Name: A monte intero In Situ Metodo ibridazione per la molluschi gasteropodi stagnalis Lymnaea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ a monte intero per visualizzare i pattern di espressione genica negli embrioni e nelle larve di Lymnaea stagnalis. Questo metodo facilita la ricerca in biologia dello sviluppo e Evo-Devo.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di DJJ attraverso il progetto DFG # JA2108 / 2-1.

NOTA: Le seguenti operazioni delineano il nostro metodo per condurre un esperimento in situ su stadi embrionali e larvali di L. stagnalis. Qualora un passo prevede l&#39;utilizzo di un prodotto chimico pericoloso questo è indicato dalla parola &#39;ATTENZIONE&#39; e tutte le procedure di sicurezza appropriate devono essere adottate. Collegamenti a fogli rappresentative scheda di sicurezza per sostanze chimiche pericolose sono forniti in file supplementare 1. Ricette per tutti i reagenti sono forniti in file integrativa 2. 1. Assemblea dei Decapsulation Apparato <ol><li> Per fare questo, collegare un 20 siringa monouso ml a tubo in silicone (con diametro interno di 1 mm e un diametro esterno di 3 mm) utilizzando un taglio punta P 1.000 a una lunghezza appropriata come mostrato nella Figura 2A. </li><li> Nastro un vetrino da microscopio standard per un grande piatto di Petri invertita. Nastro il tubo in silicone immediatamente adiacente al vetrino da microscopio, come mostrato in figura60; 2C e 2D. </li><li> Riposo un ago di vetro tirato sul vetrino e delicatamente inserirla nel tubo di silicio fino a che la punta dell&#39;ago sporge circa il 20% del modo attraverso il diametro interno del tubo (vedere la Figura 2C e 2D). Una volta che l&#39;ago è in posizione del nastro verso il basso al piatto Petri. </li><li> Lasciare che l&#39;estremità libera del tubo di silicio di riposare in un altro piatto di Petri che raccoglierà il materiale decapsulated. </li></ol> 2. Raccolta dei campioni, Fissazione e Decapsulation NOTA: Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato. <ol><li> Raccogliere accuratamente stringhe di uova dalle mura di un acquario. Per fare questo, utilizzare un pezzo di plastica flessibile come una spatola per raschiare la stringa uovo fuori dal substrato, e utilizzare un setaccio del tè di plastica a pescare la stringa uovo galleggiante fuori dall&#39;acqua. Stage e ordinare il materiale sotto un microscopio utilizzando la guida fornita in Figura1. </li><li> Posizionare la stringa uovo su un tovagliolo di carta e fare una incisione longitudinale lungo la massa delle uova usando le pinze piuma. Arrotolare le capsule uovo fuori della stringa uovo e rimuovere la maggior quantità di materiale gelatinoso possibile da ogni capsula spingendoli intorno al tovagliolo di carta utilizzando le pinze piuma. </li><li> Utilizzando le pinze piuma, trasferire le capsule a base di uova in una capsula di Petri contenente 5 ml di acqua di rubinetto. Continuare a raccogliere de-gelatina capsule uovo degli stadi di sviluppo desiderati in questo piatto. Raccogliere abbastanza capsule da tutti gli stadi di sviluppo per l&#39;esperimento WMISH previsto quindi procedere alla fase successiva. </li><li> Quando si lavora con le larve più sviluppati (5 giorni dopo prima scissione (dpfc) e più anziani) anestetizzare loro prima della fissazione. NOTA: Questo consentirà di evitare i muscoli dal contraente che fa l&#39;interpretazione in situ pattern di colorazione molto difficili. <ol><li> Relax larve (mentre sono ancora nella loro capsules) in una soluzione al 2% w / v di MgCl 2 • 6H 2 O per 30 minuti prima della fissazione. </li><li> Valutare il grado di rilassamento dopo 30 min immergendo diverse larve, pur nelle loro capsule uovo in soluzione fissativo e monitorare la loro risposta al microscopio. Incompleto larve rilassato si ritrae nel loro guscio, mentre le larve completamente rilassato non risponderà. Una volta che queste larve sono state rilassato procedere alla fase successiva. </li></ol></li><li> Trasferire le capsule uovo usando un&#39;ampia pipetta di plastica foro in un tubo sigillato che fornisce 10 volte il volume di capsule uovo (per es., 1 ml di capsule regolate richiederebbe un tubo 10+ ml). </li><li> Aspirare il più liquido possibile dal tubo e sostituirlo con un volume di soluzione di fissativo che è 10 volte il volume delle capsule uovo stanziali. Ruotare delicatamente le capsule a base di uova in fissativo a temperatura ambiente per il momento opportuno per ogni fase di sviluppo (vedi Figura 1). </li><li> DiscontinRotazione ue e consentire le capsule per affondare e aspirare la soluzione fissativo in un contenitore per i rifiuti appropriato. </li><li> Lavare le capsule uovo sostituendo la soluzione fissativa con tampone fosfato con 0,1% Tween-20 (PBTw) e rotante a temperatura ambiente per 5 min. Aspirare il PBTw e ripetere due volte. </li><li> Rimuovere embrioni e larve di loro capsule utilizzando l&#39;apparecchiatura (vedi paragrafo 1 per i dettagli) mostrata nella Figura 2. Disegnare le capsule nella siringa 20 ml, collegare il tubo e poi dissipare le capsule attraverso il tubo e passato il ago di vetro fuori in il piatto di raccolta. NOTA: In genere, la maggior parte (&gt; 90%) di tutte le capsule dovrebbe essere necessario solo un passaggio attraverso il dispositivo. In molti casi la membrana capsula è danneggiato ma embrioni e larve rimangono all&#39;interno della capsula rottura. Rielaborare questo materiale semplicemente