Glycan Nodo Analisi: un approccio bottom-up per Glycomics

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di scomporre tutti i glicani in un campione biologico conservando la composizione dei monosaccaridi e le informazioni sui linkage. Facilita la distillazione di interessanti caratteristiche dei glicani come la cialalizzazione malata e la bisezione di N-acetilglucosamina in singoli segnali analitici. Questo metodo può aiutare a rispondere direttamente a domande chiave nel campo dei glicomiti, come ad esempio quali caratteristiche uniche dei glicani sono alterate in particolari stati patologici.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che le caratteristiche dei glicani che tendono ad essere alterate nella malattia, come la ramificazione beta 1-6 e la corfulcosulazione, vengono distillate in singoli segnali analitici piuttosto che essere distribuite su più glicani intatti. In generale, le persone che devono fare questo metodo lottano davvero con scarse rese di N-acetilcisteine a causa di una lavorazione impropria di glicani appena permetilati. Preparare i campioni, trasferendo prima nove microlitri di ciascun analita biologico in provette separate da 1,5 millilitri.

Ad ogni campione, aggiungere un micro-litro di acqua deionizzata e 270 micro-litri di DMSO ad alta purezza. E mescolate energicamente vorticandoli. Dopo la preparazione del campione, assemblare le colonne di spin caricate con idrossido di sodio come descritto nel protocollo di testo.

Utilizzando una siringa analitica, aggiungere 105 micro-litri di iodometano a ciascun analita e tappare immediatamente le provette. Vorticare accuratamente i campioni. Scollegare le colonne di centrifuga preparate in precedenza e centrifugarle per 15 secondi a 2.400 Gs.Dopo aver scartato le provette del serbatoio e l'affluent, ricollegare le colonne e posizionarle all'interno di una nuova serie di provette, etichettate per ciascun analita.

Utilizzare una testa del tubo da 1000 microlitri per trasferire ciascuna soluzione di analita sulla colonna di centrifuga corrispondente. Una volta aggiunta la soluzione dell'analita, crimpare circa due millilitri dall'estremità di un ugello da 200 microlitri e lasciare il puntale nella colonna per utilizzarlo come agitatore. Utilizzare le punte della testa del tubo per mescolare delicatamente le colonne una volta ogni due o tre minuti.

Dopo 11 minuti, scollegare le colonne e centrifugarle per 15 secondi a 2, 400 Gs.Rimuovere immediatamente le colonne di centrifuga e posizionarle in nuovi tubi del serbatoio, conservando la soluzione a flusso continuo ma scartando i tappi. Alle colonne, aggiungere 300 micro-litri di acetonenitrile e centrifugarle per 30 secondi a 9.600 Gs.Ora trasferire le prime soluzioni a flusso continuo permetilate in provette di vetro silanizzato contenenti 3,5 millilitri di tampone fosfato di sodio. Assicurarsi che il supernaned trasferito sia chiaro e che non venga trasferito materiale solido.

Sul fondo dei tubi di plastica si sarà formato un piccolo pallino bianco. Evitare di trasferire materiale solido evidente. In caso contrario, si otterranno scarse rese di note di glicano N-acetilcisteina-glucosamina.

Agitare immediatamente ogni campione nel lotto una volta che tutti i campioni sono stati trasferiti. Quindi unire le soluzioni a flusso continuo di acetonenitrile con il resto del liquido nelle rispettive provette. Ancora una volta, evitare di trasferire residui solidi e bianchi durante questa fase.

Tappare, agitare e agitare le soluzioni combinate immediatamente prima di passare al campione successivo. Dopo la permetilazione, aggiungere 1,2 millilitri di cloroformio a ciascuna provetta all'interno di una cappa aspirante. Quindi tappare i tubi e mescolare energicamente il contenuto.

Per separare gli strati, centrifugare brevemente le soluzioni a 3.000 Gs.Utilizzare una testa di tubo da pascolo per estrarre e scartare la maggior parte dello strato acquoso superiore, lasciando dietro di sé circa tre millilitri di strato. Aggiungere 3,5 millilitri di tampone fosfato di sodio 0,2 molare, quindi tappare, mescolare e centrifugare la provetta. Eseguire questa fase di estrazione liquido/liquido per un totale di tre volte.

Lasciando circa un millilitro di strato acquoso nell'estrazione finale. Ora usa una testa del tubo da pascolo silanizzata pulita per trasferire con cura lo strato di cloroformio in una provetta di vetro silanizzata pulita ed etichettata come descritto nel protocollo di testo. In un collettore di evaporazione preriscaldato, impostato a 75 gradi Celsius, asciugare i campioni sotto un leggero flusso di azoto gassoso.

Assicurarsi che il flusso di gas disturbi la superficie del liquido ma senza schizzarla. Una volta asciutti, i campioni sono pronti per l'idrolisi. Aggiungere 325 micro-litri di acido trifluoroacetico 2 molare o TFA a ciascun campione e mescolare bene.

