Name: Indagare la funzione di Coronin A nel precoce fame di risposta Discoideum Dictyostelium Per aggregazione Dosaggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Scopri il ruolo di Coronin A nella risposta alla fame precoce di Dictyostelium discoideum mediante saggi di aggregazione. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di sviluppo multicellulare.

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Ringraziamo il Dictyostelium Stock Center per ceppi e reagenti. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica e del Cantone di Basilea.

<ol><li> Osservare la risposta di inedia precoce di Dictyostelium discoideum mediante microscopia time-lapse. <ol><li> Crescere le cellule DH1.10 o cellule Corà -carente in un flacone contenente Erlenmayer HL-5 di media (per 1 L: 5 g proteoso peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g di glucosio, 5 g di estratto di lievito, 0,35 g di Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g KH 2 PO 4, 0,05 g diidrostreptomicina-solfato, pH 6,6) a 22 ° C in un incubatore agitazione con una rotazione di 160 rpm. Mantenere le cellule ad una densità tra 0,01 x 10 6 cellule / ml e 2 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Esaminare l&#39;aggregazione delle cellule, per la raccolta di log-fase di crescita le cellule DH1.10 21 o cellule Cora -carente 10 generata in background DH1.10, coltivate in agitazione cultura con HL-5 di media a 22 ° C. Per fare ciò, adottare le opportune quantità di cellule (di solito tra 10 e 50 ml), centrifugare per 3 minuti a 400 xg e lavare le cellule due volte in BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, pH 6,5). </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, le cellule piastra ad una densità di (5, 10, 20, o 40) x 10 4 cellule / cm 2 in una piastra da 24 pozzetti. Consentire loro di aderire per 1 ora a 22 ° C in BSS. </li><li> Visualizza aggregazione mediante microscopia time-lapse come descritto in precedenza 10, prendendo immagini ogni 135 secondi. utilizzando un imaging cellulare dal vivo istituito dotata di obiettivo 5X e una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica elettrone-moltiplicando automatizzato dal software appropriato (vedi Materiali Tavolo). </li></ol></li><li> cAMP pulsare delle cellule discoideum Dictyostelium durante il digiuno. <ol><li> Esaminare l&#39;effetto degli impulsi di cAMP applicati esternamente sullo sviluppo delle cellule DH1.10 21 o cellule 10 DH1.10 CORA -carente, raccogliendo le cellule. Per fare ciò, adottare le opportune quantità di cellule (di solito tra 10 e 50 ml), centrifugare per 3 minuti a 400 xg e lavare due volte in BSS. </li><li> coucellule NT utilizzando un emocitometro e risospendere le cellule ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml in BSS. Agitare le culture (160 rpm) a 22 ° C per 2 ore prima di applicare impulsi. Aggiungere impulsi cAMP utilizzando una pompa peristaltica temporizzata. Programmare la pompa per erogare un impulso 5 sec ogni 6,5 min di 15 ml di 50 nM cAMP (concentrazione finale) in un periodo di 5 ore. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, le cellule piastra ad una densità di (5, 10, 20, o 40) x 10 4 cellule / cm 2 in una piastra da 24 pozzetti. Lasciare aderire per 1 ora a BSS. </li><li> Visualizza aggregazione dopo 16 ore a 22 ° C mediante microscopia in campo chiaro con obiettivo 5X. </li></ol></li><li> Induzione di Dictyostelium discoideum sviluppo attraverso l&#39;esposizione a mezzo condizionato. <ol><li> Preparare fresco mezzo condizionato come descritto 22. Raccogliere le cellule DH1.10 log-fase 21 o celle 10 DH1.10 Cora -carente, di tremare cultoUres con HL-5 di media a 22 ° C con una pipetta, centrifugare per 3 minuti a 400 xg e lavare le cellule tre volte in PBM (0,02 M di fosfato di potassio, 10 mM CaCl 2, e 1 mm MgCl 2, pH 6.1). </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro, risospendere questi in PBM ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml e agitare per 20 ore a 110 rpm / 22 ° C. </li><li> Raccogliere mezzo condizionato dopo centrifugazione a 400 g per 3 min e chiarire per centrifugazione a 8.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Filtro condizionata mezzo attraverso un filtro da 0,45 micron (vedi Materiali Tavolo) e diluire in triplice PBM. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e la piastra ad una densità di (5, 10, 20, o 40) x 10 4 cellule / cm 2 in una piastra da 24 pozzetti. Consentire loro di aderire per 1 ora a 22 ° C. </li><li> Scambio supernatante delle cellule con il mezzo precedentemente preparato condizionata. </li><li> Visualizza l&#39;aggregazione di unopo 16 ore al microscopio in campo chiaro utilizzando un obiettivo 5X. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+cell+movement+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic cell movement in Dictyostelium.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).</li>
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<li>Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+guard%3A+coronin+proteins+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).</li>
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<li>Suo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1+is+a+neurotrophin+endosomal+effector+that+is+required+for+developmental+competition+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival.</a> Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).</li>
<li>Mueller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+survival+through+coronin-1-mediated+generation+of+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate+and+calcium+mobilization+after+T+cell+receptor+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering.</a> Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).</li>
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<li>Shina, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+unique+roles+of+coronin+proteins+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).</li>
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<li>Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+80+x+10%283%29+Mr+protein+mediates+sensing+of+cell+density+and+the+onset+of+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium.</a> Development. (112), 269-278 (1991).</li>
<li>Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteinous+factor+mediating+intercellular+communication+during+the+transition+of+Dictyostelium+cells+from+growth+to+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+science%22%5BJournal%5D)">A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation.</a> Zoological science. 12, 61-69 (1995).</li>
<li>Mehdy, M. C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+factor+and+cyclic+AMP+jointly+regulate+cell-type-specific+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum.</a> Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).</li>
<li>Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+density-sensing+factor+controls+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A density-sensing factor controls development in Dictyostelium.</a> Genes Dev. 6, 390-400 (1992).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Le proteine ​​Coronin si trovano nella maggior parte dei taxa del clade eucariotica. Dictyostelium discoideum Coronin A, l&#39;omologo di Coronin mammiferi 1, è coinvolto nella risposta di inedia in anticipo, dal momento che Coronin Un deficit di cellule non sono in grado di formare centri di aggregazione durante l&#39;inizio dello sviluppo ciclo 10. Per essere in grado di valutare quantitativamente e con precisione il ritardo di sviluppo tra i ceppi, un set-up microscopio imaging cellulare dal vivo ...

