Name: Intra-iliaca iniezione per un efficiente e selettivo Modellazione di microscopico metastasi ossee (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Scopri l'iniezione intra-iliaca per modellare metastasi ossee microscopiche in modelli murini. Questa tecnica consente di studiare l'interazione tra cellule tumorali e microambiente osseo con elevata efficienza e selettività.

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La ricerca nel laboratorio di Zhang è stata supportata da X. H.-F. CA151293 NCI, CA183878, Breast Cancer Research Foundation, Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti DAMD W81XWH-13-1-0195, un Pilot Award di CA149196-04, McNair Medical Institute e dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti di H.W. DAMD W81XWH-13-1-0296.

Tutto il lavoro animale è stato fatto in accordo con le linee guida per la cura degli animali del Baylor College of Medicine. 1. Preparazione delle cellule Nota: differenti linee cellulari possono essere utilizzati per l&#39;iniezione IIA seconda scopi di ricerca. Abbiamo utilizzato linee di cellule di cancro al seno MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 e la linea di cellule di cancro alla prostata C4-2 nella nostra ricerca. Usiamo tipicamente sia GFP e lucciola luciferasi cellule tumorali marcato per il nostro studio e alcuni dati qui dalla linea cellulare MCF7 GFP-luciferasi marcato. <ol><li> Mantenere cellule in DMEM contenente 10% FBS e 0,1 mg / ml di penicillina-streptomicina a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Prima dell&#39;iniezione IIA, trypsinize le cellule a 80 - 90% confluenza con il 0,25% soluzione / EDTA tripsina. Utilizzare PBS freddo per lavare le cellule due volte, e risospendere le cellule in 10 ml di PBS per il conteggio delle cellule. Per rimuovere PBS, le cellule centrifugare a 800 xg per 5 min. </li><li> cellule Risospenderead una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml in PBS ghiacciato. </li><li> Utilizzare 100 ml GFP e cellule tumorali luciferasi marcato Firefly per IIA iniezione di un mouse. Nota:. Pertanto, il numero di celle ricevute da ciascun animale è 5 x 10 5 Questo numero può essere necessario modificare in base alla aggressività delle linee cellulari. </li><li> Mantenere sospensioni cellulari sul ghiaccio. Nota: Le vibrazioni possono essere necessari per prevenire l&#39;aggregazione delle cellule ogni pochi minuti fino a quando è pronto per l&#39;iniezione. Per alcune linee cellulari (come MDA-MB-231), possono essere necessarie procedure più rigorose (ad esempio, di passaggio 45 micron colino cellula) per prevenire l&#39;aggregazione. Si prega di notare che lo zoccolo dei vasi può provocare necrosi del tessuto, e quindi confondendo gli esperimenti. </li></ol> 2. Preparazione degli animali <ol><li> Per la gestione del dolore degli animali, dare 5 mg / kg / die carprofen (o altro analgesico) con integratore alimentare per i topi non meno di 24 ore prima dell&#39;intervento chirurgico. Amministrareuna dose di 0,1 mg / ml di buprenorfina per via sottocutanea 60 min prima dell&#39;intervento. Nota: una procedura opzionale è quello di impiantare estradiolo pallet nella parte posteriore degli animali per fornire estradiolo supplementare. Questo accelererà il crescere delle cellule ER + tumorali (ad esempio, cellule MCF-7) 9. </li><li> Anestetizzare 4 - 6 settimane di età mouse (circa 20 g) con ketamina (80 - 100 mg / kg) e xilazina (10 -12.5 mg / ml) mediante iniezione intraperitoneale. </li><li> Confermare il livello appropriato di sedazione di un 20 g mouse pizzico punta e l&#39;osservazione di una riduzione del 50% della frequenza respiratoria e rosa mucose (ad esempio, la pelle dell&#39;orecchio del mouse e la pelle della zampa). Continuare a monitorare questi segni vitali ogni 15 min durante l&#39;intervento