Tappare ermeticamente ogni provetta del campione subito dopo l'aggiunta a tutti i campioni per evitare l'evaporazione del TFA e la perdita del campione durante la successiva fase di riscaldamento. Incubare i campioni a 121 gradi Celsius per due ore per idrolizzare i glicani. Mentre i campioni sono in incubazione, preparare nuovamente il collettore di evaporazione a 75 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, asciugare i campioni sotto un flusso costante di azoto nel collettore di evaporazione. Controllare frequentemente i campioni per assicurarsi che siano stati asciugati utilizzando il minor tempo di asciugatura possibile. Ad ogni campione, aggiungere 475 microlitri di boroidruro di sodio da 10 grammi per litro.

E poi mescolare accuratamente i campioni per sciogliere eventuali residui. Tappare le provette e lasciare che la reazione di riduzione continui per un'ora. Quindi, aggiungere 63 microlitri di metanolo a ciascun campione.

Mescolare e quindi essiccare i campioni a 75 gradi Celsius sotto azoto. Aggiungere 125 microlitri di metanolo alla soluzione di acido acetico a ciascun campione. Mescolare e quindi essiccare nuovamente i campioni a 75 gradi Celsius sotto azoto.

Assicurarsi che i campioni siano completamente asciutti mettendoli sotto vuoto per 20 minuti. Dopo l'essiccazione, aggiungere 18 microlitri di acqua deionizzata a ciascun campione. Quindi centrifugare brevemente i campioni e mescolarli bene per sciogliere un precipitato.

Quindi, aggiungere 250 microlitri di anidride acetica a ciascun tubo. Tappare le provette, agitare accuratamente e sonicare i campioni in un bagno d'acqua per due minuti per garantire la completa dissoluzione di eventuali residui. Quindi incubare i campioni a 50 gradi Celsius per 10 minuti.

Ora aggiungi 230 micro-litri di TFA concentrato a ciascun campione. Dopo aver tappato e mescolato i campioni, incubarli per 10 minuti a una temperatura interna di 50 gradi Celsius. Aggiungere 1,8 millilitri di diclorometano a ciascun campione e mescolare bene.

Successivamente, aggiungere due millilitri di acqua dionizzata al tubo ed eseguire l'estrazione liquido/liquido due volte. Recuperare lo strato di diclorometano con una testa di tubo da pascolo silanizzata. Trasferire in una fiala di autocampionatore e quindi asciugare il campione sotto azoto a 74 gradi Celsius.

Prima della GC-MS, ricostituire i campioni con 120 microlitri di acetone, tappandoli e mescolandoli accuratamente. In modalità split, utilizzare un campionatore automatico per iniettare un microlitro di ciascun campione nel liner GC split-mode. Per gli spettrometri di massa a tempo di volo, si consiglia una razione divisa di quaranta ed elio gassoso in modalità a flusso costante a 0,8 millilitri al minuto.

Analizza il campione utilizzando un gradiente in due fasi che raggiunge i 325 gradi Celsius. Sottoporre i componenti del campione in uscita alla ionizzazione elettronica. Per un analizzatore di massa a tempo di volo, analizzare i frammenti M su Z da 40 a 800 con una frequenza di somma degli impulsi di 0,1 secondi.

Per dimostrare la sensibilità di questo protocollo, un campione biologico è stato elaborato con cura. Il cromatogramma risultante fornisce un'intensità adeguata tra i picchi di prodotto desiderati per facilitare il confronto e l'analisi. Lo stesso campione biologico di partenza è stato poi processato con la stessa procedura.

Ma il residuo bianco nella soluzione di permetilazione che è stata fatta girare attraverso la colonna NAOH è stato trasportato nella successiva miscela per l'estrazione liquido/liquido. Il cromatogramma fornisce un diverso rapporto di intensità di picco degli stessi prodotti campione chiave. Se confrontato direttamente, la differenza è netta.

La chiara depressione del picco di N-acetilglucosamina collegato a 4 posizioni nel secondo cromatogramma è un tratto riconoscibile di una permetilazione e di un'estrazione non riuscite. Per apprezzare l'utilità di questo approccio nel rilevare le differenze nella composizione dei glicani negli stati patologici, i cromatogrammi ionici estratti da un campione di plasma sanguigno normale e da un campione di plasma sanguigno di un paziente oncologico, vengono normalizzati per manos legati a 2 e sovrapposti. Le differenze quantitative nelle caratteristiche uniche dei glicani, come la ramificazione beta 1-6 e la ciaalazione malata, sono evidenti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi del nodo glicano glicomico bottom-up. Facilita la distillazione di interessanti caratteristiche dei glicani come la corfulcosulazione, la cialalizzazione malata e la divisione in due della glicanite in singoli segnali analitici.