la sua elaborazione nella siringa e dissipare nuovo. </li><li> Raccogliere gli embrioni decapsulate e larve in una provetta da 1,5 ml con un microfonoropipette (a P20 per sul 0 - 3 giorno di età larve, e P200 per le larve anziani con l&#39;estremità della punta tagliati). NOTA: Una pausa (fino a diversi mesi) nel protocollo può essere fatta in questa fase. Se ciò è necessario, il materiale decapsuled dovrebbe essere raccolto in una provetta da 1,5 ml per immagazzinaggio (continua alla fase successiva). In caso contrario, continua immediatamente al protocollo 3. </li><li> Lasciare embrioni e larve a depositarsi sul fondo del tubo e aspirare il surnatante. Sostituire con 33% di etanolo (EtOH) in PBTw e lasciate riposare per 5 - 10 minuti. Ripetere con il 66% EtOH in PBTw e il 100% EtOH. Lavare larve due volte in 100% EtOH a RT. Conservare il materiale a -20 ° C in 100% EtOH. </li><li> Quando si è pronti per continuare, reidratare i campioni rimuovendo il 100% EtOH e la sua sostituzione con il 66% EtOH in PBTw, lasciate riposare per 5 - 10 minuti. Ripetere con il 33% EtOH in PBTw, lasciate riposare per 5 - 10 minuti. Infine lavare con 3x 5 min lavaggi di PBTw per garantire che tutti EtOH viene rimosso. </li></ol> 3. proteinasi-K, TEA e Post-fifissazione NOTA: Troviamo eseguire le seguenti operazioni in piccole ceste con un pavimento a rete il metodo più efficace e delicata per lo scambio rapido di soluzioni critiche di tempo. Mentre questi possono essere fatti in casa, usiamo i cestini (di medie dimensioni) che sono compatibili con il Intavis InSituPro -Vsi movimentazione liquido robot (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Tali cesti possono essere rapidamente e facilmente spostati tra i pozzetti di una ben coltura tissutale piatto 12 (TCD) per soluzioni di cambio, oppure la soluzione può essere aspirati dal pozzetto con una pipetta. In alternativa, tutti gli scambi di soluzioni possono essere effettuate senza questi cestini semplicemente aspirare il surnatante dal larve. In questo caso un delicato movimento rotatorio si concentrerà tutti gli embrioni e larve al centro del piatto permettendo il surnatante viene rimosso dal bordo del pozzo. Di seguito si presuppone che l&#39;utente sta impiegando cestini per lo scambio di soluzioni. <ol><li> Usando una pipetta, Embrioni e larve di trasferimento in un cesto seduto in un 12 ben TCD con 2 ml di PBTw. NOTA:. Il numero di embrioni e / o larve che possono essere aggiunti dipende dallo stadio di sviluppo in fase di studio, ma una regola generale è quello di mantenere almeno il 25% dello spazio al suolo privo di embrioni / larve (vale a dire, non lo fanno sovraffollamento nel carrello). </li><li> Preparare un adiacente bene con 2 ml di soluzione di proteinasi-K appropriata (vedi Figura 1), e un altro 2 pozzetti con 2 ml di 0,2% Glycine ciascuna. Spostare ogni canestro nel pozzo contenente la concentrazione appropriata di proteinasi-K ed iniziare immediatamente la tempistica. </li><li> Dopo 10 min spostare ciascun cestello in un pozzetto contenente 0,2% Glicina e incubare per 5 min. Quindi spostare ciascun cestello nella seconda sacca con 0,2% Glicina e incubare per 5 min. Lavare la glicina con 3x 5 min scambi di 3 ml PBTw. </li><li> Rimuovere la soluzione PBTw e trattare i campioni una volta con trietanolammina (TEA) sol preparati al momentoution per 5 min ATTENZIONE! Non agitare. Sostituire con 3 ml di soluzione di tè appena preparato per 5 min. Non agitate. Aspirare la maggior parte della soluzione di TEA dai campioni. Aggiungere il Trietanolammina appena preparato con la soluzione di anidride acetica (TEAAA) e incubare per 5 min. ATTENZIONE! Non si agita. </li><li> OPTIONAL - Mentre il passo precedente è in incubazione, preparare un altro lotto fresco di soluzione TEAAA e ripetere il passo precedente. NOTA: Questo secondo trattamento con TEAAA è facoltativo, ma può aiutare a eliminare completamente tutti i sfondo con sonde inclini a generare sfondo. </li><li> Rimuovere la soluzione TEAAA aspirando dal pozzo e sostituire con 3 ml di PBTw. Non agitate. Rimuovere il PBTw e applicare 3 ml di 3,7% di formaldeide in PBTw. Mescolare delicatamente di tanto in tanto nel corso di un 30 minuti di incubazione. </li><li> Rimuovere il fissativo aspirando dal pozzo e sostituire con 3 ml di PBTw. Trasferire il materiale in una provetta da 1,5 ml. REPosizionare il PBTw con tampone di ibridazione e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente - ATTENZIONE. </li><li> Porre i tubi in un blocco a caldo a temperatura ambiente, e impostare la temperatura alla temperatura desiderata ibridazione. NOTA: La temperatura di ibridazione è sonda specifica e dovrà essere empiricamente ottimizzati, tuttavia troviamo 55 ° C per essere una buona temperatura di processo inizialmente. Lasciare il blocco di venire alla temperatura di ibridazione, e permettere ai campioni di pre-ibridano per circa 15 min (cioè, il tempo necessario per preparare le riboprobes, più non è necessario). Preparare volumi adeguati (normalmente 100 mL) dei riboprobes diluiti. Abbiamo concentrazioni sonda genere di prova di 100 e 500 ng / ml come una gamma iniziale. Prepariamo riboprobes secondo 12. </li><li> Rimuovere il tampone di ibridazione dai campioni e aggiungere la sonda nel tampone di ibridazione ai campioni. Overlay con 100 microlitri (o un volume sufficiente per formare una fase sopra la buffe ibridazioner) di olio minerale. NOTA: L&#39;olio minerale