chirurgico. Nota: Nessun movimento dell&#39;animale indica che l&#39;animale è sufficientemente anestetizzati e pronto per la chirurgia. </li><li> Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza. </li><li> Shave il mouse sul basso addome, in particolare la zona inguinale destra dove l&#39;intervento chirurgico e l&#39;iniezione saràprendere posto. Nota: Questo non è necessario se si utilizzano topi nudi atimici. </li><li> Mettere il mouse sul dorso, diffondere le gambe in posizione naturale e bastone le dita dei piedi per cellulare dissezione cartone con nastro adesivo. </li><li> Pulire la zona inguinale destra con il 70% tamponi di cotone sterili etanolo isopropilico imbevuti, seguito con betadine scrub chirurgico più volte. </li></ol> 3. La Vena iliaca comune e Arteria posizione e Separazione <ol><li> Effettuare una incisione cutanea di 1,0 - 1,2 cm di lunghezza tra il 4 ° e 5 ° capezzoli nell&#39;addome basso a destra con sterili, # 10 di carbonio lame di bisturi in acciaio detenute in un manico n ° 3. Quindi utilizzare un telo chirurgico sterile per coprire il corpo animale ad eccezione del sito di incisione. </li><li> Spostare l&#39;animale al banco di livello superiore dissezione microscopio. Utilizzare un ingrandimento di 4X per l&#39;iniezione. </li><li> Sotto 4X ingrandimento del microscopio dissezione, inserire una pinza separazione smussato tra il tessuto adiposo e il peritoneum, e spingere i tessuti verso l&#39;esterno su entrambi i lati per esporre i vasi iliaci e nervi (vedi Figura 1). Nota: L&#39;arteria tra aorta dalla linea mediana e la parte inferiore dei rami dell&#39;arteria è chiamata iliaca comune. È qui che l&#39;iniezione avviene. </li><li> Utilizzare un paio di pinze sottili dritti a sfondare il tessuto connettivo (come una membrana) tra le navi e il nervo, più vicino ai vasi. </li><li> Accendere i pinza sottile rette per la mano sinistra. Afferra un paio di pinze sottili ad angolo con la mano destra. Inserire le pinze mano destra nella stessa posizione in cui sono stati suddivisi i tessuti connettivi. E poi attaccare le pinze mano destra attraverso, sotto i vasi. </li><li> Allo stesso tempo, inserire le pinze mano sinistra nei tessuti connettivi sul lato sinistro delle navi per guidare le pinze mano destra che passano attraverso. </li><li> Una volta che la pinza mano destra ottiene sotto i vasi, cercare di separare le navi dal ti circondaSSUE un po &#39;di più, e poi tenerli in cima alle pinze mano destra. </li><li> Utilizzare pinze mano sinistra per consegnare la punta di una sutura 4-0 di seta per le pinze mano destra, e poi tirare delicatamente e lentamente la sutura attraverso sotto i vasi. Nota: Ora entrambe vasi vena e arteria comuni sono sollevati dalla sutura (vedi Figura 2). </li></ol> 4. iniezione e post-iniezione di cura <ol><li> Preparare le cellule per l&#39;iniezione in una siringa da insulina 31 G. Utilizzare 100 ml di sospensione cellulare in PBS per iniezione. Assicurati di pipetta su e giù più volte per separare le cellule ed evitare l&#39;aggregazione in modo che le cellule iniettate non intasare e bloccare il flusso di sangue. </li><li> Con la pinza angolata nella mano sinistra, mettere le pinze sotto i vasi lungo la guida della sutura, e quindi aprire i due bracci della pinza, avendo i vasi detenuti delicatamente sulle pinze. Nota: L&#39;intervallo tra i due bracci della pinza sarà l&#39;isito njection. </li><li> Tenere il 31 ago G con 100 microlitri sospensioni cellulari nella mano destra, con la smussatura dell&#39;ago verso l&#39;alto, pronto per l&#39;iniezione. </li><li> Inserire l&#39;ago nel lume dell&#39;arteria (sangue entrerà la punta dell&#39;ago). Poi spingere sospensione cellulare lentamente per iniettare le cellule. La sospensione cellulare spingerà il sangue rosso nel vaso. Cercate di non rompere i vasi