La famiglia Coronin delle proteine ​​è altamente conservata in tutta eucarioti. Queste proteine ​​sono caratterizzati dalla presenza di un triptofano-aspartato amino-terminale (WD) ripetere contenente regione seguita da una regione unica collegata a un dominio coiled-coil carbossi-terminale 13,14 (figura 1). Coronins sono stati implicati in una varietà di funzioni cellulari, tra cui la regolamentazione del citoscheletro e trasduzione del segnale 12. Nei mammiferi, fino a sei brevi molecole Coronin (Coronin 1-6) e un &#39;tandem&#39; Coronin 7, possono essere co-espressi 12,15. Coronin 1 è il membro della famiglia più ampiamente studiato, e ha dimostrato di essere coinvolto in distruzione degli agenti patogeni, la sopravvivenza delle cellule T e la segnalazione neuronale. Come, esattamente, Coronin 1 svolge tali attività rimane poco chiaro. Mentre Coronin 1 è stato mostrato per regolare Ca 2+ e cAMP-dipendente di segnalazione così come F-actina citoscheletro modulazione 16-18, il potenziale co-expression di un massimo di 7 membri della famiglia nei mammiferi ha reso difficile per studiare la funzione molecolare di coronins in questi sistemi, a causa di potenziali esuberi. A differenza di organismi dei mammiferi, il più basso eucariote Dictyostelium discoideum esprime solo due membri della famiglia Coronin (Coronin A, la ortologo di mammiferi Coronin 1 e Coronin B, la ortologo di Coronin mammiferi 7) con funzioni apparentemente non ridondanti 15,19,20. Questo fatto rende Dictyostelium discoideum un modello potente per studiare la funzione di coronins. Per studiare il ruolo di Coronin A in Dictyostelium discoideum, abbiamo indotto il ciclo di sviluppo per fame in piastre di coltura tissutale contenente tampone equilibrata soluzione salina (BSS) utilizzando sia le cellule di tipo selvatico o cellule prive Coronin A 10. Abbiamo scoperto che le cellule prive Coronin A erano in grado di formare aggregati multicellulari su fame. Per una valutazione quantitativa accurata di questa fenotipol&#39;imaging cellulare dal vivo automatizzato descritto in questo protocollo è uno strumento di vitale importanza. Il difetto nella inizio della risposta di inedia nelle prime cellule mancanti Coronin A può essere salvato fornendo impulsi di cAMP, suggerendo che Coronin A agisce a monte della cascata cAMP. L&#39;applicazione esogena di impulsi cAMP per simulare l&#39;apertura di sviluppo è stato utilizzato da diversi laboratori in passato 8,9. Tuttavia, questa procedura è anche noto per essere fortemente dipendente densità cellulari e temporizzazione. Pertanto, il protocollo qui descritto mira a ridurre questi variabilità per garantire un elevato grado di riproducibilità. Nel loro insieme, le tecniche utilizzate in questi studi forniscono strumenti robusti per indagare funzioni delle proteine ​​durante le prime fasi del ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum e hanno il potenziale per identificare a monte così come effettori a valle di Coronin Una funzione.

