Costruzione di modelli per la previsione non distruttivo di principio Contenuti di mirtilli mediante spettroscopia nel vicino infrarosso Sulla base di HPLC Misure

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire e convalidare modelli per la previsione non distruttiva del contenuto totale di zucchero, acido organico totale e anti-cianina totale nei singoli mirtilli mediante spettroscopia nel vicino infrarosso. Questo metodo risponderà a problemi chiave nel campo della valutazione dei prodotti agricoli, come frutta e verdura. Per me, un vantaggio di questa tecnica è che molti dei nostri prodotti possono essere controllati in modo non distruttivo con la spettroscopia.

E i modelli costruiti attraverso la procedura mostrata qui. La spettroscopia nel vicino infrarosso è un potente strumento per la valutazione non distruttiva dei prodotti agricoli. I modelli predittivi sono costruiti esaminando la correlazione tra lo spettro e i contenuti determinati dall'analisi chimica di ciascun bersaglio.

A dimostrare la procedura saranno Yusuke Kimura, uno studente laureato del mio laboratorio e Jingai Che, dell'università e uno degli autori di questo protocollo. Raccogli un numero sufficiente e vari tipi di mirtilli campione dalle cultivar target. Raccogli preferibilmente 100 mirtilli per la costruzione del modello di calibrazione.

E almeno 10 per la validazione del modello costruito. Per costruire modelli robusti, raccogli campioni di vari tipi, ad esempio con vari colori, dimensioni e varie condizioni di maturazione. Pesa ogni mirtillo.

I pesi misurati vengono utilizzati successivamente per il calcolo del contenuto percentuale degli ingredienti di ogni mirtillo. Successivamente, metti un campione di mirtillo al centro della finestra dello spettrofotomoter nel vicino infrarosso per le misure di riflettanza diffusa. Utilizzando il comando sample single channel, misurare gli spettri di ciascun mirtillo.

Preferibilmente in più punti del frutto. Conservare i mirtilli in congelatore, al di sotto dei meno 30 gradi Celsius se non devono essere analizzati subito dopo le misurazioni dello spettro. Per iniziare il pretrattamento, taglia un mirtillo in più pezzi in modo che possa essere facilmente omogeneizzato.

Tagliare il mirtillo senza scongelarlo quando è congelato. Mettere i pezzi in un becher da 50 millilitri. Aggiungere circa 10 millilitri di acqua ultra pura al becher.

Scaldare il mirtillo tagliato in acqua ultra pura in un forno a microonde per 20 secondi per disattivare gli enzimi che potrebbero decomporre gli zuccheri durante le analisi. Aggiungere circa 10 millilitri di acqua ultra pura al becher. Omogeneizzare la miscela per cinque minuti a 12.000 giri/min con un omogeneizzatore dotato di albero e generatore standard.

Centrifugare la miscela omogeneizzata per 10 minuti a 3.000 giri/min. Successivamente raccogliere il filtrato mediante filtrazione sottovuoto del campione centrifugato utilizzando un filtro di carta a cinque B. Dopo aver ripetuto due volte le fasi di omogeneizzazione, misurare il pH del filtrato e regolarlo a sette con acido cloridrico diluito e soluzioni acquose diluite di idrossido di sodio.

Diluire il filtrato a 50 millilitri con acqua ultra pura. Dividere il campione in due. Uno per l'analisi degli zuccheri e l'altro per l'analisi degli acidi organici.

Far passare la prima soluzione campione attraverso le colonne collegate in serie per escludere pigmenti, cationi e anioni. Gettare via il primo millilitro della soluzione campione dalle colonne. Quindi utilizzare la soluzione campione dalle colonne per l'analisi degli zuccheri mediante cromatografia liquida ad alta prestazione o HPLC.

Centrifugare la soluzione a 6.600 giri/min per 10 minuti in una microprovetta dotata di un filtro da 0,445 micron con una mini-centrifuga prima dell'analisi mediante HPLC. Disporre il sistema HPLC utilizzando una colonna di permeazione del gel nel forno a colonna a 40 gradi Celsius. Utilizzare acqua ultra pura degassata con una portata di 0,1 millilitri al minuto come eluente.

Utilizzare anche un rilevatore di indice di rifrazione. Misurare gli spettrogrammi HPLC di soluzioni standard iniettando un'aliquota da 20 microlitri per ogni misurazione. Per la misurazione viene utilizzato il software della soluzione confezionata.

