Indagare la funzione di Coronin A nel precoce fame di risposta Discoideum Dictyostelium Per aggregazione Dosaggi

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di studiare la risposta precoce alla fame dipendente dalla coronina-A di Dictyostelium discoideum. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della Biologia dello Sviluppo, come l'identificazione delle vie di segnalazione e dei fattori coinvolti nello sviluppo precoce di Dictyostelium discoideum. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha il potenziale per fornire uno strumento per lo screening automatizzato e ad alto rendimento di fattori che inducono lo sviluppo e proteine coinvolte nella segnalazione precoce dello sviluppo.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa di molteplici variabili inerenti al test, come la densità cellulare, il tempo di aderenza e il tempo di sviluppo. Per iniziare questa procedura, far crescere cellule DH1.10 o cellule carenti di corA in un pallone di Erlenmeyer contenente terreno HL-5, a 22 gradi Celsius, in un incubatore agitatore a 160 giri/min. Mantieni le cellule a una densità compresa tra una volta 10 e quattro e due volte 10 tra sei cellule per millilitro.

Per esaminare l'aggregazione cellulare, raccogliere da 10 a 50 millilitri di cellule DH1.10 in fase logaritmica o di cellule carenti di corA generate nel background DH1.10. Centrifugatele per tre minuti a 400 volte g. Poi sono state le cellule due volte in BSS.

Successivamente, contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, piastrate le cellule in una piastra a 24 pozzetti. Lasciarli aderire per un'ora a 22 gradi Celsuis in BSS.

Quindi, visualizza l'aggregazione cellulare con la microscopia time-lapse e scatta immagini ogni 135 secondi. Per esaminare l'effetto degli impulsi AMP ciclici applicati esternamente sullo sviluppo delle cellule DH1.10, o cellule DH1.10 carenti di corA, raccogliere da 10 a 50 millilitri di cellule e centrifugarle per tre minuti a 400 volte g. Dopodiché, lavali due volte in BSS.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, risospendere le cellule ad una densità di una volta 10 per le sette cellule per millilitro in BSS. Quindi, agitare le colture a 22 gradi Celsius per due ore a 160 giri/min prima di applicare gli impulsi.

Quindi, applicare gli impulsi AMP ciclici utilizzando una pompa peristaltica controllata da timer. Programmare la pompa in modo che fornisca un impulso di cinque secondi di AMP ciclico ogni sei minuti e mezzo per un periodo di cinque ore. Un passaggio critico consiste nel garantire che la punta dell'iniezione ciclica di AMP non sia continuamente immersa nella soluzione, ma solo periodicamente immersa nelle onde generate dallo shaker.

Dopo l'applicazione ciclica dell'AMP, contare nuovamente le cellule utilizzando un emocitometro. Quindi, piastrate le cellule in una piastra a 24 pozzetti e lasciatele aderire per un'ora in BSS. Dopo 16 ore, visualizzare l'aggregazione cellulare a 22 gradi Celsius, con la microscopia a campo chiaro utilizzando una soggettiva cinque volte.

In questa procedura, preparare un terreno condizionato fresco, raccogliendo cellule DH1.10 in fase logaritmica o cellule carenti di corA DH1.10 dalle colture di agitazione con terreno HL5, a 22 gradi Celsius. Centrifugare le celle per tre minuti a 400 volte g. Dopodiché, lavateli tre volte in PBM.

Successivamente, contare le cellule utilizzando un emocitometro, quindi, risospenderle in PBM a una densità di una volta 10 per le sette cellule per millilitro e agitarle per 20 ore a 22 gradi Celsius a 110 giri/min. Quindi, centrifugare le celle a 400 volte g per tre minuti, quindi raccogliere il terreno condizionato. Successivamente, chiarificare il mezzo mediante centrifugazione a 8.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsuis.

Quindi, filtrare il mezzo condizionato attraverso un filtro da 0,45 micrometri e diluirlo tre volte in PBM. Contare le cellule con un emocitometro, immergerle in una piastra a 24 pozzetti e lasciarle aderire per un'ora a 22 gradi Celsius. Successivamente, scambiare il surnatante delle cellule con un mezzo condizionato precedentemente preparato.

Dopo 16 ore, visualizzare l'aggregazione cellulare con la microscopia a campo chiaro utilizzando una soggettiva cinque x. Qui, le cellule carenti di Coronina-A mostrano un difetto nello sviluppo precoce e non sono state in grado di formare aggregati multicellulari, che è il passo iniziale durante il ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum. In questa figura, il tipo Wild vegetativo e le cellule carenti di corA sono state lavate e affamate per due ore prima di essere pulsate con, o senza, 15 AMP animali o ciclici, ogni sei minuti e mezzo per cinque ore in sospensione.

L'applicazione di impulsi AMP ciclici esogeni, ha ripristinato completamente il fenotipo Wild type. In questa figura, le cellule Wild type e corA-deficienti in crescita esponenziale, sono state lavate in PBM, seminate in piastre multi pozzetti e incubate in terreno condizionato ottenuto da cellule affamate di tipo Wild o carenti di corA. Le immagini sono state scattate 16 ore dopo la semina delle cellule.

Dictyostelium discoideum, carente di corA, sono stati in grado di produrre tutti i fattori necessari per l'induzione dello sviluppo, ma non sono stati in grado di rispondere ad essi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 ore, compreso il tempo di incubazione, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che per ceppi diversi sarà necessario un aggiustamento di più variabili del saggio, come la densità cellulare, il tempo di aderenza, il tempo di sviluppo.

Seguendo questa procedura, il frazionamento biochimico e la successiva analisi proteomica possono essere eseguiti al fine di identificare i fattori coinvolti nella risposta precoce alla fame di Dictyostelium discoideum. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre lo sviluppo precoce in Dictyostelium discoideum in condizioni sommerse, utilizzando sia mezzi condizionati, sia impulsi AMP ciclici.