Name: Una guida per Strutturato illuminazione TIRF Microscopia a alta velocità con colori multipli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Impara a costruire e allineare un microscopio TIRF-SIM per imaging super-risoluzione ad alta velocità su cellule viventi. Questo metodo consente di studiare processi dinamici biologici con risoluzione temporale rapida.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Leverhulme Trust, l&#39;Ingegneria e Scienze Fisiche Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089.703 / Z / 09 / Z] e Medical Research Council [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Ringraziamo E. Avezov e M. Lu per trasfezione del LifeAct-GFP e cellule citosolica-GFP, rispettivamente, e W. Chen per la preparazione della cultura HEK293. Ringraziamo anche K. O&#39;Holleran per l&#39;assistenza con il design del microscopio, e L. Shao e R. Heintzmann per le discussioni e suggerimenti utili.

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<li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li>
<li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li>
<li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li>
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<li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li>
<li>Esbjörner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+amyloid+%CE%B2+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A%CE%B2%281-40%29+and+A%CE%B2%281-42%29+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li>
<li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li>
<li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Super-Resolution+Imaging+of+%CE%B2-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo%3A+Method+and+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Biol.+Alzheimer%27s+Dis.+SE+-+6%22%5BJournal%5D)">Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li>
<li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+resolution+wide-field+optical+imaging%3A+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945(2006).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li>
<li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li>
<li>Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li>
<li>Förster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663(2014).</li>
<li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fastSIM%3A+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001(2015).</li>
<li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+internal+reflection+microscopy%3A+super-resolution+imaging+of+bacterial+dynamics+and+dark+field+imaging%22">Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging</a>. , University of Freiburg. (2012).</li>
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<li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li>
<li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723(2013).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915(2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> sistemi TIRF-SIM custom-built, come la messa a punto in dettaglio in questo protocollo sono in grado di immagini multicolore super-risoluzione ad alta velocità rispetto ai microscopi disponibili in commercio. Il vantaggio intrinseco di SIM come tecnica super-risoluzione è che la risoluzione temporale non è limitata dalle fotofisica del fluoroforo, rispetto ad altri metodi come singola molecola di localizzazione microscopia (SMLM) o metodi di scansione di punti come la microscopia esaurimento emissione stimolata ( STED). A differenza di queste altre tecniche, SIM non richiede fluorofori photoswitchable o esauribili così immagini multicolore è semplice. Sistemi non TIRF-SIM, come ottica sezionamento SIM e multifocale SIM solito possono ottenere miglioramenti risoluzione di 1,7 volte o meno in pratica rispetto al fattore di 2 miglioramento qui riportato, e sistemi commerciali sono spesso più lento e meno flessibile rispetto al sistema presentato in questo protocollo. &quot;&gt; Le due principali difficoltà di attuazione di questa tecnica sono in primo luogo la necessità di posizionamento preciso dei sei travi SIM all&#39;interno della zona TIR di apertura posteriore del obiettivo, che richiede un tempo laboriosa e consumare procedura di allineamento ottico. In secondo luogo, per produrre alto contrasto del modello il campione, la rotazione polarizzazione è essenziale. per sistemi a bassa NA 2D-SIM, la rotazione polarizzazione può essere evitata da un&#39;attenta scelta dell&#39;orientamento polarizzazione lineare, ma