impedisce vasta condensa che si forma durante l&#39;ibridazione lunga. condensa Extensive altererà significativamente sia la chimica della soluzione di ibridazione e la concentrazione della sonda. </li><li> Denaturare la sonda e RNA bersaglio riscaldando i campioni a 75 ° C per 10 minuti, poi ridurre il calore alla temperatura di ibridazione desiderata. Lasciare ibridazione di procedere per un minimo di 12 ore (O / N) o più a lungo (24-48 ore). </li><li> Durante l&#39;ibridazione rimuovere un singolo tubo dal blocco di calore, ruotare rapidamente tra pollice e indice di sospendere le larve senza disturbare la fase oleosa, e sostituirlo nel blocco di calore. Ripetere questa volta ogni 6-12 ore o giù di lì. </li></ol> 4. Hot Lava e immunorilevazione NOTA: Oltre ad utilizzare un robot di movimentazione liquido per le seguenti operazioni, queste possono facilmente essere fatto manualmente. In questo caso, gli embrioni e larve shoULD essere conservato in provette da 1,5 ml sono stati ibridati in. Tutti gli scambi di soluzioni successive vengono aspirati e ha aggiunto con una pipetta P 1.000. Quando eseguito manualmente ognuno dei seguenti passaggi dovrebbero impiegare 1 ml di ciascuna soluzione. <ol><li> Calore volumi adeguati (3 ml ciascuno per ogni campione) del 4x, 2x e 1x soluzioni di lavaggio alla temperatura di ibridazione. </li><li> Lavare tutti i campioni tre volte in tampone di lavaggio 4x per 15 minuti ciascuno alla temperatura di ibridazione. Lavare tutti i campioni tre volte in tampone di lavaggio 2x per 15 minuti ciascuno alla temperatura di ibridazione. Lavare tutti i campioni tre volte in tampone di lavaggio 1X per 15 minuti ciascuno alla temperatura di ibridazione. </li><li> Lavare tutti i campioni una volta con 1x Sodio cloruro Sodio Citrato tampone + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) alla temperatura di ibridazione. Lasciare che i campioni raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tutti i campioni due volte in 1x SSC + 0,1% Tween per 15 min Sostituire questa soluzione SSC 1x con maleica Acid Buffer (MAB) e lasciate riposare per 10 minuti Ripetete il MAB wcenere. Sostituire MAB con la soluzione di blocco e incubare per 1,5 ore. </li><li> Sostituire la soluzione di blocco per soluzione di anticorpi (1: 10.000 diluizione degli anticorpi in soluzione di blocco) e incubare per 12 ore (O / N) a temperatura ambiente con agitazione. </li></ol> 5. Colore di sviluppo e di montaggio <ol><li> Aspirare la soluzione di anticorpi e lavare 15 volte con PBTw per 10 minuti ciascuno. Sostituire PBTw con 1x fosfatasi alcalina Buffer (AP) e incubare per 10 min. </li><li> Mentre i suddetti proventi fase di incubazione, preparare la soluzione colorante AP (vedi file supplementare 2) - ATTENZIONE. Trasferire il materiale in un TCD bene e sostituire la soluzione 1x AP con la soluzione AP colorazione. Si noti il ​​tempo in modo che la lunghezza del tempo di reazione di colore avviene per può essere registrato. Monitorare lo sviluppo del pattern di colorazione finché il rapporto segnale sfondo è ottimale. </li><li> Per fermare lo sviluppo del colore, rimuovere la soluzione colorante 1x AP (smaltire nel eri appropriatae container), e applicare 2 ml di PBTw e prendere nota del tempo. Lavare due volte con PBTw per 5 minuti ciascuna. Utilizzare uno di questi risciacqui per trasferire il materiale in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Rimuovere il PBTw e applicare 1 ml di 3,7% di formaldeide in PBTw e agitare o ruotare per almeno 30 min a RT (ciò può essere fatto anche O / N). </li><li> Lavare il fissativo con 3 lavaggi di PBT (smaltire il fissativo rifiuti in un contenitore per i rifiuti appropriato). Lavare i campioni 3 volte a 50 ° C in acqua deionizzata. NOTA: Questi lavaggi eliminano la precipitazione dei sali che può diventare visibile durante la compensazione e passaggi di visualizzazione. </li><li> Decidere se i campioni devono essere montati in benzoato benzilico: Alcool benzilico (BB: BA, noto anche come chiaro di Murray) o glicerolo. NOTA: Preferiamo il più potente agente di compensazione BB: BA come L. embrioni stagnalis sono un po &#39;opaco. I campioni per essere montati in BB: BA in primo luogo bisogno di essere disidratati attraverso una serie di etanolo. I campioni da montare nel 60%glicerolo può essere montato immediatamente. </li><li> Trasferire i campioni nella soluzione di montaggio (BB: BA o 60% glicerolo) con una pipetta. NOTA: Durante il montaggio in BB: BA questo deve essere fatto in un bicchiere ben (BB: BA si scioglierà policarbonato). </li><li> Consentire ai campioni di chiaro per 5 - 10 minuti, e poi montarli su un vetrino con un numero adeguato di vetrini accatastati come distanziatori (1 vetrino per i campioni &lt;1 dpfc, 2 lamelle per campioni&gt; 1 dpfc). NOTA: i supporti interi possono ora essere ripreso con un microscopio composto con ottica DIC. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo qui descritto permette la visualizzazione efficiente dei trascritti di RNA con presumibilmente diversi livelli di espressione all&#39;interno di tutte le fasi di sviluppo di Lymnaea stagnalis. Per rimuovere gli embrioni e larve dalle loro capsule abbiamo trialed una varietà di sostanze chimiche, shock osmotico e trattamenti fisici riportati per altri encapsulated- lo sviluppo di organismi modello. Tuttavia, nelle nostre mani il metodo che descriviamo qui è l&#39;unica tecnica high-throughput che rimuo...