o perdite sospensione cellulare fuori. </li><li> Quando l&#39;iniezione è terminata, tirare delicatamente indietro l&#39;ago e tenere premuto il navi fino alle pinze mano sinistra per fermare l&#39;emorragia. Poi tirare via la sutura. </li><li> Sganciare la pinza della mano sinistra, e utilizzare rapidamente un batuffolo di cotone di premere l&#39;area di incisione dell&#39;arteria per fermare l&#39;emorragia. Nota: Di solito 5 - 10 min pressione continua è sufficiente per fermare l&#39;emorragia. </li><li> Quando il sanguinamento si ferma, usare la colla pelle per chiudere i bordi pelle della zona intervento chirurgico. Fare un marchio auricolare, e verificare la presenza di bioluminescenza segnalazione per esaminare la distribuzione delle cellule iniettate. &lt;br /&gt; Nota: Una iniezione di successo si tradurrà in un&#39;immagine simile alla figura 3. <ol><li> Controllare segnalazione bioluminescenza mediante iniezione di 100 microlitri 15 mg / ml luciferina in PBS a 75 mg / kg concentrazione mouse mediante il seno intra-orbitale. <ol><li> Per l&#39;iniezione intra-orbitale, mettere le dita su entrambi i lati degli occhi del mouse, usare la pressione per fare bulbo oculare leggermente pop fuori dal telaio occhio, inserire 28 g di aghi di insulina siringa tra palla occhio e il naso, e quindi spingere lentamente la siringa per iniettare luciferina . Nota: Nella posizione corretta, l&#39;ago deve essere in grado di raggiungere una profondità di 2 - 3 mm prima di colpire tessuti duri (osso). </li><li> Posizionare il mouse nel sistema di imaging per l&#39;imaging in vivo animale intero per 10-60 secondi a 5 minuti (vedi figura 3). Nota: Una procedura opzionale è quello di impiantare estradiolo pellet nella parte posteriore degli animali per fornire estradiolo supplementare. Questo accelererà la crescita delle cellule tumorali ER + (per esempio, MCF-7celle) 15. </li></ol></li></ol></li><li> Lasciare il mouse su una piastra elettrica caldo fino a quando non si sveglia. Monitorare il sanguinamento, gonfiore, segni di deiscenza e dolore durante il periodo post-chirurgica. Mettere i topi torna alla gabbia con una copertura analgesica (carprofin supplemento dietetico suggerito) data per la gestione del dolore fino a quando non segni di dolore. Fate molta attenzione e cura per gli animali durante 7 giorni dopo l&#39;intervento. </li></ol> 5. Monitoraggio metastatico crescita <ol><li> Istomorfometria: <ol><li> Harvest tumore cuscinetto tessuti ossei, fissare le ossa in paraformaldeide al 4% per 24 ore, poi li Decalcificare a pH 7.0 soluzione EDTA 14% per 3 - 5 giorni, e sottoporli a paraffina embedding come descritto in precedenza 14. </li><li> Sezione tessuti ossei paraffina incorporare al spessore di 3 micron ed eseguire il metodo istologico standard ematossilina / eosina come descritto in precedenza 14. </li></ol></li><li> Immunohistochemisprovare: <ol><li> Soggetto paraffina osso cuscinetto tumore scivola di immunoistochimica colorazione per vari scopi, come descritto in precedenza 14. In breve, immunostain MCF7 cellule tumorali da anticorpi anti-GFP e cellule osteogeniche immunostain (pre-osteoblasti e osteoblasti) da anticorpi anti-Osterix e anticorpi anti-fosfatasi alcalina (ALP), rispettivamente. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Anche se solo l&#39;arteria iliaca è il bersaglio di iniezione per le cellule tumorali, si consiglia la separazione sia della vena iliaca e l&#39;arteria dai tessuti circostanti, e di sollevare loro insieme come un fascio. Questo perché la vena e arteria ampiamente contatto tra loro, e la parete del vaso venoso è sottile ed è facile da rompere. Pertanto, per una iniezione di successo, fa risparmiare tempo e fatica a reggere le due navi insieme, anche se le cellule tumorali vengono iniettate solo per l&#39;arteria. Una s...