questo diventa impossibile per TIRF-SIM 25. per l&#39;imaging multicolore ad alta velocità, elettro controllo della polarizzazione ottica è necessario e questo aumenta la complessità ei costi di sistema. Limitazioni della tecnica TIRF-SIM, come TIRF convenzionale, è naturalmente limitato all&#39;osservazione di strutture e processi situati sulla membrana cellulare basale che può essere illuminata dalla profondità di penetrazione 150-200 nm campo evanescente biologici. MentreSIM è spesso citato come meno photodamaging di cellule rispetto sia STED o SMLM, risoluzione raddoppio laterale fa ancora aumentare il numero di fotoni da almeno 4 volte 5 rispetto alla microscopia TIRF convenzionale. Per l&#39;imaging ad alte frequenze di fotogrammi con esposizioni brevi tempi, questo aumento di fotoni richiede l&#39;utilizzo di un aumento delle intensità di illuminazione. Mentre ogni fluoroforo può essere utilizzata per l&#39;imaging SIM di campioni movimento fissi o lente, proteine ​​fluorescenti ad alta luminosità o di prossima generazione coloranti sintetici con maggiore fotostabilità sono raccomandati per l&#39;imaging cellulare dal vivo. Sebbene questa implementazione è capace di imaging di un singolo colore alla SIM frame rate superiori a 20 Hz, imaging multicolore nel sistema presentato è limitata dal tempo di commutazione della ruota motorizzata filtro per le emissioni. A causa delle grandi dimensioni del chip fotocamera sCMOS, l&#39;uso di un filtro di emissione multibanda e immagine ottica scissione sarebbe possibile e permettere i simultaneaMaging con più lunghezze d&#39;onda a nessuna penalità velocità. Un&#39;altra possibilità sarebbe quella di alternare i diversi laser di eccitazione e utilizzare un filtro notch multibanda per respingere la luce di eccitazione. L&#39;uso di un SLM ferroelettrico binario in questa implementazione non è ottimale. L&#39;efficienza di diffrazione di tale SLM è molto bassa, quindi la maggior parte della luce incidente è nella riflessione di ordine zero, che viene filtrato dalla maschera spaziale. Per applicazioni che richiedono molto elevati frame rate, la velocità di imaging è quindi limitata dalla potenza dei diodi laser. Il SLM introduce anche alcune ellitticità nella polarizzazione per lunghezze d&#39;onda di distanza dalla lunghezza d&#39;onda 550 nm disegno dove i pixel non operano piastre semionda come ideali. Sebbene questo potrebbe essere compensato utilizzando un LCVR aggiuntivo, la soluzione ideale può essere l&#39;uso di un dispositivo di micro-specchio digitale (DMD) come generatore di pattern. eventuali modifiche Il Prese di installazionented qui è flessibile e più facilmente modificati rispetto agli strumenti commerciali in modo da altre modalità di imaging come il 3D-SIM, veloce 2D-SIM, multifocale SIM (MSIM) e SIM non lineare (NL-SIM) possono essere implementate 21,34,35. 2D-SIM può essere adatto per l&#39;imaging relativamente piatto, strutture in rapido movimento, come il reticolo endoplasmatico periferica. La ER periferico è più profondo all&#39;interno della cellula che può essere illuminato con un campo evanescente TIRF, ma a causa della sua struttura piatta può essere ripreso con standard di 2D-SIM con trascurabile sfondo out-of-focus. Inoltre, l&#39;uso di migliori algoritmi di ricostruzione sezionamento ottico per sopprimere out-of-focus luce estendere l&#39;uso del 2D-SIM per otticamente campioni di spessore, sia pure in cui la risoluzione assiale raddoppio non è richiesto 21. In MSIM, il campione viene illuminato da un reticolo rada di eccitazione foci 36. Questa modalità può essere attuata semplicemente rimuovendo la maschera spaziale (SM) E la sua sostituzione con un polarizzatore. Il SLM ora funziona come un modulatore di ampiezza. Le griglie SIM binari visualizzate sul SLM possono essere sostituiti da un reticolo 2D di macchie, con la dimensione dei punti scelti per essere uguale alla dimensione di diffrazione limitata attenzione nel piano immagine. Nella Figura 7A, un reticolo di 4 x 4 pixel quadrati viene visualizzato sul SLM (riquadro) che quando demagnified sul campione genera diffrazione foci limitato di 150 x 150 nm, date le dimensioni SLM pixel fisica di 13,62 micron. La foci eccitazione può poi essere tradotto spostando il modello reticolare sulla SLM e questo si ripete più volte al fine di illuminare l&#39;intero campo visivo. Le immagini vengono acquisite per ogni posizione schema tradotto e lo stack è post-elaborati per ottenere una immagine ricostruita con una migliore risoluzione fino a un fattore