Foraggiamento protocollo percorso di lunghezza per Drosophila melanogaster Le larve

L'obiettivo generale di questo test è quantificare la componente locomotoria del comportamento larvale di Drosophila. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genetica del comportamento sui contributi genetici e ambientali alle differenze individuali nel comportamento larvale. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è veloce, riproducibile e consente la raccolta di campioni di grandi dimensioni.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo potrebbero avere difficoltà perché il successo del test dipende dai tempi di sviluppo e dalla gestione coerente e attenta degli animali da laboratorio. A dimostrare la procedura saranno Ina Anreiter e Oscar Vasquez, studenti laureati nel mio laboratorio. Prepara la bottiglia di contenimento praticando dei fori su un lato di una bottiglia di plastica da sei once per la coltura delle mosche.

Quindi, utilizzare una siringa per riempire i coperchi delle piastre di Petri con il succo d'uva precedentemente preparato fino a quando la superficie del succo d'uva forma una cupola sopra il bordo del coperchio. Conservare i piatti d'uva in un contenitore umido ed ermetico a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Versare 40 millilitri di cibo per mosche precedentemente preparato in piastre di Petri da 100 x 15 millimetri.

Procuratevi tre lastre di plexiglas nero con dieci pozzetti circolari di dieci centimetri di diametro e disposti a due per cinque per testare le larve, e uno spandiconcime di plexiglas nero utilizzato per spalmare la pasta di lievito sulle lastre di plexiglas. Quindi, separare i coperchi dal fondo delle piastre di Petri. Raccogli da 100 a 150 femmine e da 50 a 75 maschi.

Consenti a femmine e maschi di accoppiarsi durante la notte in una bottiglia di coltura per mosche da sei once con cibo per mosche standard. Trasferisci le mosche in una bottiglia e usa del nastro adesivo per fissare un piatto d'uva con una piccola quantità di pasta di lievito fresco sopra la parte superiore della bottiglia. Lasciare la bottiglia capovolta con il piatto dell'uva sul fondo per consentire agli adulti di deporre le uova sul piatto dell'uva.

Scartare il primo piatto d'uva dopo 24 ore e mettere un nuovo piatto d'uva nella bottiglia di mantenimento. Dopo 22 ore, togliere i piatti dell'uva dalle bottiglie e metterli in una capsula di Petri da 60 x 15 millimetri. Quindi, posiziona un nuovo piatto d'uva con pasta di lievito fresco sulla bottiglia di contenimento.

Eliminare e scartare tutte le larve dal piatto d'uva con semi utilizzando una sonda da dissezione. Incubare i piatti d'uva chiarificati per quattro ore in condizioni standard. Dopo quattro ore, raccogli 100 larve L1, o primo stadio, per ceppo dai piatti dell'uva e posizionale sui piatti del cibo.

Posizionare le larve sul cibo delicatamente, senza perforare il cibo e senza seppellire le larve. Gruppi di dieci larve possono essere raccolti e posizionati alla volta. Evita l'affollamento distribuendo le larve sul piatto del cibo.

Incubare le piastre di cibo fino a quando gli animali di prova non sono dieci ore prima dell'inizio del vagabondaggio, quando le larve lasciano il cibo alla ricerca di un sito di pupa. Se le larve hanno iniziato a vagare e si muovono sul coperchio della capsula di Petri, come potete vedere qui, gli animali sono troppo vecchi per essere testati e il loro tempo di sviluppo deve essere rivalutato. Sciogliere il lievito in acqua in rapporto uno a due.

Assicurarsi che la pasta finita goccioli e lasci nastri sulla superficie della pasta che si sciolgono rapidamente. Valutare la giusta consistenza della pasta di lievito è più importante che utilizzare il rapporto esatto a causa della variabilità tra marche, lotti di lievito e ambiente. Con un pennello, raccogli delicatamente le larve dal piatto del cibo dal primo ceppo.

Raccogli le larve in una capsula di Petri e lavale delicatamente con acqua per rimuovere tutto il cibo. Lavare rapidamente le larve con due millilitri di acqua e tamponare delicatamente le larve con una salvietta da laboratorio. Conservare le larve in un ambiente umido ma non immerse in acqua per evitare stress.

Disporre tre piastre di prova una accanto all'altra e impostare un timer di cinque minuti per ciascuna piastra di prova. Applicare la pasta di lievito sulla parte superiore delle piastre di prova e utilizzare lo spandiconcime per distribuire un sottile strato di pasta di lievito su ciascuna piastra di prova in modo che tutti i pozzetti abbiano uno strato uniforme di lievito. Posiziona delicatamente una larva al centro di ogni pozzo.

Avvia il timer di cinque minuti subito dopo aver posizionato le prime larve su ogni piatto. Quindi posizionare il resto delle larve nei pozzetti rimanenti. Metti un coperchio per piastre di Petri sopra ogni pozzetto.

Quando il tempo scade, inizia a tracciare le lunghezze del percorso lasciate nel lievito usando un pennarello indelebile senza rimuovere le larve dal piatto. Sulle piastre sono state posizionate le lunghezze dei percorsi delle tracce nello stesso ordine e velocità delle larve. Infine, ripeti i passaggi del test della lunghezza del percorso larvale per ogni ceppo.

I dati raccolti in tre giorni consecutivi di test hanno rivelato un significativo effetto di deformazione, con i rover che viaggiano più lontano dei sitter. Oltre all'effetto deformazione, le larve che sono state private del cibo per quattro ore prima del test avevano una lunghezza del percorso significativamente inferiore rispetto alle larve alimentate. Nel complesso, le lunghezze dei percorsi erano più lunghe quando entrambi i ceppi erano allevati con alimenti ad alto contenuto di nutrienti rispetto a quelli a basso contenuto di nutrienti.

Se eseguito correttamente, questo test consente a una singola persona di testare fino a 500 larve con facilità in quattro ore, rendendolo prezioso per la fenotipizzazione su larga scala. Seguendo la procedura che abbiamo appena mostrato, altre variabili come il sesso, la privazione del cibo o la qualità del cibo possono essere testate per mostrare l'effetto di tali variabili sui modelli di movimento legati al cibo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la locomozione larvale correlata al cibo di Drosophila per la valutazione dei contributi genetici e ambientali alle differenze individuali nel comportamento.