Le metastasi rappresentano oltre il 90% dei decessi causati da tumori solidi. Bone è l&#39;organo più comuni colpite da metastasi di vari tipi di cancro, in particolare della mammella e della prostata. Al momento della diagnosi in clinica, metastasi ossee di solito sono già entrati fase avanzata sia con osteolitiche o osteoblastiche alterazioni nel tessuto osseo, spesso accompagnati da sintomi neurologici. Studi precedenti prevalentemente concentrati sulle evidenti metastasi osteolitiche 1-3, ma attualmente abbiamo limitato la comprensione di micrometastasi nel ossa prima dell&#39;inizio del processo osteolitica. Questo è almeno in parte a causa della mancanza di appropriati modelli sperimentali e approcci. Modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno spesso metastatizzano ai polmoni, ma molto meno efficiente alle ossa 4. Allo stesso modo, i tumori ortotopicamente trapiantati raramente sviluppano metastasi ossee spontanee, con un po &#39;4T1 carcinom mammaria osso-tropicaleun sub-cloni e MSP overexpressed PyMT modello di topo transgenico come eccezioni 5-7. Intra-tibiale di perforazione in grado di fornire le cellule tumorali fino all&#39;osso 8-10, ma incorre anche danni e infiammazioni ai tessuti locali. Attualmente iniezione intra-cardiaca di linee di cellule di cancro al seno è stato l&#39;approccio importante per indagare la colonizzazione ossea 11-13. Tuttavia, dopo che le cellule tumorali sono introdotti nel ventricolo sinistro solo una parte limitata giungere infine a ossa e midollo osseo, rendendo difficile tenere traccia metastasi microscopiche in modo quantificabile. In questo studio, si stabilisce una tecnica, vale a dire l&#39;arteria intra-iliaca (IIA) di iniezione 14, per fornire selettivamente le cellule tumorali nei tessuti degli arti posteriori, arricchendo in tal modo le cellule tumorali nel midollo e nel midollo osseo senza causare danni ai tessuti locali. A causa della specificità dell&#39;osso, questo approccio consente anche abbastanza tempo per le cellule tumorali indolenti a colonizzare eventualmente prima della unimals soccombono ai tumori primari o metastasi in altri organi vitali. In combinazione con una varietà di altre tecniche, come l&#39;imaging bioluminescenza, immunofluorescenza e Istomorfometria ossa, iniezione IIA è potenzialmente utile per una vasta gamma di scopi di ricerca relativi alla metastasi ossee, soprattutto per tenere traccia la progressione da cellule tumorali singole a più celle micrometastasi. In particolare, abbiamo dimostrato che l&#39;iniezione IIA ci permette di visualizzare le interazioni tra cellule tumorali e vari tipi di cellule che circonda nel microambiente osseo.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep Anfatericina B</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>17-745E</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina/EDTA</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>45 &mu; Filtro cellulare</td><td>M VWR International Laboratory</td><td>195-2545</td><td></td></tr><tr><td>MediGel CPF con carprofene&nbsp;</td><td>Articolo controllato dalle cure veterinarie in BCM</td><td></td><td>Per la gestione del dolore</td></tr><tr><td>Buprenorfina&nbsp;</td><td>Articolo controllato da cure veterinarie in BCM</td><td></td><td>Per la gestione del dolore</td></tr><tr><td>Pellet di estradiolo</td><td>Ricerca innovativa dell'America</td><td>SE-121</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina e xilazina</td><td>Articolo controllato da cure veterinarie in BCM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unguento veterinario</td><td>Articolo controllato da cure veterinarie in BCM</td><td></td><td>Evitare la secchezza oculare</td></tr><tr><td>Rasoio</td><td>Oster</td><td>78005-050</td><td>Per topi pelosi</td></tr><tr><td>Etanolo isopropilico</td><td>ACROS</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Scrub chirurgico Betadine</td><td>Prodotto controllato da cure veterinarie in</td> lame di bisturi BCM<td></td><td></td></tr><tr><td>#10</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>549-3CS-10</td><td>Manico multiplo</td></tr><tr><td>n. 3 Ted</td><td>Pella, Inc</td><td>541-31</td><td>Bisogno di essere sterilizzato in autoclave</td></tr><tr><td>Telo chirurgico sterile</td><td>Tecnologia</td> <td>di infusione SaiPSS-SD1</td><td></td></tr><tr><td>Pinza dritta&nbsp;</td><td>Strumento chirurgico Roboz</td><td>RS-5132</td><td>Necessità di autoclavaggio</td></tr><tr><td>Pinze fini diritte</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>fine 11253-20</td><td>Necessità di autoclavazione</td></tr><tr><td>Pinze fini bordate</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11253-25</td><td>Necessità di autoclave</td></tr><tr><td>4-0 Sutura in seta Vicryl</td><td>Johnson & Siringhe per insulina Johnson Health Care</td><td>J214H</td><td></td></tr><tr><td>31 G</td><td>BD</td><td>328418</td><td></td></tr><tr><td>Cotton fioc multipli con cotton fioc (sterili)</td><td>VWR International Laboratory</td><td>89031-272</td><td></td></tr><tr><td>Colla per la pelle</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>31477</td><td>Per la chiusura della pelle del sito chirurgico</td></tr><tr><td>Applicatore di marchi auricolari</td> Strumenti per la <td>scienza fine</td><td>24220-00</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>24220-50</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK</td><td>Evitare la luce e mettere sul ghiaccio</td></tr><tr><td>Siringhe da insulina da 28 G</td><td>BD</td><td>329410</td><td>Per iniezione intraorbitale</td></tr><tr><td>Paraformadeide</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>Per la fissazione dei tessuti</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>OmniPur</td><td>4050</td><td>Per la decalcificazione del tessuto osseo</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Leica</td><td>Leica S6E stereo</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II sistema di imaging</td><td>Advanced Molecular Vision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi anti-GFP (JL-8)</td><td>Clontech</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi anti-ALP</td><td>Abcam</td><td>ab108337</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Osterix anticorpi</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td></td></tr></tbody></table>

