lo spessore della sezione. Monitorare le prestazioni del criostato, come l'affilatura e l'angolo della lama, per assicurarsi che le sezioni successive vengano generate in una lunga striscia.

Una volta che le teste dei girini diventano visibili, regolare le impostazioni del criostato alla normalità, per assicurarsi che le fette finite possano formare strisce e non si sovrappongano o si attacchino alla lama. Quindi, continua a tagliare fino a quando le teste dei girini sono quasi esposte. Spazzolare via tutte le sezioni rimanenti sul palco prima di iniziare a raccogliere le sezioni campione.

Fai circa 10-15 sezioni e lasciale formare una lunga striscia. Capovolgere lateralmente la spessa lastra di vetro di copertura e rimuovere delicatamente la striscia dalla lama utilizzando un pennello a punta fine. Quindi, disponilo sul tavolino con l'asse lungo parallelo alla lama.

Fai da 10 a 15 sezioni e lascia che formino una lunga striscia senza rompersi. Potrebbe non essere facile e richiede pratica. Un trucco è cercare di non applicare la velocità troppo alta sul volantino.

Piuttosto, ruotare il volantino con attenzione e lentamente. Successivamente, scegli un vetrino caricato positivamente a temperatura ambiente ed etichettalo con una matita. Quindi, premerlo rapidamente e con decisione sulla striscia con il lato etichettato rivolto verso il basso.

Successivamente, rimuovere il vetrino dalla camera del criostato. Ripetere questo passaggio per disporre da 20 a 30 fette in parallelo su ogni vetrino. Asciugare i lati all'aria per 10 minuti, quindi procedere immediatamente alla procedura di immunocolorazione o conservare i vetrini in una scatola di vetrini a 80 gradi Celsius per un massimo di tre-sei mesi prima che la procedura di immunocolorazione abbia luogo.

Qui, possiamo vedere i corrispondenti piani di sezione del proencefalo, del mesencefalo, del rombencefalo e del midollo spinale di un girino xenopus che verranno utilizzati per fornire riferimenti posizionali per le immagini seguenti. Le sezioni trasversali corrispondenti, che sono state colorate con Anti-Sox 3, Tubulina Anti-Acetilata e DAPI, mostrano le posizioni relative dei pool di cellule staminali neurali e dei neurofilamenti all'interno del tubo neurale. E qui ci sono le sezioni trasversali corrispondenti colorate con Anti-MyT1 e DAPI che mostrano le posizioni relative dei neuroni primari differenziati all'interno del tubo neurale.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurare un tempo di raffreddamento sufficiente per il blocco del campione in ghiaccio secco. In caso contrario, il blocco campione potrebbe non essere abbastanza duro e quindi difficile da tagliare.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze dello sviluppo per esplorare la differenziazione neurale nei sistemi nervosi centrali xenopus. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare sezioni e osservare specifici pool di cellule neuronali in un sistema nervoso centrale xenopus.