Name: Un romanzo Ex Ovo Tecnica Banding alterare intracardiaca Emodinamica in un sistema embrionali di pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri la tecnica di banding ex ovo per alterare l'emodinamica intracardiaca nell'embrione di pollo. Questo metodo consente di studiare le conseguenze genetiche delle variazioni emodinamiche nello sviluppo cardiaco.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Robert Price e lo staff della Instrumentation Resource Facility presso la University of South Carolina School of Medicine. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da una sovvenzione di ricerca per laureati SPARC dall'Ufficio del Vice Presidente per la Ricerca presso l'Università della Carolina del Sud (JDP/VM). Inoltre, questo lavoro è stato supportato dall'accordo di ricerca Cook Biotech (JDP) e da FirstString Research Inc (JDP) e NIH 2 P20-RR016434-06 (JDP). Inoltre, sovvenzione NIH IDeA Networks of Biomedical Research Excellence (INBRE) per la South Carolina P20GM103499 (JE)

embrioni aviaria non sono considerati animali vertebrati ai sensi della normativa IUCAC. 1. Ottenere embrioni per la chirurgia <ol><li> Incubare 80 - 90 uova di gallina Bovan fecondate (smussato finire) in un umidificata (60%) bilanciere incubatore a 40 ° C per circa 72 ore per ottenere embrioni a Hamilton e Hamburger (HH) fase 17. determinare il numero esatto di uova sulla base di analisi della potenza e il tasso di sopravvivenza degli embrioni 17. Utilizzare i vassoi di uova di plastica per l&#39;incubazione per consentire un&#39;adeguata circolazione dell&#39;aria. </li><li> Dopo questa fase di sviluppo desiderato è raggiunto, versare circa 20 ml di acqua calda (37 ° C) di tampone di Tyrode (integrato con bicarbonato di sodio (1 g / L)) in un x 26 mm piastra di Petri a 100 mm. </li><li> Sterilizzare un guscio d&#39;uovo con il 70% di etanolo. </li><li> rompere delicatamente il guscio con un manico bisturi e rilasciare con cautela il contenuto nel piatto contenente tampone di Tyrode. Scartare gli embrioni se (i) in cui appaiono visivamente anomala (ii)non sono in fase di sviluppo a destra (iii) sono impropriamente orientati sulla tuorlo e / o (iv) si verifica un sanguinamento. Conservare eventuali embrioni non soggetti a un intervento chirurgico subito dopo essere state poste ex ovo a 40 ° C in modo da non compromettere lo sviluppo. Nota: Staging è effettuata sulla base di Hamilton e Hamburger 18. Anomalie di embrioni di pollo è determinata ad occhio nudo e nell&#39;ambito di applicazione dissezione. Assicurarsi che l&#39;embrione ha piegatura appropriata e flessione e vascolare. </li></ol> 2. OFT Banding <ol><li> Tweeze fuori singoli thread lunghi 1 cm da un unico 11/0 nylon sutura chirurgica e formare un nodo sciolto. UV sterilizzare tutti i nodi preformati. </li><li> Sotto un microscopio dissezione, assicurarsi visivamente che il cuore batte a una velocità normale (~ 120 battiti / min). In caso contrario, eliminare l&#39;embrione. </li><li> Appena prima dell&#39;intervento chirurgico, applicare 5 - 6 ml di acqua calda (37 ° C) di tampone di Tyrode alla superficie embrione utilizzando una pipetta di trasferimento. </li><li> Far passare una estremità libera del nodo preformato sotto l&#39;OFT, posizionare la sutura al OFT / ventricolo giunzione (OVJ) (o posizione desiderata), e passare l&#39;estremità libera nel nodo costrizione in tal modo l&#39;OFT comprese le membrane che circondano il cuore. </li><li> Dopo l&#39;intervento chirurgico, bagnare la superficie del tuorlo con 5 - 6 ml di calda (37 ° C) di tampone di Tyrode utilizzando una pipetta di trasferimento. </li><li> Mantenere gli embrioni di controllo ex ovo come gli embrioni a bande; tuttavia non li soggetti alla procedura chirurgica. </li><li> Incubare gli embrioni, per la quantità di tempo