Name: Intra-tracheale Amministrazione Haemophilus influenzae In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Impara l'inoculazione intratracheale di Haemophilus influenzae nei topi per studiare l'infiammazione delle vie aeree. Questo metodo riproducibile permette di analizzare le risposte immunitarie polmonari durante le infezioni batteriche.

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Ringraziamo il Dr. Carson Harrod per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche il signor Minghui Zeng e i dottori Mahesh Kathania e Prashant Khare per i loro contributi. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) e del Sammons Cancer Center (sovvenzione del progetto pilota) a K. Venuprasad.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) del Baylor Research Institute. 1. Coltura non tipizzabile Haemophilus influenzae (NTHi) e preparazione del Inoculo <ol><li> Piatto NTHi su una piastra di agar cioccolato e mantenere la piastra capovolta in un umidificata CO 2 incubatore notte a 37 ° C e 5% CO 2. Il giorno seguente, la cultura i batteri in brodo Brain Heart Infusion. Quindi, aggiungere 1 ml di brodo in una provetta sterile da 1,5 ml. </li><li> Centrifugare a 4000 xg per 5 min a temperatura ambiente. Poi, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile 1x. Ripetere questa operazione una sola volta. </li><li> Trasferire 100 ml di soluzione di ri-sospeso in 900 ml di PBS 1x e misurare l&#39;assorbanza della cultura diluito a 600 lunghezze d&#39;onda nm in uno spettrofotometro. </li><li> Determinare l&#39;unità di vitalità e formazione di colonies (CFU) del inoculo di coltura 1:10 diluizioni seriali su piastre di agar cioccolato e incubando overnight a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Sulla base della vitalità e CFU determinata dal passaggio precedente, regolare l&#39;inoculo ad una concentrazione finale di 20 x 10 6 CFU / ml. </li></ol> 2. intra-tracheale (esso) instillazione <ol><li> Iniettare il mouse per via intraperitoneale (ip) con 0,1 ml / 10 g di peso corporeo di mouse con un / ketamina + 20 mg / ml soluzione xylazina ml 150 mg. La procedura deve essere eseguita nel cappuccio con una sorgente luminosa per mantenere l&#39;animale caldo. </li><li> Pizzicare lo spazio interdigitale del mouse per verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato. </li><li> Posizionare il mouse sul dorso. Radere la zona ventrale del collo e disinfettare con clorexidina e il 70% di alcol etilico. </li><li> Sollevare la pelle della parte ventrale superiore del collo usando ratto pinze dente. Fai una piccola incisione (0,5-1,0 cm) sopra il timo con un bisturie sezionare accuratamente il muscolo per esporre la trachea. <ol><li> Usando una siringa da 1 ml con un ago 27 G, iniettare lentamente 0,05 ml di aria, seguito da 0,05 ml NTHi ottenuti dalla sezione 1 o soluzione salina come controllo, seguita da un&#39;altra 0,05 ml di aria. Tenere animali verticale per circa 1 min. </li></ol></li><li> Chiudere l&#39;incisione con la colla chirurgica. Mantenere il mouse lateralmente reclinata e caldo per circa 10 min. </li></ol> 3. Raccolta BALF <ol><li> Sacrificare il mouse cervicale dislocazione 24 ore dopo l&#39;infezione. </li><li> Aprire la cavità addominale del mouse con forbici anatomiche e tagliare l&#39;aorta ventrale a sanguinare. Esporre la parte ventrale del polmone. </li><li> Esporre la trachea e intubare con un catetere 20 gauge. Instillare 0,8 ml di tampone BAL (1x PBS, 0.1% di destrosio, 10 U / ml di eparina) e raccogliere il lavaggio aspirando delicatamente. Ripetere questa procedura per tre volte. </li><li> Contare il numero totale di cellule in 100 microlitri di sospensione BALF utilizzando un hemocytometro a 10 ingrandimenti con Trypan Blue colorazione. </li><li> Preparare vetrini per modificare la colorazione Giemsa. Un&#39;aliquota di 100 ml di BAL nei rispettivi pozzetti della cytospin e centrifugare a 500 xg per 5 min. Asciugare le diapositive per 10 minuti e macchiare le cellule utilizzando modificato macchia Giemsa secondo protocolli del produttore. </li><li> Utilizzare le cellule rimanenti per la successiva analisi, come la fluorescenza delle cellule attivate (FACS), microscopia confocale, l&#39;espressione genica e Western Blot 11-13. </li></ol> 4. istopatologia Preparazione <ol><li> Per l&#39;analisi istopatologia, infettare i topi con NTHi come descritto al punto 2.4. Dopo 24 ore di infezione, sacrificare gli animali da dislocazione cervicale. Tagliare aprire la cavità toracica con le forbici anatomiche per esporre i polmoni e la trachea come accennato prima. Quindi, inserire il catetere 20 gauge nella trachea. </li><li> Riempire il polmone con il 2% soluzione di agarosio calda preparata in formalina 4%. Una volta che ilpolmoni sono completamente gonfiati, posto ghiaccio sulla parte superiore dei polmoni a solidificare la soluzione di agarosio. </li><li> Poi, rimuovere con attenzione la spina dorsale e metterlo in una soluzione 50 ml di formalina 4% in PBS 1x fino a quando non viene elaborato per (H &amp; E) sezioni ematossilina eosina. </li></ol> 5. FACS colorazione delle cellule nel BALF <ol><li> Mettere 1 x 10 5 cellule dal fluido BALF in un piatto titolo micro V-bottom 96 pozzetti. </li><li> Lavare le cellule con 300 ml di freddo 1x PBS e far girare a 4000 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Macchiare le cellule con soluzione macchia cellule in 100 microlitri 1x PBS (1: 1.000 diluizione) e mantenere a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Lavare le cellule con 300 ml di freddo 1x PBS a 4.000 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Mantenere cellule in 100 ml di FACS tampone di lavaggio [tampone di lavaggio (PBS 1x, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% di sodio azide] contenente 1: 100 diluito Fc-Block per 15 min a 4 ° C. </li><li> cellule centrifugare a 4000 xg per 3 min e scartare supernatant. </li><li> cellule macchia con 100 microlitri superficie colorazione cocktail (diluizione 1: 100) in tampone di lavaggio FACS per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule tre volte con 300 ml di tampone di lavaggio FACS a 4.000 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Fix cellule in 100 ml di paraformaldeide al 4% per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule due volte con 300 microlitri di PBS 1x a 400 xg per 3 min a 4 ° C e risospendere in 300 ml di tampone di lavaggio FACS. </li><li> Effettuare controlli per la colorazione monocolore citometria a flusso perline. <ol><li> Aggiungere una goccia di perle nel piatto microlitro 96 pozzetti V-parte inferiore e lavare con 200 microlitri 1x PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml di colorazione degli anticorpi a 100 l PBS 1x e perline e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Lavare perle due volte con 300 ml 1x PBS. </li></ol></li><li> Analizzare i controlli e le singole cellule macchiato mediante citometria di flusso 14. </li></ol> 6. L&#39;omogeneizzazione di tessuto polmonare per isolare l&#39;RNA <ol><li> Dopo l&#39;infezione, raccogliere un piccolo pezzo di polmone (20-40 mg) e conservarlo in RNA stabilizzante reattivo a 4 ° C durante la notte. Poi, conservare a -80 ° C fino alla fase successiva. </li><li> Lavare i tessuti del polmone a freddo 1x PBS per sbarazzarsi del reagente stabilizzazione RNA. </li><li> Posizionare il tessuto in un tampone di lisi contenente 1,5 ml tubo da centrifuga (1 ml di buffer di lisi + 10 ml β-mercaptoetanolo). </li><li> Tritare il tessuto in piccoli pezzi con le forbici a punta ed omogeneizzare con un cordless pestello pellet motore per 20-40 secondi. </li><li> Mantenere il lisato in ghiaccio per 5 minuti e procedere con passo 7.1. </li></ol> 7. Isolamento RNA dal polmone <ol><li> Centrifugare il lisato a 18.000 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante pipettando e trasferire con cura in una nuova provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 1 volume di etanolo 70% al lisato. Mescolare immediatamente pipettando e aspettare 2-4 minuti. </li><li> Trasferire fino a 700 ml di lisato ad una colonna di spin localein un tubo di raccolta 2 ml. </li><li> Centrifugare a 9.600 xg per 15 sec e scartare il flow-through. </li><li> Aggiungere 350 microlitri tampone di lavaggio stringente e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 80 microlitri DNasi direttamente alla membrana Spin Column e mantenere a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Aggiungere 350 microlitri tampone di lavaggio stringente alla colonna di spin e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 500 microlitri tampone di lavaggio RNA e centrifugare a 9.600 xg per 15 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 500 microlitri tampone di lavaggio RNA e far girare a 9.600 xg per 2 minuti. Gettare il flow-through. </li><li> Porre la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml e centrifugare a 9.600 xg per 1 min. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 30-50 acqua priva di RNasi microlitri direttamente alla colonna di spin e centrifugare a 9.600 xg per 1 min. RNA Conservare a -80 ° C. </li><li> Eseguire l&#39;analisi RNA-Seq 14. </li></ol>

