Intra-iliaca iniezione per un efficiente e selettivo Modellazione di microscopico metastasi ossee

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stabilire metastasi ossee sperimentali fornendo cellule tumorali direttamente ai tessuti degli arti posteriori, comprese le ossa, tramite iniezione intra-iliaca dell'arteria. Quindi questo metodo può aiutarci a rispondere alle domande chiave sulla colonizzazione ossea del cancro al seno, specialmente nella fase iniziale di questo processo, come le cellule del cancro al seno interagiscono con le cellule del microambiente nell'osso. Oggi abbiamo fatto un'iniezione all'arteria iliaca.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che stabilisce in modo efficiente e selettivo un modello sperimentale di metastasi ossee microscopiche per vari tipi di cancro senza causare danni ai tessuti locali. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché trovare un'iniezione accurata, la posizione dell'iniezione dell'arteria iliaca sul microscopio può richiedere pratica per ottenere un tasso di successo dell'iniezione superiore al novanta percento. Inizia confermando il livello appropriato di sedazione pizzicando le dita dei piedi di un topo di venti grammi di cinque o sei settimane.

Dopo aver applicato l'unguento per gli occhi, pulire più volte la zona dell'inguine destro rasato con tamponi di cotone sequenziali, sterili, imbevuti di etanolo isopropilico al 70%, seguiti da uno scrub chirurgico a base di betadina. Quindi, copri tutto il topo con un telo sterile. Quindi, utilizzare una lama sterile in acciaio al carbonio numero dieci e un manico numero tre per praticare un'incisione cutanea da uno a 1,2 centimetri tra il quarto e il quinto capezzolo nell'addome inferiore destro.

E trasferire l'animale sotto un microscopio da dissezione da banco standard. Sotto l'obiettivo 4X, inserire una pinza di separazione smussata nell'incisione tra il tessuto adiposo e il peritoneo e spingere i tessuti verso l'esterno su entrambi i lati per rivelare i vasi iliaci e i nervi. Quindi, usa una pinza dritta e sottile per sfondare il tessuto connettivo tra i vasi e il nervo più vicino ai vasi.

Quindi, fai scorrere le pinze angolate attraverso il tessuto connettivo e sotto i vasi iliaci, inserendo le pinze diritte nei tessuti connettivi sull'altro lato dei vasi per guidare le pinze angolate attraverso il tessuto. Si consiglia di separare e sollevare il bordo iliale e l'arteria come un fascio per questo passaggio. Sebbene le cellule tumorali vengano iniettate solo nell'arteria, si risparmia tempo e fatica isolare entrambi i vasi insieme.

Una volta che la pinza angolata è in posizione, separare ulteriormente la vena iliaca e l'arteria dal tessuto circostante, mantenendo i vasi sopra la pinza angolata durante la dissezione. Quando i vasi sono liberi, usa la pinza dritta per erogare la punta di una sutura di seta 4-0 alla pinza angolata e tira la sutura lentamente e delicatamente sotto i vasi. Sia la vena comune iliaca che i vasi arteriosi devono quindi essere sostenuti dalla sutura.

Quando i recipienti sono pronti, pipettare più volte le cellule tumorali su e giù per risospenderle in una soluzione a cellula singola e rompere eventuali grumi. Quindi, aspirare 100 microlitri di cellule per topo in una siringa da insulina calibro 31. Ora, fai scorrere le pinze angolate sotto i vasi usando la sutura come guida e apri le pinze in modo che i vasi poggino delicatamente sulle punte.

Con l'altra mano, inserire la punta dell'ago con il lato smussato rivolto verso l'alto nel lume della sezione dell'arteria tra le punte delle pinze. Premere lentamente lo stantuffo per iniettare le cellule. La sospensione cellulare farà scorrere il sangue attraverso il vaso.

Quando tutte le cellule sono state espulse, rimuovere delicatamente l'ago, mantenendo i vasi sollevati sulla pinza per evitare sanguinamenti. Quindi, estrarre la sutura. Infine, rimuovi rapidamente la pinza e premi un batuffolo di cotone sull'incisione per cinque-10 minuti per fermare l'emorragia.

Qui, viene mostrata un'immagine bioluminescente rappresentativa di un intero animale dopo iniezione intra-iliaca di cinque volte 10 al quinto GFP luciferina marcate con cellule di carcinoma mammario marcate con luciferina seguita da somministrazione di d-luciferina mediante iniezione del seno retro-orbitale. Al giorno 14 dopo l'iniezione, è stato ottenuto un forte segnale di bioluminescenza dall'osso posteriore iniettato nell'arteria intra-iliaca, ma non dall'osso di controllo controlaterale, confermando la localizzazione specifica delle cellule iniettate. Il sezionamento di una colorazione H&E delle ossa portatrici di tumore ha anche dimostrato una popolazione cellulare compatta, simile a un ciottolo, con nuclei di grandi dimensioni indicativi di microscopiche lesioni metastatiche MCF-7 nel tessuto osseo 14 giorni dopo l'iniezione intra-iliaca dell'arteria.

Inoltre, la colorazione immunofluorescente delle sezioni ossee ha anche rivelato una commistione delle cellule MCF-7 con osteoblasti e preosteoblasti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in dieci-quindici minuti. Seguendo queste procedure, è possibile utilizzare altri metodi per rispondere ad altre domande.

Ad esempio, possiamo utilizzare l'RNA-Seq per profilare le cellule del microambiente nella nicchia delle metastasi e confrontarle con le cellule normali. Questa tecnica fornisce un modo per i ricercatori sul cancro al seno e per i ricercatori sul cancro alla prostata di studiare le micrometastasi ossee negli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire un modello di metastasi ossee del cancro al seno mediante iniezione intra-iliaca dell'arteria.

Si prega di prendere le dovute precauzioni perché lavorare con ketamina e xilazina potrebbe essere estremamente pericoloso.