desiderato, a 40 ° C in un (60%) incubatrice umidificata. </li><li> Una volta che il punto di tempo desiderato viene raggiunto, asportare l&#39;embrione dal tuorlo con le forbici diritte. Sezionare il cuore con una pinza sottile e utilizzare per diversi studi a valle, come i cambiamenti nella morfologia cardiaca a causa di alterata emodinamica 17. </li></ol> 3. A conferma che l&#39;intervento bendaggio causa un cambiamento nella Emodinamica Nota: La costrizione parziale dovuto all&#39;intervento bande porta ad un aumento della velocità del flusso sanguigno al OVJ. Questo parametro emodinamico è convenientemente valutata utilizzando immagini ecografiche 2D, che viene eseguita nel punto desiderato tempo dell&#39;esperimento. <ol><li> Poiché solo un singolo embrione può essere ripreso alla volta, mantenere tutti gli altri embrioni designati per l&#39;imaging ad ultrasuoni in un incubatore a 40 °. </li><li> Porre la capsula di Petri contenente l&#39;embrione di essere ripreso su una piastra elettrica fissata a 40 ° C. </li><li> Riempire il piatto, fino all&#39;orlo, con acqua calda (37 ° C) del buffer di Tyrode. Versare lentamente la soluzione tampone nel piatto in modo da mantenere intatto il tuorlo. Se, tuttavia, l&#39;integrità del tuorlo è compromessa durante questa fase, scartare l&#39;embrione. </li><li> Orient dell&#39;embrione tale che l&#39;asse centrale dell&#39;embrione è perpendicolare alla sonda ad ultrasuoni che è sospeso da un supporto regolabile. </li><li> Con l&#39;opera macchina ad ultrasuoniTing in B-mode, ottenere un&#39;immagine 2D del cuore pulsante sullo schermo e spostare il palco (piastra elettrica) in modo tale che l&#39;OFT, ventricolo e OVJ sono chiaramente visibili. </li><li> Passare alla modalità pulsato onda (PW), alla frequenza di ripetizione degli impulsi desiderata (ad esempio, 20 kHz) e di ottenere esattamente dati di velocità al OVJ. Una immagine B-mode del cuore pulsante si ottiene sullo schermo. <ol><li> Spostare lo stadio per vedere l&#39;OFT, ventricolo e la OVJ. Utilizzando il software macchina ad ultrasuoni, ottenere misure di velocità esattamente al OVJ. </li></ol></li></ol> Nota: Se la frequenza cardiaca di un embrione diminuisce durante l&#39;imaging, i dati di velocità così ottenuti non devono essere utilizzati per l&#39;analisi. Tutti embrioni utilizzati per misure di velocità non dovrebbero preferibilmente essere utilizzati per altri esperimenti dopo ecografica.

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<li>Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+hemodynamics+and+mechanical+properties+after+circulatory+intervention+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo.</a> J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).</li>
<li>Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Hemodynamics+in+the+Embryonic+Heart+Affects+Outflow+Valve+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Dev.+Dis%22%5BJournal%5D)">Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 473-481 (1951).</li>
<li>Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+dynamics+reflect+degree+of+outflow+tract+banding+in+Hamburger-Hamilton+stage+18+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos.</a> J R Soc Interface. 11 (100), (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa tecnica è relativamente semplice e facile da eseguire, tuttavia alcuni punti chiave devono essere tenuti in considerazione in modo da ottenere risultati accurati valle. Gli embrioni devono essere mantenuti ex ovo in una capsula di Petri che contiene tampone di Tyrode di fornire adeguata reidratazione. E &#39;anche importante per idratare il tuorlo post-chirurgia con tampone di Tyrode e per assicurarsi che la camera di incubazione è adeguatamente idratato. Interventi chirurgici non devono essere eseguite ...