<ol><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+asthma+and+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).</li>
<li>Sethi, S., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+the+pathogenesis+and+course+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease.</a> N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).</li>
<li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lung+Immune+Response+to+Nontypeable+Haemophilus+influenzae+%28Lung+Immunity+to+NTHi%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi).</a> J Immunol Res. 2015, 706376(2015).</li>
<li>Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+airway+microbiology+and+cellularity+in+children+with+newly+diagnosed+non-CF+bronchiectasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis.</a> Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).</li>
<li>King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+PT+%22Respir+Med%22">Respir Med</a>. 101, 1633-1638 (2007).</li>
<li>Shuto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NF-kappa+B+by+nontypeable+Hemophilus+influenzae+is+mediated+by+toll-like+receptor+2-TAK1-dependent+NIK-IKK+alpha+%2Fbeta-I+kappa+B+alpha+and+MKK3%2F6-p38+MAP+kinase+signaling+pathways+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).</li>
<li>Moghaddam, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+lysate+induces+aspects+of+the+chronic+obstructive+pulmonary+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+exposure+to+bacterial+superantigens+induces+airway+inflammation+in+HLA+class+II+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice.</a> Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).</li>
<li>Ganesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase%2FLPS-exposed+mice+exhibit+impaired+innate+immune+responses+to+bacterial+challenge%3A+role+of+scavenger+receptor+A%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A.</a> Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).</li>
<li>Hogner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-expressed+IFN-beta+contributes+to+apoptotic+alveolar+epithelial+cell+injury+in+severe+influenza+virus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia.</a> PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).</li>
<li>Karisola, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+Natural+Killer+T+Cells+Play+a+Role+in+Chemotaxis%2C+Complement+Activation+and+Mucus+Production+in+a+Mouse+Model+of+Airway+Hyperreactivity+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation.</a> PloS one. 10, e0129446(2015).</li>
<li>Theivanthiran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+Itch+inhibits+p38alpha+signaling+and+skin+inflammation+through+the+ubiquitylation+of+Tab1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1.</a> Sci Signal. 8, 22(2015).</li>
<li>Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+role+of+the+ubiquitin+ligase+Itch+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation.</a> Immunol Cell Biol. , (2015).</li>
<li>Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic obstructive pulmonary disease.</a> Lancet. 379, 1341-1351 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, si descrive una procedura unica e minimamente invasiva per inoculare i polmoni di topi con un agente patogeno batterico ai polmoni. Abbiamo dimostrato che questa procedura può essere utilizzata per studiare la funzione di geni differenti utilizzando topi che sono carenti di geni di vie di segnalazione infiammatorie. Questa procedura può anche essere usato per studiare le risposte infiammatorie alle infezioni polmonari virali e fungine. I vantaggi di questo procedimento rispetto ad altri metodi come intranasale o in...