I molluschi sono un gruppo di animali che tengono l&#39;interesse di una vasta diversità di discipline scientifiche. Nonostante la loro diversità morfologica 1, ricchezza di specie (secondo solo a Artropodi in termini di numero di specie 2) e rilevanza per una vasta gamma di commerciali 3, 4 medici e scientifici questioni 5-8, ci sono relativamente poche specie di molluschi che possono vantare di essere entrambi i modelli scientifici ben attrezzate e facili da mantenere in un ambiente di laboratorio. Un mollusco che è molto utilizzato da discipline come la neurobiologia 9, ecotossicologia 10 e la biologia evolutiva, più recentemente 11,12, è Lymnaea stagnalis, soprattutto a causa della sua distribuzione capillare ed estrema facilità di manutenzione. Nonostante la sua popolarità come un organismo &#39;modello&#39; e la sua lunga storia di utilizzo da parte di biologi dello sviluppo 13-19, la gamma e la potenza di strumenti molecolari a disposizione del L. stagnalis comunità scientifica si trova molto indietro che di più modelli tradizionali animali (Drosophila, il mouse, ricci di mare, nematodi). Il nostro desiderio di sviluppare Lymnaea come un modello molecolare deriva da un interesse per i meccanismi molecolari che guidano la formazione del guscio. Questo ci ha spinto a perfezionare un insieme di tecniche che permettano per la visualizzazione efficiente, coerente e sensibile dell&#39;espressione genica durante lo sviluppo Lymnaea s &#39;. Montare tutto ibridazione in situ (WMISH) è ampiamente utilizzato per una varietà di organismi modello ed è stato in uso per più di 40 anni 20. Nelle sue varie forme, ISH può essere impiegato per localizzare spazialmente loci specifici sui cromosomi, rRNA, mRNA e micro-RNA. Una delle sfide che abbiamo bisogno di affrontare prima di perfezionare un metodo per WMISH L. stagnalis è stata la questione degli embrioni estrazione dolcemente e in modo efficiente e larve di varie fasi, dalla tsi capsule uovo in cui sono depositati. Questa estrazione, o &#39;decapsulation&#39;, deve essere realizzato in modo efficiente per raccogliere materiale adeguato per un dato esperimento in situ, mentre allo stesso tempo mantenere l&#39;integrità morfologica e cellulare. Mentre altri organismi modello subiscono anche lo sviluppo incapsulato, nelle nostre mani nessuno dei metodi riportati per quelle specie potrebbe essere impiegato con successo in L. stagnalis. Gli obiettivi generali di questo metodo sono quindi: per estrarre L. stagnalis embrioni e larve dalle loro capsule in un modo high-throughput, di applicare i trattamenti pre-ibridazione che ottimizzano il segnale WMISH, per preparare gli embrioni e larve con WMISHsignals soddisfacenti per l&#39;imaging.