di <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> e ridotto out-of-focus luce rispetto all&#39;immagine widefield equivalente30. Questa modalità può essere utile per l&#39;imaging spessi campioni, densi che SIM standard è inadatto, ad esempio strutture a basso contrasto come globuli rossi macchiati (figura 7C), anche se il tempo di acquisizione viene aumentato a causa del gran numero di fotogrammi prime richiesto per ogni campo di vista (in questo caso N = 168). Infine, la configurazione può essere modificato per consentire sia di alta NA lineare TIRF-SIM o l&#39;attivazione fantasia non lineare SIM (PA NL-SIM), così come presentato di recente da Li et al., Mediante l&#39;uso di un 1,7 oggettiva NA altissima o aggiunta di un laser fotoattivazione 405 nm e un&#39;attenta ottimizzazione delle SLM modelli grata 35. Applicazioni future SIM è ancora una tecnica in rapida evoluzione e molte applicazioni nelle scienze della vita verrà attivato in futuro. La velocità, la risoluzione, e miglioramenti di contrasto della tecnica e la capacità di utilizzare fluorofori standard di mean che per bioimaging, SIM è impostato per sostituire molti sistemi microscopio convenzionali, quali le piattaforme campo confocale e larghezza. sistemi SIM commerciali sono già disponibili oggi con le specifiche tecniche eccezionali, tuttavia, sono al di là della portata finanziaria di molti laboratori di ricerca, e, soprattutto, sono inflessibili essere modificate e sviluppate per implementare i più recenti sviluppi della ricerca in questo campo. Mancano anche la capacità essenziale &#39;essere adattato per l&#39;esperimento a portata di mano&#39;, spesso un collo di bottiglia critica nel taglio della ricerca delle scienze della vita bordo. Il sistema qui descritto sarà particolarmente adatto per lo studio dei processi dinamici vicino alla superficie delle cellule, per gli studi in vitro su sistemi doppio strato ricostituiti, per studiare chimica di superficie nei materiali e delle scienze fisiche, ad es. di materiali 2D, e molte altre applicazioni.

Nel corso dell&#39;ultimo mezzo di un decennio, super-risoluzione microscopia è maturato e si è trasferito dai laboratori di ottica specializzati nelle mani del biologo. Esistono soluzioni microscopio commerciali per le tre varianti principali per il raggiungimento ottica super-risoluzione: singolo microscopio molecola di localizzazione (SMLM), stimolata esaurimento emissione di microscopia (STED), e strutturato illuminazione microscopia (SIM) 1,2. SMLM quali la microscopia fotoattivato localizzazione (PALM) e stocastico ricostruzione microscopia ottica (Storm) sono stati le tecniche più popolari, in gran parte dovuto alla semplicità della configurazione ottica e la promessa di alta risoluzione spaziale, facilmente fino a 20 nm. Tuttavia super-risoluzione microscopia tramite un&#39;unica localizzazione molecola è dotato di una intrinseca trade-off: la risoluzione ottenibile spaziale dipende da accumulare un numero sufficiente di singole localizzazioni fluoroforo, limitando così la risoluzione temporale. processo dinamico Imaginges in cellule vive diventa quindi problematica come si deve adeguatamente campionare il movimento della struttura di interesse per evitare artefatti da movimento, mentre anche l&#39;acquisizione eventi localizzazione abbastanza in quel momento per ricostruire un&#39;immagine. Al fine di soddisfare tali esigenze, dimostrazioni dal vivo SMLM cellule hanno ottenuto l&#39;aumento richiesto dei tassi di fluorophore photoswitching aumentando notevolmente la potenza di eccitazione, e questo porta a sua volta a fototossicità e lo stress ossidativo, limitando in tal modo i tempi di sopravvivenza del campione e rilevanza biologica 3. Un chiaro vantaggio di STED su SIM e SMLM è che può un&#39;immagine con super-risoluzione in campioni spessi, per esempio risoluzione laterale di circa 60 nm è stata raggiunta in fettine cerebrali organotipica a profondità fino a 120 micron 4. Imaging a tali profondità con singole implementazioni oggettive di SMLM o SIM è irrealizzabile, ma diventa possibile con uno strato di luce singola molecola o reticolo foglio luce microscopy 5. Video-rate STED è stata dimostrata anche e utilizzato per mappare la mobilità delle vescicole sinaptiche, anche se finora è stato limitato a l&#39;imaging piccoli campi di vista 6. Per applicazioni in biologia cellulare e reazioni molecolari auto-assemblaggio 7 - 12 che richiedono immagini ad alta risoluzione temporale di numerose punti di tempo, microscopia illuminazione