L&#39;infiammazione è un meccanismo immunitario fondamentale di difesa contro gli agenti infettivi. Promuove eradicazione e la riparazione dei tessuti danneggiati patogeno. Inoltre facilita il recupero ad un normale stato di salute 1. Tuttavia, l&#39;infiammazione disregolato spesso porta a malattie infiammatorie croniche 2. Infiammazione delle vie aeree è un trigger iniziale per diverse malattie polmonari come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), asma e fibrosi polmonare 3. L&#39;Haemophilus influenzae non tipizzabile (non incapsulata) (NTHi) è associata a malattie infiammatorie superiori ed inferiori polmonari croniche 4,5. E &#39;la specie dominante isolati dalle vie aeree inferiori di bambini e adulti con cronica ostruttiva 4,6,7 malattia polmonare. La risposta infiammatoria dopo l&#39;infezione NTHi è caratterizzata dalla sovraregolazione di citochine proinfiammatorie (come TNF e IL-1β), ed è mediata by mitogeno proteina chinasi attivata (MAPK) e fattore nucleare-kB (NF-kB) attraverso i recettori Toll-like (TLR) 8. Modelli murini sono strumenti molto utili per analizzare la patologia sottostante del polmone malattia infiammatoria a causa della disponibilità di diverse linee gene-carenti. Diversi metodi sono stati utilizzati per inoculare batteri vivi attenuati / e prodotti batterici, tra intranasale instillazione e aerosolized 9,10 inalazione. Qui, dimostriamo intra-tracheale instillazione. Sebbene utilizzato meno frequentemente, questo approccio è più efficace e altamente riproducibili a causa della consegna diretta dell&#39;inoculo al tratto respiratorio inferiore.

<table><tbody><tr><td>Piastra agar per cioccolato</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio anidro</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Hospira, Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione rapida Deft</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa 20/26G&nbsp;</td><td>BD(</td><td>REF305115/175)</td><td></td></tr><tr><td>Iml siringa</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Catetere 20GA</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td></tr> 381433 <tr><td>Forbici da dissezione, diritte, lunghe 10 cm</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per iride, seghettate, lunghe 10 cm</td><td>kentscientific</td> Pinzetta <td>per INS650915</td><td></td></tr><tr><td>#5 in acciaio inossidabile, lunga 11 cm</td><td>kentscientific</td><td></td><td></td>INS600095</tr><tr><td>10% Formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 5 ml in polistirene a fondo tondo</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Motore pestile a pellet (Omogeneizzatore tissutale)</td><td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96 piastre per microtitolazione a pozzetti Fondo V</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Diluizione di lavoro 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Diluizione di lavoro 1:100</td></tr><tr><td>BSA</td><td>HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi RBC (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione per cellule morte aqua riparabile Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/ CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>tubi Facs tubo fondo tondo polistirene</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

intra-tracheale amministrazione<em&gt; haemophilus influenzae</em&gt; in modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Qui, descriviamo una procedura dettagliata in modo efficiente e fornire direttamente Haemophilus influenzae attraverso le vie respiratorie inferiori di topi. Dimostriamo la procedura per la preparazione H. influenzae inoculo, instillazione intra-tracheale di H. influenzae nel polmone, raccolta di liquido di lavaggio bronco-alveolare (BAL), l&#39;analisi delle cellule immunitarie nel BAL, e l&#39;isolamento di RNA per differenziale analisi di espressione genica. Questa procedura può essere utilizzata per studiare la risposta infiammatoria polmonare a qualsiasi batteri, virus o funghi. instillazione tracheale diretta è per lo più preferito su procedure intranasale o inalazione di aerosol in quanto fornisce in modo più efficiente l&#39;inoculo batterico nel tratto respiratorio inferiore, con meno ambiguità.