<table><tbody><tr><td>Pinze peso piuma</td><td>Ehlert & Partner</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in silicone</td><td>Glasger&auml; tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 piastre per coltura tissutale</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldeide</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>ATTENZIONE - Può causare il cancro. Tossico per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito. Tossico: pericolo di effetti irreversibili molto gravi per inalazione, a contatto con la pelle e in caso di ingestione.</td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>ATTENZIONE - PROVOCA IRRITAZIONE AGLI OCCHI. PUÒ CAUSARE IRRITAZIONE DELLE VIE RESPIRATORIE E DELLA PELLE. Evitare di respirare la polvere. Evitare il contatto con gli occhi, la pelle e gli indumenti. Utilizzare solo con un'adeguata ventilazione</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>ATTENZIONE - Può essere dannoso se inalato. Può causare irritazione delle vie respiratorie. Può essere dannoso se assorbito attraverso la pelle. Può causare irritazioni cutanee. Può causare irritazione agli occhi. Può essere dannoso se ingerito.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll tipo 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>polivinilpirrolidone K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>ATTENZIONE - Può essere dannoso se inalato. Può causare irritazione delle vie respiratorie. Può essere dannoso se assorbito attraverso la pelle. Può causare irritazioni cutanee. Può causare irritazione agli occhi. Può essere dannoso se ingerito.</td></tr><tr><td>Senza nucleasiSiero bovino Albumina</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>Sperma di salmone</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>ATTENZIONE - GLI EFFETTI AVVERSI INCLUDONO EMORRAGIA, IRRITAZIONE LOCALE. POSSIBILE REAZIONE ALLERGICA SE INALATO, INGERITO/CONTATTATO. IRRITANTE PER OCCHI/PELLE/VIE RESPIRATORIE. POSSIBILE IPERSENSIBILIZZAZIONE. È STATO SEGNALATO CHE DURANTE LA GRAVIDANZA AUMENTA IL RISCHIO DI NATIMORTALITÀ</td></tr><tr><td>Proteinasi-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>Formammide deionizzata</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>ATTENZIONE - Irritante per gli occhi e la pelle. Può essere dannoso per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito. Può causare danni al nascituro. Igroscopico.</td></tr><tr><td>Formamide standard</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>ATTENZIONE - Irritante per gli occhi e la pelle. Può essere dannoso per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito. Può causare danni al nascituro. Igroscopico.</td></tr><tr><td>Trietanolammina</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>ATTENZIONE - Evitare di respirare vapore o nebbia. Evitare il contatto con gli occhi. Evitare il contatto prolungato o ripetuto con la pelle. Lavare accuratamente dopo la manipolazione.</td></tr><tr><td>Anidride acetica</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>ATTENZIONE - PROVOCA GRAVI USTIONI ALLA PELLE E AGLI OCCHI. REAGISCE VIOLENTEMENTE CON L'ACQUA. NOCIVO SE INGERITO. VAPORI IRRITANTI PER GLI OCCHI E LE VIE RESPIRATORIE</td></tr><tr><td>Acido maleico</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>ATTENZIONE - Molto pericoloso in caso di contatto con gli occhi (irritante), di ingestione, . Pericoloso in caso di contatto con la pelle (irritante), di inalazione (irritante polmonare). Leggermente pericoloso in caso di contatto con la pelle (permeatore). Corrosivo per gli occhi e la pelle.</td></tr><tr><td>Benzil benzoato</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td>ATTENZIONE - Può essere dannoso se inalato. Può causare irritazione delle vie respiratorie. Può essere dannoso se assorbito attraverso la pelle. Può causare irritazioni cutanee. Può causare irritazione agli occhi. Nocivo se ingerito.</td></tr><tr><td>Alcool benzilico</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>ATTENZIONE - Nocivo se ingerito. Nocivo se inalato. Provoca grave irritazione agli occhi.</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Polvere bloccante</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab frammenti AP coniugato</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blu tetrazolio cloruro in dimetilformammide&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>ATTENZIONE - Può causare danni al nascituro. Nocivo per inalazione e a contatto con la pelle. Irritante per gli occhi.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>ATTENZIONE - Potenzialmente dannoso se ingerito. Non entrare in contatto con la pelle, negli occhi o sugli indumenti. Potenziale irritante per la pelle e gli occhi.</td></tr><tr><td>N-acetil cisteina</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>ATTENZIONE - Può causare irritazione agli occhi e alla pelle. Può causare irritazione delle vie respiratorie e dell'apparato digerente. Le proprietà tossicologiche di questo materiale non sono state completamente studiate.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>ATTENZIONE - Può essere dannoso se inalato. Può causare irritazione delle vie respiratorie. Può essere dannoso se assorbito attraverso la pelle. Può causare irritazioni cutanee. Può causare irritazione agli occhi. Può essere dannoso se ingerito.</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>ATTENZIONE - Nocivo se ingerito. Tossico a contatto con la pelle. Provoca irritazione della pelle. Provoca gravi danni agli occhi. Può causare irritazione delle vie respiratorie.</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>di-sodio idrogeno fosfato diidrato (Na2HPO4&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>Diidrogeno fosfato di potassio (KH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Tri sodio citrato diidrato (C6H5Na3O7&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>ATTENZIONE - Può causare irritazione agli occhi, alla pelle e alle vie respiratorie. Le proprietà tossicologiche di questo materiale non sono state completamente studiate.</td></tr><tr><td>Olio minerale&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-Vsi&nbsp;</td><td>Intavis</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