strutturata (SIM) può essere molto adatta poiché non dipende dalle proprietà fotofisiche di un particolare fluorescente sonda. Nonostante il vantaggio intrinseco di SIM, fino ad ora il suo utilizzo è stato principalmente confinata l&#39;imaging cellule fisse o processi in movimento lento. Ciò è dovuto alle limitazioni dei sistemi SIM disponibili in commercio: il frame rate acquisizione di questi strumenti è limitata dalla velocità di rotazione dei reticoli utilizzati per generare i pattern di illuminazione sinusoidali richieste nonché il mantenimento di polarizzazione ottica. La nuova generazione di SIM commercialegli strumenti sono in grado di immagini veloci, ma sono proibitivo per tutti, ma strutture di imaging centrali. Questo protocollo presenta una guida per la costruzione di un sistema SIM flessibile per l&#39;imaging processi veloci in campioni sottili e vicino alla superficie basale delle cellule viventi. Impiega riflessione interna totale in fluorescenza (TIRF) per generare un pattern di illuminazione che penetra non più profondo di circa 150 nm nel campione 13 che riduce notevolmente il segnale di fuori fuoco sfondo. L&#39;idea di combinare SIM con TIRF è quasi vecchia quanto SIM stessa 14, ma non è stato realizzato sperimentalmente entro il 2006 15. La prima in vivo immagini ottenute con TIRF-SIM sono stati segnalati nel 2009 16 hanno raggiunto un frame rate di 11 Hz per visualizzare tubulina e kinesin dinamica, e due sistemi TIRF-SIM colori sono stati presentati 17,18. Più recentemente, una guida per la costruzione e l&#39;uso di un solo colore due raggi SIM sistema è stato presentato con frame-rate fino a 18 Hz 19,20. Il set-up qui presentato è in grado di immagini super-risoluzione SIM a 20 Hz in tre colori, due dei quali possono essere azionate in TIRF-SIM. L&#39;intero sistema è costruito attorno ad un telaio microscopio invertito e utilizza una fase di traduzione xy motorizzato con un piezo-azionato fase z. Per generare i pattern di eccitazione sinusoidali necessari per TIRF-SIM, il sistema presentato utilizza un ferroelettrico modulatore spaziale di luce (SLM). modelli reticolo binari vengono visualizzati sul SLM e le conseguenti ± 1 ordini di diffrazione sono filtrati, inoltrati e concentrati sul ring TIR della lente dell&#39;obiettivo. Gli sfasamenti necessari e rotazioni delle grate sono applicate cambiando l&#39;immagine visualizzata SLM. Questo protocollo descrive come costruire e allineare tale percorso di eccitazione, dettagli l&#39;allineamento del percorso di emissione, e presenta campioni per assicurare un allineamento ottimale. E &#39;anche De<html> scribi i problemi e le sfide particolari ad alta velocità TIRF-SIM in materia di controllo della polarizzazione e la sincronizzazione dei componenti. Considerazioni sulla progettazione e vincoli Prima di montare il sistema TIRF-SIM presentato in questo protocollo, ci sono diversi vincoli progettuali da considerare che determinano la scelta dei componenti ottici. Tutte le abbreviazioni di componenti ottici riferimento alla Figura 1. Spatial luce modulatore (SLM) Un binario ferroelettrico SLM viene utilizzato in questa configurazione in quanto è in grado di commutazione modello sub-millisecondo. In scala di grigi SLMs nematici possono essere utilizzati, ma questi offrono notevolmente ridotti tempi di commutazione. Ogni o disattivare pixel in una fase binaria SLM impartirà sia una fase π o 0 offset per il fronte d&#39;onda piana incidente, quindi se un modello di reticolo periodico viene visualizzato sul SLM opererà come un reticolo di fase di diffrazione. ent &quot;&gt; riflessione interna totale (TIR) Per raggiungere TIR e produrre un campo evanescente, l&#39;angolo di incidenza dei raggi eccitazione all&#39;interfaccia vetro-campione deve essere maggiore dell&#39;angolo critico <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> . Questo imposta l&#39;angolo minimo incidente richiesto, e quindi anche la distanza massima, o il periodo, del pattern di illuminazione evanescente. L&#39;angolo massimo incidente <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> (L&#39;angolo di accettazione) è limitata dalla apertura numerica (NA) della lente obiettivo che può essere calcolata dalla definizione <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> . Questo determina il pattern minima spaziatura ottenibile secondo la formula Abbe <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> che collega NA e lunghezza d&#39;onda <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" /> alla distanza