Le valvole di deflusso formate in modo anomalo sono il tipo più comune di difetti cardiaci congeniti 1. Tuttavia, un difetto della struttura e della funzione delle valvole cardiache, anche se presente alla nascita, può diventare sintomatico solo in età adulta. Infatti, diverse malattie valvolari adulte possono essere attribuite a un'origine congenita. Il trattamento di tali pazienti comporta spesso la sostituzione di valvole difettose e, soprattutto, è stato dimostrato che le valvole aortiche sostituite presentano anomalie congenite 2. Dato che i processi critici coinvolti nello sviluppo delle valvole iniziano precocemente durante l'embriogenesi, viene evidenziata l'importanza di comprendere meglio i meccanismi che regolano questi eventi. 
Il primitivo tubo cardiaco, che è il primo organo funzionante in un embrione, presenta due strati distinti - un endocardio endoteliale circondato da miocardio - separati da matrice extracellulare (gelatina cardiaca) che è per lo più prodotta e secreta dal miocardio 3-5. Con il proseguire dello sviluppo, i primordii valvolari (cuscini endocardici) si formano, dopo l'ansa verso destra del cuore embrionale, dall'espansione locale della gelatina cardiaca nel canale atrioventricolare (AV) e nel tratto di efflusso (OFT) 4,6. Questa espansione è mediata dal processo altamente regolato della transizione epitelio-mesenchimale (EMT), durante il quale la gelatina cardiaca viene popolata da cellule mesenchimali di derivazione endocardica 6. Oltre alla popolazione mesenchimale derivata attraverso l'EMT, anche le cellule della cresta neurale sono coinvolte nella valvulogenesi dell'OFT 3. 
Gli stimoli emodinamici, come lo stress da taglio, sono importanti fattori epigenetici che regolano lo sviluppo del cuore nell'embrione 7,8. Utilizzando un sistema 3D in vitro, abbiamo precedentemente dimostrato che lo stress da taglio è un fattore che influenza l'espressione e la deposizione di proteine della matrice extracellulare fibrosa (ECM) nei cuscinetti AV e OFT 9,10. Inoltre, studi condotti da diversi ricercatori hanno dimostrato che un flusso sanguigno alterato porta a valvole e formazione di setti impropri 11-16. Recentemente, utilizzando la nuova procedura di banding qui presentata, abbiamo dimostrato che il cambiamento dell'emodinamica nel cuore del pulcino embrionale influenza i processi precoci coinvolti nella formazione della valvola OFT 17.
La tecnica qui descritta fornisce un nuovo modello per alterare l'emodinamica nel cuore del pulcino in via di sviluppo restringendo parzialmente l'OFT ex ovo. Questa procedura riproducibile è relativamente rapida e consente ai ricercatori di ottenere un numero sufficiente di embrioni/cuori interi/tessuto OFT, ecc. per le analisi a valle, compresi gli studi di espressione genica. Inoltre, questo nuovo modello può essere utilizzato per studiare gli effetti "cronici" dell'emodinamica alterata sullo sviluppo della valvola OFT.

<table><tbody><tr><td>Uova di gallina Bovan fecondate</td><td>Clemson University, Clemson, SC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11 / 0 Sutura in nylon</td><td>Ashaway</td><td>S30001</td><td>UV sterilizzare i nodi prima dell'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>100 x 26 mm capsula di Petri</td><td>VWR</td><td>25387-030</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbice dritta</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinze fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tampone Tyrodes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2145-10L</td><td>Filtro sterilizzare prima dell'uso&nbsp;</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 Sistema di imaging a ultrasuoni</td><td>VisualSonics, Inc.</td><td>VS-11392</td><td></td></tr><tr><td>708 Trasduttore a ultrasuoni&nbsp;</td><td>VisualSonics, Inc.</td><td>VS-11171</td><td></td></tr></tbody></table>

un romanzo<em&gt; ex ovo</em&gt; tecnica banding alterare intracardiaca emodinamica in un sistema embrionali di pollo