a monte intero<em&gt; in situ</em&gt; metodo ibridazione per la molluschi gasteropodi<em&gt; stagnalis lymnaea</em

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Montare tutto ibridazione in situ (WMISH) è una tecnica che consente la risoluzione spaziale di molecole di acido nucleico (spesso mRNA) all&#39;interno di una preparazione dei tessuti &#39;intero monte&#39;, o stadio di sviluppo (ad esempio, un embrione o larva) di interesse. WMISH è estremamente potente, perché può contribuire in modo significativo alla caratterizzazione funzionale di genomi complessi metazoi, una sfida che sta diventando sempre più di un collo di bottiglia con il diluvio di dati di sequenza di prossima generazione. Nonostante la semplicità concettuale della tecnica molto tempo è spesso necessaria per ottimizzare i vari parametri inerenti esperimenti WMISH per sistemi modello nuovi; sottili differenze nelle proprietà cellulari e biochimiche tra tipi di tessuto e le fasi di sviluppo significa che un singolo metodo WMISH potrebbe non essere adatto per tutte le situazioni. Abbiamo sviluppato una serie di metodi WMISH per il modello gasteropode Lymnaea stagnalis riemergenti che generano coerente esegnali WMISH chiari per una serie di geni, e in tutte le fasi di sviluppo. Questi metodi includono l&#39;assegnazione di larve di sconosciuto età cronologica a una finestra ontogenetica, la rimozione efficiente di embrioni e larve dalle loro capsule uovo, l&#39;applicazione di un idoneo trattamento con proteinasi-K per ogni finestra ontogenetica e ibridazione, post-ibridazione e immunolocalizzazione gradini. Questi metodi forniscono una base da cui il segnale risultante per un dato trascrizione di RNA può essere ulteriormente raffinato con aggiustamenti specifici sonda (principalmente sondare concentrazione e temperatura di ibridazione).

I pattern di colorazione WMISH rappresentante mostrato in Figura 3 sono stati generati utilizzando la tecnica sopra descritta, e riflettono una varietà di modelli di espressione spaziale per geni coinvolti in una serie di processi molecolari che vanno dalla formazione del guscio (gene Novel 1, 2, 3 e 4), alla segnalazione cellula-cellula (DPP) del regolamento di trascrizione (Brachyury) in una serie di fasi di sviluppo. Anche se non ab...

L'obiettivo di questo protocollo è fornire agli utenti una serie di metodi per la decapsulazione ad alto rendimento di embrioni e larve di Lymnaea stagnalis in preparazione per l'ibridazione in situ dell'intera montatura e per i successivi trattamenti pre e post-ibridazione.