intra-iliaca iniezione per un efficiente e selettivo modellazione di microscopico metastasi ossee

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

L'iniezione intra-iliaca (IIA) è un approccio efficace per introdurre lesioni metastatiche di varie cellule tumorali negli animali. Rispetto alle iniezioni intracardiache e intratibiali ampiamente utilizzate, l'iniezione di IIA porta diversi vantaggi. In primo luogo, può fornire una grande quantità di cellule tumorali specificamente alle ossa degli arti posteriori, fornendo così eventi di colonizzazione in fase iniziale sincronizzati spazio-temporalmente e consentendo una solida quantificazione e un rapido rilevamento delle cellule tumorali disseminate. In secondo luogo, inietta le cellule tumorali nella circolazione senza danneggiare i tessuti locali, evitando così i processi infiammatori e di guarigione delle ferite che confondono il processo di colonizzazione ossea. In terzo luogo, l'iniezione di IIA provoca una crescita metastatica molto ridotta negli organi non ossei, impedendo così agli animali di soccombere ad altre metastasi vitali e consentendo il monitoraggio continuo delle lesioni ossee indolenti. Questi vantaggi sono particolarmente utili per l'ispezione della progressione da singole cellule tumorali a micrometastasi multicellulari, che in passato è stata in gran parte sfuggente. Se combinata con approcci all'avanguardia di imaging biologico e istologia ossea, l'iniezione di IIA può essere applicata a vari scopi di ricerca relativi alle metastasi ossee.

La figura 1 illustra la posizione anatomica e rapporto iliaca comune (rosso) e vena (blu). La figura 2 mostra la posizione relativa dei vasi iliaci e nervi al microscopio di dissezione. Come illustrato nella Figura 2A, i vasi e nervi sono proprio sotto la parete peritoneale e possono essere rivelate dopo l&#39;incisione cutanea è fatto e il peritoneo viene spinto via. La vena ...