Instillazione intra-tracheale provocato un marcato aumento del numero di leucociti nel BALF (Figura 1A, pannello di sinistra) di installazione con soluzione salina. L&#39;analisi conteggio differenziale dei leucociti mostrato chiaramente migliore infiltrazione dei neutrofili (Figura 1, pannello di destra). L&#39;analisi FACS delle cellule nel BALF confermato ulteriormente l&#39;aumento del numero di neutrofili (Figura 1B). L&#39;analisi ...

Dimostriamo la procedura per l'inoculazione intra-tracheale di Haemophilus influenzae nel tratto respiratorio inferiore dei topi. Questo è uno strumento molto utile per studiare le vie di segnalazione che regolano l'infiammazione delle vie aeree nei modelli murini.

Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare le risposte immunitarie nel polmone durante un'infezione batterica. Questo argomento può contribuire a rispondere ad alcune domande fondamentali nel campo dell'infiammazione polmonare, come ad esempio quali sono i principali meccanismi regolatori e i geni che inibiscono o promuovono l'infiammazione polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto efficiente e altamente riproducibile grazie alla somministrazione diretta dell'inoculo batterico nelle vie respiratorie inferiori.Per iniziare, seminare il NTHi su una piastra di agar al cioccolato. Incubare la piastra capovolta per tutta la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, coltivare i batteri in un brodo di infusione cerebrale-cardiaca.Quindi, in un tubo da microcentrifuga, aggiungere un millilitro di terreno. Centrifugare il campione a 4.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di PBS.Ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta. Successivamente, diluire 100 microlitri di soluzione ri-sospesa in 900 microlitri di PBS e misurare l'assorbanza della coltura a 600 nanometri. Utilizzare queste informazioni per aggiustare l'inoculo a 20 milioni di UFC per millilitro.Successivamente, determinare la vitalità e le UFC dell'inoculo. Coltivare da una a dieci diluizioni seriali del brodo su piastre di agar al cioccolato e incubare le piastre durante la notte. Iniziare anestetizzando il topo e verificare che sia adeguatamente anestetizzato mediante una pinzatura del dito del piede.Quindi, posizionare il topo in posizione supina e rasare la regione ventrale del collo. Disinfettare la cute esposta. Ora, sollevare la cute della parte ventrale superiore del collo con pinze a denti da ratto e, utilizzando un bisturi, praticare un'incisione lunga da mezzo a un centimetro al di sopra del timo.Quindi, separare con attenzione il muscolo per esporre la trachea. Nella trachea, iniettare lentamente 50 microlitri di aria, seguiti da 50 microlitri di NTHi preparato, e quindi da altri 50 microlitri di aria. Come procedura di controllo negativo, iniettare soluzione salina invece di NTHi.Dopo l'iniezione, mantenere l'animale in posizione verticale per circa un minuto. Successivamente, chiudere l'incisione con un adesivo tissutale e mantenere il topo in posizione laterale e al caldo per circa 10 minuti. 24 ore dopo l'infezione, eutanasia l'animale infetto e aprire la cavità addominale con forbici anatomiche.Quindi, recidere l'aorta ventrale per sanguisare l'animale. Successivamente, esporre la parte ventrale del polmone per accedere alla trachea. Intubare la trachea con un catetere di calibro 20.Utilizzando il catetere, instillare 0,8 millilitri di tampone BALF e raccogliere il lavaggio mediante aspirazione dentale. Ripetere questa procedura altre tre volte, unendo le quattro raccolte di lavaggio in un'unica sospensione. Prelevare un'aliquote di 100 microlitri e centrifugare per due minuti a 2.000 giri al minuto.Rimuovere il soprannatante e risospendere nel buffer di lisi dei globuli rossi. Centrifugare e risospendere il pellet con PBS 1x. A questo punto, contare il numero totale di cellule in 100 microlitri della sospensione utilizzando un emocitometro con ingrandimento 10x e colorazione con blu di tripano.Quindi, preparare i vetrini per la colorazione delle cellule. Aliquotare 100 microlitri di sospensione di LBA nei pozzetti appropriati dei vetrini per citocentrifuga e centrifugare i vetrini a 