A monte intero<em&gt; In Situ</em&gt; Metodo ibridazione per la molluschi gasteropodi<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è visualizzare in modo efficiente i modelli di espressione spaziale di geni singoli in preparati interi di embrioni e larve del gasteropode d'acqua dolce Lymnaea stagnalis. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'Evo-Devo e della biologia dello sviluppo, come ad esempio dove e quando i geni vengono espressi, come interagiscono tra loro e quali possano essere le loro funzioni predeterminate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la rimozione del materiale embrionale e larvale dalle loro capsule uovo è rapida, semplice ed efficace.Questo materiale viene quindi categorizzato secondo una mappa dello sviluppo che forniamo nel materiale supplementare, per poi essere sottoposto a passaggi pre-ibridazione specifici per ogni stadio. Per iniziare questa procedura, collegare una siringa monouso da 20 millilitri a un tubo di silicone. Successivamente, fissare con del nastro adesivo un normale vetrino da microscopio a una grande piastra di Petri capovolta.Quindi, fissare con del nastro il tubo di silicone immediatamente accanto al vetrino del microscopio. Successivamente, posizionare un ago di vetro affilato sul vetrino del microscopio. Inserire delicatamente l'ago nel tubo di silicone fino a quando la punta dell'ago sporge di circa il 20% del diametro interno del tubo.Una volta posizionato l'ago, fissatelo con del nastro alla piastra di Petri. Lasciate che l'estremità libera del tubo in silicone poggiate su un'altra piastra di Petri che raccoglierà il materiale decapsulato. Per raccogliere i ceppi di uova dalle pareti di un acquario, utilizzate un pezzo di plastica piatta e flessibile come spatola per raschiare il ceppo di uova dal substrato.Utilizzare un colino di plastica per recuperare la provetta galleggiante dall'acqua. Successivamente, allestire e ordinare il materiale al microscopio seguendo questa guida. Posizionare la provetta su un tovagliolo di carta ed eseguire un'incisione longitudinale lungo la massa dell'uovo utilizzando pinzette leggere.Quindi, far rotolare le capsule uovo fuori dallo strain uovo e rimuovere il più possibile il materiale gelatinoso da ciascuna capsula spingendolo intorno al fazzoletto di carta. Successivamente, utilizzando pinzette leggere, trasferire le capsule uovo in una piastra di Petri contenente 5 millilitri di acqua del rubinetto. Continuare a raccogliere nel piatto le capsule uovo desgelificate negli stadi di sviluppo desiderati.Raccogliere un numero sufficiente di capsule provenienti da tutti gli stadi di sviluppo per l'esperimento di WMISH pianificato prima di passare al passaggio successivo. A questo punto, rilassare le larve di età superiore a cinque giorni dal primo scissione in una soluzione al 2% peso su volume di cloruro di magnesio esaidrato per 30 minuti prima della fissazione. Dopo 30 minuti, valutare il grado di rilassamento immergendo diverse larve ancora all'interno delle loro capsule uovo insieme alla soluzione fissativa e monitorandone la risposta al microscopio.I larve non completamente rilassate si ritrarranno nei loro gusci. Le larve completamente rilassate, invece, non risponderanno. Una volta che queste larve sono state rilassate, trasferire le capsule uovo utilizzando una pipetta di plastica a largo foro in un tubo ermetico che offra un volume pari a 10 volte quello delle capsule uovo.Successivamente, aspirare il più possibile il liquido dal tubo e sostituirlo con la soluzione fissativa in un volume pari a 10 volte quello delle capsule uovo sedimentate. Ruotare delicatamente le capsule uovo nella soluzione fissativa a temperatura ambiente per il tempo appropriato per ciascuno stadio di sviluppo. Quindi, interrompere la rotazione e lasciare affondare le capsule.Aspirare la soluzione fissativa in un contenitore per rifiuti appropriato. Lavare le capsule uovo sostituendo la soluzione fissativa con PBTw e ruotandole a temperatura ambiente per cinque minuti.Aspirare il PBTw e lavare altre due volte. Successivamente, rimuovere gli embrioni e le larve dalle loro capsule utilizzando l'apparecchio. Aspirare le capsule in una siringa da 20 millilitri.Quindi collegare la siringa al tubo. Espellere le capsule attraverso il tubo e l'ago di vetro nella piastra di raccolta. Successivamente, raccogliere gli embrioni e le larve decapsulati in una provetta da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta micrometrica.In seguito, disidratare e conservare il materiale fissato oppure eseguire i passaggi di trattamento con Proteinasi K, TEA e la post-fissazione. Al termine di questi passaggi, pre-ibridare brevemente il materiale e aggiungere i riboprobe. L'importanza di un trattamento adeguato con Pro K per i risultati finali di un esperimento di ibridazione in situ è fondamentale per Lymnaea stagnalis.Questo si riflette in un'ampia gamma di concentrazioni di Pro K necessarie per diverse fasi di sviluppo, che vanno da 0 a 500 microgrammi per mil. Durante l'ibridazione, rimuovere un singolo tubo dal blocco termico. Ruotarlo rapidamente tra pollice e indice per sospendere le larve senza disturbare la fase oleosa, quindi reinserirlo nel blocco termico.Ripetere questa procedura una volta ogni sei-dodici ore. I modelli di espressione genica mostrati qui sono stati ottenuti utilizzando larve appartenenti a diverse fasi di sviluppo. Tutti i campioni sono stati montati e analizzati in Murray's Clear.Le et&agrave; approssimative sono indicate in alto a destra di ogni immagine. L'orientamento della vista &egrave; indicato in basso a destra, e l'ortologia genica &egrave; indicata in basso a sinistra. Questi risultati illustrano i modelli di espressione di geni coinvolti in una variet&agrave; di processi molecolari, che vanno dalla formazione del guscio alla trascrizione fino alla segnalazione da cellula a cellula.In tutti i casi, è visibile un pattern di colorazione cellulare unico e chiaro, e i risultati sono altamente consistenti tra larve singole all'interno di un esperimento e altamente riproducibili tra esperimenti diversi. Una volta acquisita padronanza, il tempo totale di lavoro manuale richiesto da questa tecnica è inferiore a due giorni. La maggior parte del tempo viene impiegata per raccogliere e preparare il materiale embrionale e larvale per l'ibridazione e per acquisire le immagini dei risultati.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che ogni riboproba richiederà probabilmente aggiustamenti leggeri a parametri importanti come la temperatura di ibridazione, la concentrazione della sonda e la durata dell'ibridazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ci ha permesso di caratterizzare in modo accurato un insieme di geni coinvolti nella formazione del guscio che erano stati identificati in precedenti analisi trascrittomiche e proteomiche.