<table><tbody><tr><td>Terreni HL-5 (per 1 L: 5 g di peptone proteoso, 5 g di peptone tiotone E, 10 g di glucosio, 5 g di estratto di lievito, 0,35 g di Na2HPO4*2H2O, 0,35 g di KH2PO4, 0,05 g di diidrostreptomicina-solfato, pH 6,6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteoso peptone</td><td>BD Bioscience</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Tiotone E peptone</td><td>BD Bioscience</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>AppliChem</td><td>A3666</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4*2H2O</td><td>Fluka</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td></td></tr><tr><td>diidrostreptomicina-solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1954000</td><td></td></tr><tr><td>PBM (0,02 M fosfato di potassio, 10 &mu; M CaCl2 e l mM MgCl2, pH 6.1)</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)</td><td></td><td></td><td>self made</td></tr><tr><td>0.45-&mu; m Filtropure S filtro</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 pozzetti Piastra per coltura tissutale</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1H</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Cellobserver</td><td></td>Software <td>AxioVision personalizzato Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microprocessore IPC... pompa di dosaggio controllata</td><td>ISMATEC</td><td>ISM 931</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 135M microscopio</td><td>Zeiss</td><td>491237-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore di incubazione</td><td>Inforst HT Minitron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

indagare la funzione di coronin a nel precoce fame di risposta<em&gt; discoideum dictyostelium</em&gt; per aggregazione dosaggi