Questo manoscritto fornisce la procedura dettagliata dell'iniezione intra-iliaca dell'arteria (IIA), una tecnica per fornire cellule tumorali specificamente ai tessuti degli arti posteriori, comprese le ossa, per stabilire metastasi ossee sperimentali. Sebbene inizialmente stabilito con modelli di tumore al seno, questo protocollo può essere facilmente esteso ad altri tipi di cancro.

Intra-iliaca iniezione per un efficiente e selettivo Modellazione di microscopico metastasi ossee

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire una metastasi ossea sperimentale somministrando direttamente cellule tumorali ai tessuti dell'arto posteriore, inclusi gli ossi, mediante iniezione nell'arteria iliaca. Pertanto, questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali sulla colonizzazione ossea da parte del cancro al seno, in particolare nella fase iniziale di questo processo, e su come le cellule del carcinoma mammario interagiscono con le cellule del microambiente osseo. Oggi abbiamo effettuato l'iniezione nell'arteria iliaca.Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di stabilire in modo efficiente e selettivo un modello sperimentale microscopico di metastasi ossea per vari tipi di cancro, senza provocare danni ai tessuti locali. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché individuare con precisione la posizione dell'iniezione nell'arteria iliaca sotto il microscopio potrebbe richiedere pratica per raggiungere un tasso di successo superiore al novanta percento. Iniziare verificando il livello appropriato di sedazione mediante pizzicamento delle dita dei piedi di un topo di venti grammi, di età compresa tra cinque e sei settimane.Dopo aver applicato il pomata oculare, pulire più volte l'area rasata dell'inguine destro utilizzando tamponi di cotone sterili imbevuti di etanolo isopropilico al 70% in sequenza, seguiti da una detersione chirurgica con betadine. Successivamente, coprire l'intero topo con un telo sterile. Quindi, utilizzare una lama sterile in acciaio al carbonio numero dieci e un manico numero tre per effettuare un'incisione cutanea lunga da uno a 1,2 centimetri tra il quarto e il quinto capezzolo nell'addome inferiore destro.Trasferire l'animale sotto un microscopio da dissezione standard da banco. Con l'obiettivo 4X, inserire una pinzetta ottusa nell'incisione tra il tessuto adiposo e il peritoneo, e spingere i tessuti verso l'esterno su entrambi i lati per esporre i vasi iliaci e i nervi. Successivamente, utilizzare una pinzetta fine e dritta per rompere il tessuto connettivo tra i vasi e il nervo più vicino ai vasi.Quindi, far scivolare una pinza angolata attraverso il tessuto connettivo e al di sotto dei vasi iliaci, inserendo contemporaneamente la pinza dritta nei tessuti connettivi sull'altro lato dei vasi per guidare la pinza angolata attraverso il tessuto. Si consiglia di separare e sollevare il margine iliaco e l'arteria come un unico fascio in questo passaggio. Sebbene le cellule tumorali vengano iniettate soltanto nell'arteria, risulta più rapido ed efficiente isolare entrambi i vasi contemporaneamente.Una volta posizionate le pinze angolate, separare ulteriormente la vena iliaca e l'arteria dal tessuto circostante, mantenendo i vasi sopra le pinze angolate durante la dissezione. Quando i vasi sono ben visibili, utilizzare le pinze dritte per passare la punta di un filo di sutura in seta 4-0 alle pinze angolate e far scivolare lentamente e delicatamente il filo al di sotto dei vasi. Sia la vena iliaca comune che i vasi arteriosi dovranno quindi essere sostenuti dal filo di sutura.Quando i vasi sono pronti, pipettare su e gi&ugrave; le cellule tumorali diverse volte per ri-sospendere in una soluzione di cellule singole e per rompere eventuali aggregati. Quindi, aspirare 100 microlitri di cellule per topo in una siringa per insulina da 31 gauge. Ora, far scivolare nuovamente la pinza angolata sotto i vasi utilizzando il filo come guida e aprire la pinza in modo che i vasi si adagino delicatamente sulle punte.Con l'altra mano, inserire la punta dell'ago, con il bevel rivolto verso l'alto, nella luz della sezione dell'arteria compresa tra le punte delle pinzette. Premere lentamente lo stantuffo per iniettare le cellule. La sospensione cellulare spingerà il sangue attraverso il vaso. Dopo aver consegnato tutte le cellule, rimuovere delicatamente l'ago, mantenendo i vasi sollevati con la pinzetta per prevenire sanguinamenti. Successivamente, rimuovere il punto di sutura. Infine, togliere rapidamente la pinzetta e premere un batuffolo di cotone sull'incisione per cinque-dieci minuti per arrestare il sanguinamento.Di seguito è mostrata un'immagine bioluminescente rappresentativa di un animale intero, ottenuta dopo l'iniezione nell'arteria iliaca di cinque volte 10 alla quinta cellule tumorali della mammella MCF-7 marcate con GFP luciferina, seguita dall'amministrazione di d-luciferina mediante iniezione nel seno retro-orbitale. A 14 giorni dall'iniezione, si è osservato un forte segnale bioluminescente nell'osso posteriore iniettato attraverso l'arteria iliaca, ma non nell'osso controlaterale di controllo, confermando la localizzazione specifica delle cellule iniettate. L'analisi istologica con colorazione ematossilina-eosina (H&E) delle ossa portatrici di tumore ha inoltre evidenziato una popolazione cellulare compatta, simile a selciato, con nuclei grandi, indicativa di lesioni metastatiche microscopiche da MCF-7 nel tessuto osseo a 14 giorni dall'iniezione nell'arteria iliaca.Inoltre, la colorazione immunofluorescente delle sezioni ossee ha rivelato anche un'intima mescolanza delle cellule MCF-7 con osteoblasti e preosteoblasti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in dieci-quindici minuti. Dopo aver eseguito queste procedure, è possibile utilizzare altri metodi per rispondere a ulteriori domande.Ad esempio, possiamo utilizzare l'RNA-Seq per analizzare le cellule del microambiente nella nicchia di metastasi e confrontarle con cellule normali. Questa tecnica fornisce un metodo per cui i ricercatori di cancro al seno e i ricercatori di cancro alla prostata possono studiare le micrometastasi ossee negli animali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come stabilire un modello di metastasi ossea del cancro al seno mediante iniezione nell'arteria iliaca interna.Si prega di adottare le opportune precauzioni poiché lavorare con chetamina e xilazina potrebbe essere estremamente pericoloso.