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Il nuovo modello qui presentato può essere utilizzato per comprendere l'influenza dell'emodinamica su specifici processi di sviluppo cardiaco, a livello cellulare e molecolare. Per alterare l'emodinamica intracardiaca, le uova di gallina fecondate vengono incubate in una camera umidificata per ottenere embrioni dello stadio desiderato (HH17). Una volta raggiunto questo stadio di sviluppo, l'embrione viene mantenuto ex ovo e l'emodinamica nel cuore embrionale viene alterata restringendo parzialmente il tratto di efflusso (OFT) con una sutura chirurgica alla giunzione tra l'OFT e il ventricolo (OVJ). Anche gli embrioni di controllo vengono coltivati ex ovo ma non vengono sottoposti all'intervento chirurgico. Gli embrioni fasciati e di controllo vengono quindi incubati in un'incubatrice umidificata per il periodo di tempo desiderato, dopodiché viene impiegata l'ecografia 2D per analizzare la variazione della velocità del flusso sanguigno all'OVJ a seguito del banding OFT. Una volta che gli embrioni sono mantenuti ex ovo, è importante garantire un'adeguata idratazione nella camera di incubazione in modo da prevenire l'essiccazione e la morte degli embrioni. Utilizzando questo nuovo modello a bande, è ora possibile eseguire analisi dei cambiamenti nell'espressione dei principali attori coinvolti nello sviluppo valvolare e comprendere il ruolo dell'emodinamica sulle risposte cellulari in vivo, cosa che non era possibile ottenere in precedenza.

Mostrato nella Figura 1 sono strumenti necessari per OFT bande raccomandato. La capsula di Petri (Figura 1A) contenente l&#39;embrione ex ovo deve essere sufficientemente profonda in modo da non distruggere l&#39;embrione quando coperto con il coperchio. Capsule di Petri profondi (Figura 1C) dovrebbero essere utilizzati anche per l&#39;imaging ad ultrasuoni per consentire un adeguato volume di tampone di Tyrode da versare in cim...

Per la prima volta presentiamo qui una procedura di banding riproducibile per alterare l'emodinamica nel cuore in via di sviluppo ex ovo. Ciò si ottiene restringendo parzialmente il tratto di deflusso (OFT).

Un romanzo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Tecnica Banding alterare intracardiaca Emodinamica in un sistema embrionali di pollo

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

L'obiettivo generale di questa procedura di banding Ex Ovo è creare una modificazione riproducibile e non letale dell'emodinamica cardiaca per studiarne le conseguenze genetiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo cardiovascolare, come lo sviluppo delle valvole cardiache e le condizioni patologiche associate. Il punto di forza di questo sistema è che può essere utilizzato per studiare i percorsi genetici che rispondono ai cambiamenti emodinamici nel cuore e nelle valvole in via di sviluppo, nonché per individuare un punto critico oltre il quale il recupero di un cuore non comporta effetti avversi a lungo termine.La procedura sarà dimostrata da Lorain Junor, una tecnica del mio laboratorio, e dal signor Vinal Menon, uno studente di dottorato nel laboratorio, che mostreranno la manipolazione delle uova e l'uso della macchina a ultrasuoni. Incubare da 80 a 90 uova di pollo Bovan fecondate con l'estremità più larga rivolta verso l'alto su vassoi di plastica per uova, all'interno di un incubatore oscillante umidificato impostato a 40 gradi Celsius. Lasciarle sviluppare per circa 72 ore fino allo stadio HH 17.Una volta raggiunta la

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In Electroporations Ovo della Fase HH 10 embrioni di pollo

In questo articolo presentiamo una metodologia semplice per permettere a lungo...

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