La valutazione simultanea di Cardiomyocyte DNA Sintesi e Ploidia: Un metodo per assistere Quantificazione del Cardiomyocyte Rigenerazione e fatturato

L'obiettivo generale di questo protocollo è quantificare il turnover dei cardiomiociti utilizzando la marcatura nucleosidica a lungo termine e la citometria a flusso per quantificare i nuclei neocardiomiociti, tenendo conto della poliploidizzazione dei nuclei. Questo metodo può essere utilizzato per affrontare questioni chiave nel campo della rigenerazione dei cardiomiociti e può essere utilizzato come strumento di screening per quantificare i cambiamenti nella dinamica della generazione dei cardiomiociti. Il vantaggio principale di questo protocollo è che consente una quantificazione sensibile e accurata della generazione di neo cardiomiociti, indipendentemente dalla fonte cellulare e dal controllo della poliploidazione.

24 ore dopo la sesta iniezione di EdU, posizionare l'animale trattato in posizione supina e utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione cutanea dal medio addome al diaframma. Successivamente, tenendo lo sterno lontano dalla cavità corporea, tagliare bilateralmente il diaframma per esporre il cuore. Quindi sollevare leggermente il cuore e tagliare i principali vasi sanguigni del tratto di deflusso per sezionare il cuore dalla cavità toracica.

Subito dopo il raccolto, mettere i cuori in singole provette da centrifuga da 15 mL contenenti 10 mL di PBS raffreddato a quattro gradi Celsius. Quindi trasferire i campioni in singole piastre di Petri da 10 cm e utilizzare un bisturi per tagliare ogni cuore in due pezzi con orientamento sagittale. Quindi, stringi delicatamente i pezzi di cuore con un paio di pinze.

Rimuovere entrambi i pezzi di cuore e metterli in una capsula di Petri contenente 20 ml di PBS fresco. Ripetere ancora una volta con una nuova capsula di Petri e 20 ml di PBS fresco. Metti entrambe le parti dei cuori nella stessa provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e usa un ago da 25 gauge per praticare un piccolo foro nel coperchio di ciascuna provetta per evitare che il coperchio si apra quando il cuore è stato lavorato.

Quindi etichettare ogni provetta e congelare i tessuti cardiaci in un contenitore di azoto liquido. Per ogni cuore da analizzare, incubare 36 ml di BSA e PBS all'uno per cento in una provetta da ultra centrifuga. Eliminare la soluzione dopo 30 minuti.

Quando le provette si sono asciugate all'aria, aggiungere 10 mL di soluzione a gradiente di saccarosio in ciascuna provetta. Dopo aver tritato singolarmente i campioni di cuore congelato con azoto liquido con il bisturi, trasferire i frammenti di tessuto da ciascun cuore in singole provette coniche da 50 ml contenenti 15 ml di tampone di lisi cellulare. Omogeneizzare i campioni per 15 secondi a 25.000 giri/min con un omogeneizzatore a sonda a temperatura ambiente.

Quindi aggiungere altri 15 mL di tampone di lisi a ciascuna provetta e trasferire i campioni uno alla volta a una dose di 40 mL con un pestello a grande distanza. Eseguire 10 colpi con il pestello e filtrare i fanghi cellulari attraverso un filtro da 100 micron seguito da un filtro cellulare da 40 micron in singole provette da centrifuga da 50 ml. Quindi raccogliere i pellet cardiaci nucleari mediante centrifugazione e risospendere le cellule in 25 mL di soluzione a gradiente di saccarosio ciascuna.

Sovrapporre le cellule sopra il gradiente di saccarosio libero dai nuclei nelle provette da ultra centrifuga preparate e centrifugare gli strati utilizzando un rotore per provette oscillanti. Dopo la centrifugazione, risospendere i pellet di nuclei in 1.300 microlitri di tampone per la conservazione dei nuclei e trasferire i nuclei in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL etichettata PCM1. Trasferire 300 microlitri di ciascuna sospensione dalle provette PCM1 in una nuova provetta per microcentrifuga e aggiungere 700 microlitri di tampone di conservazione dei nuclei freschi e l'etichetta di controllo ISO.

Successivamente etichettare i nuclei PCM1 con l'anticorpo anti-PCM1 e i nuclei di controllo ISO con l'anticorpo di controllo rapido dell'isotipo IGG durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo centrifugare i campioni e risospendere i pellet in un mL di tampone di conservazione dei nuclei freschi per una seconda centrifugazione nelle stesse condizioni. Dopo la seconda centrifuga, risospendere i pellet in un mL di tampone di conservazione dei nuclei freschi e incubare i nuclei con un microlitro di un frammento di F(ab'2 coniugato fitzy da un anticorpo IGG antirabbico di capra per un'ora a quattro gradi Celsius al buio.

Per valutare il grado di incorporazione di EdU, centrifugare le sospensioni dei nuclei marcate con il controllo PCM1 e ISO e risospendere i pellet in un mL di PBS all'1% di BSA due volte per due lavaggi consecutivi. Dopo il secondo lavaggio, sostituire il surnatante con 100 microlitri di fissativo EdU e incubare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Al termine della fissazione, lavare i nuclei altre due volte in un mL di PBS BSA, quindi incubare i campioni con 100 microlitri di soluzione di permeablazione a base di saponine a temperatura ambiente.

Dopo 15 minuti, aggiungere 500 microlitri di cocktail di etichettatura EdU appena preparato in ogni provetta per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, centrifugare i campioni tre volte lavando i nuclei in un mL di PBS BSA durante le seconde due centrifugazioni. Infine, etichettare i campioni con 400 microlitri di soluzione colorante del DNA.

L'analisi immunoistologica dei cuori pulsati dimostra la presenza di cardiomiociti che esprimono PCM1 e che hanno incorporato EdU. Tuttavia, i dati ottenuti utilizzando i metodi immunoistologici possono essere interpretati erroneamente poiché altri tipi di cellule che hanno incorporato EdU possono essere erroneamente identificati come cardiomiociti. In uno studio su mdx e topi di controllo, l'analisi della citometria a flusso descritta in questo protocollo consente una rapida quantificazione della generazione nucleare di neo cardiomiociti, escludendo anche le cellule che hanno incorporato EdU per la depoliploidizzazione.

Analogamente ai dati precedentemente pubblicati, in questo esperimento rappresentativo è stato osservato un aumento dei tassi di generazione di nuclei neo cardiomiocitari nei cuori di topo mdx rispetto ai controlli di pari età. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore nell'arco di due giorni. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare sia i controlli negativi EdU che PCM1 in modo che i gate possano essere impostati con precisione durante l'analisi.

Questa tecnica è anche compatibile con una serie di tecniche immunoistologiche aggiuntive a valle che consentono di quantificare l'incorporazione dei nucleociti in un numero di diversi tipi di cellule cardiache. Questa tecnica è stata utilizzata nel campo della ricerca cardiovascolare per studiare i cambiamenti nella rigenerazione dei cardiomiociti nel modello mdx di cardiomiopatia non ischemica. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come quantificare rapidamente i nuclei dei neo cardiomiociti, guardare il conteggio per la poliploidazione per lo screening dei cambiamenti nella rigenerazione e nel turnover dei cardiomiociti.