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Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

La modellazione della metastasi cerebrale intracraniciale è complicata dall'incapacità di monitorare le dimensioni del tumore e la risposta al trattamento con metodi precisi e tempestivi. La metodologia presentata accoppia l'iniezione di tumore intracranico con l'analisi della risonanza magnetica, che se combinata, coltiva iniezioni precise e coerenti, un monitoraggio degli animali migliorato e misurazioni accurate del volume tumorale.

Modellazione delle metastasi cerebrali attraverso l'iniezione intracraniciale e la risonanza magnetica

I modelli di metastasi ossee non sviluppano metastasi in modo uniforme o con un'incidenza del 100%. L'iniezione diretta di cellule tumorali intra-ossee può provocare l'embolizzazione del polmone. Presentiamo la nostra tecnica di modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee utilizzando l'impianto di innesto tumorale solido nell'osso, portando a attecchimento e crescita riproducibili.

Modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee con impianto di innesto tumorale solido nell'osso

Descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali di cancro al seno generate tramite iniezione di vena della coda di una linea cellulare di carcinoma mammario infiammatorio amplificata endogenamente da HER2.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Qui, presentiamo un protocollo per l'iniezione intra-cardiaca di cellule tumorali della prostata umane per generare un modello murino con lesioni da metastasi ossee.

Iniezione intracardiaca di cellule tumorali della prostata umane per creare un modello murino di xenotrapianto di metastasi ossee

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Modellizzazione della metastasi cerebrale: analisi standardizzata della colonizzazione metastatica e dei modelli di crescita istologica tramite iniezione intracorticale stereotattica

Scopri l'iniezione intra-iliaca per modellare metastasi ossee microscopiche in modelli murini. Questa tecnica consente di studiare l'interazione tra cellule tumorali e microambiente osseo con elevata efficienza e selettività.

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