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum un&#39;ameba si trovano nel terreno, si nutrono di batteri. Quando fonti di cibo diventano scarse, secernono fattori di avviare un programma di sviluppo multicellulare, durante il quale le singole cellule chemiotassi verso i centri di aggregazione 1-4. Questo processo dipende dal rilascio di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) 5. cAMP è prodotto in onde attraverso l&#39;azione concertata di ciclasi e fosfodiesterasi, e si lega al G recettori accoppiati alla proteina cAMP 6,7. Un test ampiamente utilizzato per analizzare i meccanismi coinvolti nel ciclo di sviluppo del eucariote Dictyostelium discoideum inferiore si basa sull&#39;osservazione di aggregazione delle cellule in condizioni sommerse 8,9. Questo protocollo descrive l&#39;analisi del ruolo di Coronin A nel ciclo di sviluppo per fame in piastre tessuto-coltura sommersa in soluzione salina bilanciata (BSS) 10. Coronin A è un membro del pr ampiamente conservatafamiglia otein di coronins che sono stati implicati in una vasta gamma di attività 11,12. Dictyostelium cellule prive Coronin A sono in grado di formare aggregati multicellulari, e questo difetto può essere salvato fornendo impulsi di cAMP, suggerendo che Coronin A agisce a monte della cAMP cascata 10. Le tecniche descritte in questi studi forniscono strumenti robusti per indagare funzioni delle proteine ​​durante le fasi iniziali del ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum monte della cascata cAMP. Pertanto, utilizzando questo test aggregazione può consentire l&#39;ulteriore studio della Coronin Una funzione e far progredire la nostra comprensione della biologia Coronin.

Le cellule carenti di Coronin Uno spettacolo un difetto di sviluppo precoce (figura 2). In assenza di Coronin A cellule sono in grado di formare aggregati multicellulari, che è la fase iniziale durante il ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum. Pertanto, Coronin A sembra giocare un ruolo durante la risposta di inedia precoce e / o segnalazione cAMP. Infatti, la mancanza di formazione degli aggregati multicellulare in assenza di Coronin A è accompagnato da...

L'ameba sociale Dictyostelium discoideum subisce una transizione evolutiva in un organismo multicellulare quando muore di fame. La proteina conservata evolutiva coronina A svolge un ruolo cruciale nell'avvio dello sviluppo. Utilizzando i saggi di aggregazione come metodo principale, miriamo a chiarire il ruolo della coronina A nello sviluppo precoce.

Indagare la funzione di Coronin A nel precoce fame di risposta<em&gt; Discoideum Dictyostelium</em&gt; Per aggregazione Dosaggi