500 g per cinque minuti. Successivamente, asciugare i vetrini per 10 minuti a temperatura ambiente e colorare le cellule utilizzando una colorazione Giemsa modificata secondo i protocolli del produttore.Utilizzare le cellule residue per analisi successive, come ad esempio FACS, microscopia confocale e così via. Dopo aver raccolto il lavaggio dal polmone infetto, prelevare un frammento di polmone di 20-40 milligrammi e incubarlo in un reagente stabilizzante per l'RNA a quattro gradi Celsius durante la notte, seguito da conservazione a lungo termine a 80 gradi Celsius. Quando pronto, lavare i campioni di tessuto polmonare in PBS freddo per rimuovere il reagente di stabilizzazione dell'RNA.Quindi, posizionare il tessuto in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri contenente buffer di lisi con beta-mercaptoetanolo. Successivamente, con forbici piccole, tagliare il tessuto in pezzi e omogeneizzare i frammenti utilizzando una pestello motorizzato per 20-40 secondi. Mantenere il lisato sul ghiaccio per cinque minuti, quindi centrifugare a 18.000 g per tre minuti.Rimuovere con attenzione il soprannatante e trasferirlo in un nuovo tubo. Quindi aggiungere un volume di etanolo al 70% e tritare la miscela. Lasciare riposare la miscela a 25 gradi Celsius per due o quattro minuti.Quindi, trasferire fino a 700 microlitri su una colonna da centrifuga posizionata su un tubo di raccolta da due millilitri e centrifugare la colonna a 9600 g per 15 secondi. Scartare il flusso passante, aggiungere 350 microlitri di tampone di lavaggio e ripetere la centrifugazione. Successivamente, incubare la membrana con 80 microlitri di soluzione di DNasi I per 15 minuti a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere 350 microlitri di buffer di lavaggio sulla colonna e ripetere la centrifugazione. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio per RNA. Ripetere una breve centrifugazione e scartare il flusso passante.Eseguire due lavaggi con tampone di lavaggio per RNA. Infine, sopra una nuova provetta di raccolta, aggiungere direttamente sulla colonna 30-50 microlitri di acqua priva di RNasi e centrifugare per un minuto per raccogliere il campione di RNA nel flusso passante. La procedura è stata eseguita come descritto utilizzando topi normali e sani.L'installazione intratracheale ha determinato un aumento notevole del numero di leucociti nel liquido di lavaggio broncoalveolare dei topi inoculati con NTHi rispetto ai controlli trattati con soluzione salina. L'analisi della conta differenziale dei leucociti mostra chiaramente un aumento dell'infiltrazione di neutrofili. L'analisi fattoriale delle cellule nel BALF conferma ulteriormente l'aumentato numero di neutrofili.Le sezioni colorate con HNE del tessuto polmonare mostrano un aumento dell'infiammazione delle vie aeree. Nel complesso, questi dati suggeriscono che l'installazione intratraqueale induce infiammazione delle vie aeree nei topi. In un esperimento simile condotto con topi mutanti e di controllo, l'RNA del tessuto polmonare è stato analizzato mediante sequenziamento dell'intero trascrittoma.Rispetto ai controlli di tipo selvatico, la carenza di Itch ha determinato un'espressione differenziale di diversi geni. Si ritiene che Itch sia un regolatore delle vie di segnalazione infiammatoria, pertanto questo risultato può essere utilizzato per promuovere nuovi studi. Durante tutto il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie polmonari per esplorare la segnalazione cellulare nelle cellule immunitarie durante infezioni e infiammazioni polmonari.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di adottare precauzioni aggiuntive durante operazioni come l'esposizione della trachea e l'installazione di batteri nella trachea. Una volta acquisita padronanza, l'installazione intratracheale può essere eseguita entro dieci minuti e il fluido del vial può essere raccolto entro 10-15 minuti. Dopo questa procedura, possono essere effettuate ulteriori analisi come il sequenziamento dell'RNA, la citometria a flusso e l'immunoblocco per rispondere ad altre domande, ad esempio quali geni sono upregolati o downregolati.

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