minima del pattern <imgalt = &quot;Equazione&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot; /&gt;. In pratica, un obiettivo 1,49 NA olio di immersione TIRF produce un angolo massimo di incidenza di circa 79 ° ed un periodo minimo pattern sul campione di 164 nm, usando una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 488 nm. Questi due angoli definiscono un anello nell&#39;apertura posteriore dell&#39;obiettivo su cui lo strumento raggiunge illuminazione TIR (es. L&#39;anello TIR) ed in cui il foci due eccitazione deve essere posizionato in modo accurato e preciso ruotato per generare ogni pattern di illuminazione. Ricostruzione di immagini TIRF-SIM richiede l&#39;acquisizione di un minimo di tre sfasamenti per giro modello quindi il periodo di modello SLM deve essere divisibile per 3 (vedi figura 1). Per esempio, un periodo di 9 pixel per illuminazione 488 nm e 12 pixel per 640 nm illuminazione. Per una discussione completa di disegno del modello SLM, tra cui l&#39;ottimizzazione sub-pixel del modello di spaziatura utilizzando griglie tranciati, Vedere il lavoro precedente di Kner et al. 16 e Lu-Walther et al. 20 La posizione dei due fuochi di eccitazione deve essere all&#39;interno dell&#39;anello TIR per tutte le lunghezze d&#39;onda, tuttavia l&#39;angolo di diffrazione di ± 1 ordini dal SLM è la lunghezza d&#39;onda dipendente. Per SIM standard, immagini multicolore può essere raggiunto ottimizzando il periodo griglia per la lunghezza d&#39;onda più lunga, e tollerare una perdita di prestazioni per i canali più brevi. Per TIRF-SIM tuttavia, l&#39;ottimizzazione per una lunghezza d&#39;onda che l&#39;altra lunghezza d&#39;onda foci più all&#39;interno dell&#39;anello TIR sono. Ad esempio, utilizzando un reticolo a passo di 9 pixel è sufficiente a fornire TIRF per 488 nm, come i fuochi sono al 95% del diametro della apertura posteriore e all&#39;interno dell&#39;anello TIR, ma per 640 nm questo periodo deve posizionare il foci esterno l&#39;apertura. Per questo motivo diverse distanze modello di pixel devono essere utilizzati per ogni lunghezza d&#39;onda di eccitazione. L&#39;allineamento del percorso di eccitazione TIRF-SIMè estremamente sensibile a piccole variazioni della posizione dello specchio dicroico (DM4 in figura 1) nel corpo del microscopio, molto più che in SIM convenzionale. L&#39;uso di un filtro rotante a torretta cubo non è consigliabile, invece utilizzare un unico, multi-banda specchio dicroico, che viene mantenuta in posizione fissa e progettato specificamente per le lunghezze d&#39;onda di eccitazione utilizzati. È essenziale che solo i più alti specchi dicroici qualità vengono utilizzati. Questi richiedono substrati spessore di almeno 3 mm, e sono spesso indicati come &quot;immagine piana&quot; dal costruttore. Tutti gli altri substrati portano ad aberrazione intollerabile e degradazione dell&#39;immagine in TIRF-SIM. controllo Polarizzazione Per raggiungere TIRF-SIM è essenziale per ruotare lo stato di polarizzazione della luce di eccitazione in sincronia con il pattern di illuminazione tale da rimanere azimutalmente polarizzata nel piano pupilla dell&#39;obiettivo rispetto all&#39;asse ottico (cioè. s-polarizzata). L&#39;allineamento delle ottiche di controllo della polarizzazione dipenderà dell&#39;elemento ottico specifico impiegato, per esempio una cella Pockels 21, o un piatto semionda in una fase di rotazione motorizzata 22. In questo protocollo viene utilizzato un cristallo liquido personalizzato rallentatore variabile (LCVR), progettato per fornire full-wave (2π) ritardata propagazione nella gamma di lunghezze d&#39;onda 488-640 nm in quanto consente veloce (~ msec) di commutazione. Se si utilizza un rallentatore cristalli liquidi è indispensabile utilizzare un componente di alta qualità: componenti standard non sono in genere abbastanza stabile che invia un ritardo della costante su tutta la lunghezza del tempo di esposizione della fotocamera che porta ad una sfocatura fuori dal pattern di illuminazione e basso contrasto modulazione . ritardanti cristalli liquidi sono anche fortemente dipendente dalla temperatura e richiedono costruito nel controllo della temperatura. Sincronizzazione I laser devono essere sincronizzati con il SLM. SLMs ferroelettrici binari sono bilanciati internamente da switching tra un sullo stato e fuori dalla condizione. I pixel agiscono solo piastre onda come mezzo in entrambi loro o disattivare stato, ma non durante la commutazione interframe tempo. Pertanto i laser devono essere accesi solo