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è studiare la risposta precoce alla fame dipendente da Coronin-A in Dictyostelium discoideum. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della Biologia dello Sviluppo, come l'identificazione di vie di segnalazione e fattori coinvolti nello sviluppo precoce di Dictyostelium discoideum. Il principale vantaggio di questa tecnica è che potrebbe fornire uno strumento per lo screening automatizzato e ad alto rendimento di fattori induttori dello sviluppo e di proteine coinvolte nella segnalazione dello sviluppo precoce.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà a causa delle numerose variabili intrinseche del saggio, come le densità cellulari, il tempo di adesione e il tempo di sviluppo. Per iniziare questa procedura, coltivare le cellule DH1.10 o le cellule deficienti di corA in un pallone Erlenmeyer contenente mezzo HL-5, a 22 gradi Celsius, in un incubatore agitato a 160 rpm. Mantenere le cellule a una densità compresa tra 1 × 10⁴ e 2 × 10⁶ cellule per millilitro.Per esaminare l'aggregazione cellulare, raccogliere da 10 a 50 millilitri di cellule DH1.10 in fase logaritmica di crescita o cellule deficienti di corA ottenute nel ceppo DH1.10. Centrifugare le cellule per tre minuti a 400 ×g. Quindi lavare le cellule due volte in BSS.Successivamente, conta le cellule utilizzando un emocitometro. In seguito, semina le cellule in una piastra a 24 pozzetti. Lasciale aderire per un'ora a 22 gradi Celsius in BSS.Quindi, visualizzare l'aggregazione cellulare mediante microscopia a tempo differito ed acquisire immagini ogni 135 secondi. Per esaminare l'effetto dei picchi di AMP ciclico applicati esternamente sullo sviluppo delle cellule DH1.10 o delle cellule DH1.10 deficienti per corA, raccogliere da 10 a 50 millilitri di cellule e centrifugare per tre minuti a 400 ×g. Successivamente, lavarle due volte in BSS.Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, risospendere le cellule a una densità di uno per dieci alla sette cellule per millilitro in BSS. Quindi, agitare le colture a 22 gradi Celsius per due ore a 160 rpm prima di applicare gli impulsi.Successivamente, applicare impulsi di AMP ciclico utilizzando una pompa peristaltica controllata da un timer. Programmare la pompa per erogare un impulso di cinque secondi di AMP ciclico ogni sei minuti e mezzo per un periodo di cinque ore. Un passaggio fondamentale consiste nell'assicurarsi che la punta dell'iniezione di AMP ciclico non sia continuamente immersa nella soluzione, ma venga immersa periodicamente nelle onde generate dall'agitatore.Dopo l'applicazione di AMP ciclico, conta nuovamente le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, semina le cellule in una piastra a 24 pozzetti e lasciale aderire per un'ora in BSS. Dopo 16 ore, osserva l'aggregazione cellulare a 22 gradi Celsius, mediante microscopia in campo chiaro utilizzando un obiettivo 5x.In questa procedura, preparare un mezzo condizionato fresco raccogliendo cellule DH1.10 in fase logaritmica o cellule DH1.10 carenti di corA dalle colture in agitazione con mezzo HL5, a 22 gradi Celsius. Centrifugare le cellule per tre minuti a 400 ×g. Successivamente, lavarle tre volte in PBM.Successivamente, conteggiare le cellule utilizzando un emocitometro, quindi ri-sospendere le cellule nel mezzo PBM a una densità di 1 × 10⁷ cellule per millilitro e agitare per 20 ore a 22 °C a 110 rpm. Successivamente, centrifugare le cellule a 400 × g per tre minuti, quindi raccogliere il mezzo condizionato. In seguito, chiarificare il mezzo mediante centrifugazione a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C.Quindi, filtrare il mezzo condizionato attraverso un filtro da 0,45 micrometri e diluirlo di tre volte nel PBM. Contare le cellule utilizzando un emocitometro, seminare in una piastra a 24 pozzetti e lasciarle aderire per un'ora a 22 gradi Celsius. Successivamente, sostituire il sopranatante delle cellule con il mezzo condizionato precedentemente preparato.Dopo 16 ore, visualizzare l'aggregazione cellulare mediante microscopia in campo chiaro utilizzando un obiettivo 5x. In questo caso, le cellule carenti di Coronin-A mostrano un difetto nello sviluppo precoce e non sono in grado di formare aggregati pluricellulari, che rappresenta il primo passo del ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum. In questa figura, le cellule selvatiche vegetative e quelle deficienti di corA sono state lavate e sottoposte a digiuno per due ore, prima di essere trattate, o meno, con 15 nM o AMP ciclico ogni sei minuti e mezzo per un periodo di cinque ore in sospensione.L'applicazione di impulsi esogeni di AMP ciclico ha ripristinato completamente il fenotipo di tipo selvaggio. In questa figura, cellule di tipo selvaggio e cellule deficienti di corA in crescita esponenziale sono state lavate in PBM, seminate in piastre multipozzetto e incubate in mezzo condizionato ottenuto da cellule di tipo selvaggio o da cellule deficienti di corA in stato di carestia. Le immagini sono state acquisite 16 ore dopo la semina delle cellule.Dictyostelium discoideum privi di corA erano in grado di produrre tutti i fattori necessari per l'induzione dello sviluppo, ma non riuscivano a rispondere ad essi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 ore, compreso il tempo di incubazione, se effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che per ceppi diversi sarà necessario regolare molteplici variabili del saggio, come le densità cellulari, il tempo di adesione e il tempo di sviluppo.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una frazionamento biochimico e successiva analisi proteomica al fine di identificare i fattori coinvolti nella risposta precoce alla privazione di nutrienti in Dictyostelium discoideum. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre lo sviluppo precoce di Dictyostelium discoideum in condizioni di immersione, utilizzando sia terreni condizionati che impulsi di AMP ciclico.

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