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RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Cambiamenti della pesca indotti alla pesca di crostacei sfruttati, come l'aragosta pesca americano, potrebbero potenzialmente influenzare le loro dinamiche riproduttive, portando ad una riduzione nel successo di accoppiamento. L'obiettivo di questo studio era di sviluppare un metodo invasivo per accertare il successo dell'accoppiamento delle aragoste femmine che possono essere fisiologicamente o funzionalmente maturo.

Un metodo non invasivo per<em&gt; In situ</em&gt; Determinazione del successo di accoppiamento in americano femminile Aragoste (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Questo protocollo video dimostra un metodo per studiare gli effetti del liquido seminale nei gasteropodi, utilizzando la lumaca ermafrodita d'acqua dolce Lymnaea stagnalis.

Effetto di Male Accessory Gland prodotti in deposizione delle uova in gasteropodi

La diagnosi di infezione da Eimeria nei polli rimane impegnativa. Gli approcci guidati dalla morfologia dei parassiti e dalla patologia dell'ospite sono comunemente inconcludenti, mentre gli approcci molecolari basati sulla PCR si sono dimostrati impegnativi in termini di costi e competenze. Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) come diagnostica molecolare semplice per l'infezione di Eimerian.

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica<em&gt; Eimeria</em&gt; Che infettano Polli

Questo protocollo permette la visualizzazione dell'espressione genica in embrionali Astyanax caverna. Questo approccio è stato sviluppato con l'obiettivo di massimizzare il segnale di espressione genica, riducendo al minimo una colorazione di fondo non specifici.

Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

L'obiettivo di questo protocollo è quello di genottare l'anemone di mare Nematostella vectensis durante la gastrulation senza sacrificare l'embrione.

Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce

La conservazione delle cozze d'acqua dolce dipende dal monitoraggio dei modelli riproduttivi e dei processi delle specie. Questo studio standardizza un protocollo non letale per il campionamento del contenuto branchiale, la caratterizzazione dello sviluppo larvale e la fornitura di un archivio digitale per i dati raccolti. Questo pacchetto di database di protocollo sarà uno strumento importante per i ricercatori di cozze nel recupero delle specie in pericolo.

Standardizzazione di un metodo non letale per caratterizzare lo stato riproduttivo e lo sviluppo larvale delle cozze d'acqua dolce (Bivalvia: Unionida)

L'articolo presenta metodi per la coltura larvale del gasteropode Crepidula fornicata in un sistema su scala di laboratorio di piccolo volume e in un sistema di mesocosmo ambiente-acqua marina che può essere utilizzato sul campo.

Laboratorio e coltura sul campo delle larve della patella pantofola, Crepidula fornicata

Scopri l'ibridazione in situ a monte intero per visualizzare i pattern di espressione genica negli embrioni e nelle larve di Lymnaea stagnalis. Questo metodo facilita la ricerca in biologia dello sviluppo e Evo-Devo.

A monte intero

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