Ottieni l'intensità dell'area della banda di zucchero sul cromatogramma di ciascuna soluzione standard facendo clic su rianalisi con il tasto destro del mouse. Quindi collegare le intensità dell'area alle concentrazioni corrispondenti per ottenere la curva di lavoro per ogni zucchero mediante regressione lineare. Dalla curva si ottiene l'equazione che rappresenta la relazione tra l'intensità dell'area e la concentrazione per ogni zucchero.

Dopo aver ottenuto la curva standard, misurare gli spettrogrammi HPLC delle soluzioni campione iniettando un'aliquota da 20 microlitri per ogni misurazione. Ottenere le intensità dell'area delle bande di zuccheri sul cromatogramma di ciascuna soluzione campione come prima. Fare riferimento al protocollo di testo per la procedura di esecuzione delle misure HPLC degli acidi organici.

Conserva i mirtilli in un congelatore a una temperatura inferiore a meno 80 gradi Celsius se non devono essere analizzati per gli antociani subito dopo le misurazioni dello spettro. Per eseguire il pretrattamento per le misurazioni HPLC degli antociani, essiccare ogni frutto congelato con un liofalizzatore sottovuoto per 12 ore. Estrarre l'antocianina dal mirtillo essiccato in una soluzione di metanolo all'uno per cento di acido trifluruocetico lasciando la miscela in frigorifero a quattro gradi Celsius per 12 ore.

Centrifugare l'estratto per 15 minuti in una microprovetta da due millilitri utilizzando un'ultracentrifuga a meno otto gradi Celsius e 15.000 giri/min. Quindi filtrare l'estratto attraverso un filtro da 0,45 micron per ottenere il campione per le misure HPLC. Disporre il sistema HPLC utilizzando una colonna di fase inversa C18 in un forno a colonna a 40 gradi Celsius.

Applicare il metodo del gradiente utilizzando un acido trifluroacetico acquoso allo 0,1% come LUNA. E lo 0,5% di acido trifluroacetico in acetonitrile come LUNB. Utilizzare una portata di 0,1 millilitri al minuto in cui il rapporto di LUNB aumenta dall'8% al 15% durante lo zero a 50 minuti dopo l'iniezione.

E dal 15% al 75% durante 50-60 minuti dopo l'iniezione. Utilizzare un rilevatore a matrice di fotodiodi che monitora a 520 nanometri. Misurare gli spettrogrammi HPLC di soluzioni standard iniettando un'aliquota da 10 microlitri attraverso l'autocampionatore per ogni misurazione.

Utilizzare il software della soluzione LC per la misurazione. Infine, misurare gli spettrogrammi HPLC delle soluzioni campione iniettando un'aliquota da 10 microlitri attraverso l'autocampionatore per ogni misurazione. A questo punto, la costruzione di modelli di calibrazione per la previsione del contenuto degli ingredienti, seguita dalla validazione di questi modelli costruiti, viene eseguita come descritto nel protocollo di testo.

I modelli di previsione sono costruiti utilizzando gli spettri osservati e il contenuto degli ingredienti determinato attraverso la procedura mostrata qui. Di seguito è riportato un esempio del risultato della convalida incrociata del modello costruito per la previsione del contenuto totale di zucchero. La correlazione tra i valori previsti dalla spettroscopia nel vicino infrarosso e quelli determinati dall'HPLC è soddisfacente.

Un risultato simile si osserva per la validazione incrociata del modello per il contenuto totale di antociani. Anche in questo caso la correlazione tra i valori previsti e quelli osservati è soddisfacente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere i valori precedenti del contenuto dei mirtilli con HPLC.

Una valutazione diversa è possibile solo utilizzando i modelli costruiti correttamente sulla base del contenuto preimpostato misurato dall'analisi chimica distruttiva. Ciò significa che l'analisi chimica precedente di un bersaglio è un mistero per la costruzione di modelli di previsione ad alte prestazioni. Si prega di fare riferimento al protocollo di testo per la procedura di costruzione di modelli predittivi che non sono mostrati in questo video.

Una volta costruiti correttamente, i modelli per la previsione sono applicabili per la previsione di zucchero, acidi organici e qualsiasi contenuto di mirtilli. La spettroscopia nel vicino infrarosso, come mostrato qui, dovrebbe essere applicabile per la correlazione di molti tipi di prodotti agricoli. Non dimenticare che è necessario ottenere barriere di contenuto preimpostate attraverso l'analisi chimica per la costruzione di un buon modello quando si applica la spettroscopia nel vicino infrarosso alla valutazione di qualsiasi prodotto agricolo.