durante gli stati on / off mediante il LED segnale di abilitazione dal SLM per impedire una riduzione del contrasto del modello a causa dello stato intermedio dei pixel. Un modulatore acusto-ottico (AOM) può alternativamente essere usato come un otturatore veloce se il laser non possono essere modulati digitalmente. Scelta di lenti Sulla base di questi vincoli, la demagnification dell&#39;aereo SLM desiderata sul piano di campionamento per produrre gli schemi di illuminazione desiderati possono essere determinati. Questo permette di calcolare le lunghezze focali delle due lenti L3 e L4 nel telescopio relè immagine e la lente di eccitazione del condensatore L5. In questo sistema a / olio 1.49NA immersion lente obiettivo 100X viene utilizzato con 488 nm e 640 nm di eccitazione, quindi utilizza lunghezze focali di 300 e 140 millimetriper L4 e L3, e 300 mm per L5, dando un totale di demagnification 357X, equivalente ad una dimensione SLM pixel di 38 nm in corrispondenza del piano del campione. Utilizzando questa combinazione di lenti, SLM reticolo periodi di 9 per 488 illuminazione nm e 12 pixel per 640 nm indica spaziature reticolo di 172 e 229 nm a campione, corrispondenti ad angoli di incidenza di 70 ° e 67 °, rispettivamente. Per un&#39;interfaccia bicchiere d&#39;acqua, l&#39;angolo critico è 61 °, ed è indipendente dalla lunghezza d&#39;onda, quindi questi due spaziature modello permettono di eccitazione TIRF per entrambe le lunghezze d&#39;onda. Una lente obiettivo dotato di un collare di correzione è utile per la correzione delle aberrazioni sferiche introdotti da variazioni di spessore coprioggetto, o se si opera a 37 ° C. immagine ricostruzione Una volta che i dati grezzi SIM è stata acquisita è una questione di sforzo computazionale per generare immagini super risolta in un processo in due fasi. In primo luogo, il pattern di illuminazione deve essere determinato perogni immagine e in secondo luogo, i componenti dello spettro SIM devono essere separati e ricombinati in modo appropriato per raddoppiare il supporto OTF effettiva (vedere Figura 6, inserti). la conoscenza precisa dei pattern di illuminazione proiettati è di primaria importanza, come i componenti di frequenza super risolti devono essere miscelato nel modo più accurato possibile per evitare artefatti causati dalle parti residue delle componenti sovrapposti. Noi determinare il pattern di illuminazione parametri a posteriori, sulla base dei dati immagine greggio a seguito del procedimento introdotto da Gustafsson et al. 23 In breve, una serie di parametri di illuminazione che descrive un normalizzato sinusoide bidimensionale deve essere trovato per ciascuno dei <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" /> modelli di eccitazione <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> : <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" /> con la presente <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> e <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" /> descrivere il contrasto frangia e il modello di partenza, rispettivamente fase di ogni singola immagine m. Le componenti del vettore d&#39;onda, <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" /> e <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> , Modificare solo con diversi orientamenti <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" /> del modello e può presume essere altrimenti costante. Per determinare grossolanamente i componenti del vettore d&#39;onda viene eseguita una correlazione incrociata di spettri immagine grezza, che si affina applicando shift subpixel una delle immagini cross-correlate da ottimizzare la sovrapposizione. Questo viene fatto attraverso la moltiplicazione dei gradienti di fase reale spazio <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" /> che inducono un cambiamento di subpixel in frefrequenza-spazio. Si noti che è utile avere una buona stima dei vettori d&#39;onda prima stima andamento reale e questo può essere trovata imaging di un livello branello fluorescente. Come passo di fase tra modelli spostato è <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> , Vale a dire. <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> , La separazione di componenti di frequenza può essere eseguita da una trasformata di Fourier lungo &quot;l&#39;asse di fase&quot;. La fase globale <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" /> e il contrasto frange <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> possono poi essere determinato utilizzando regressione lineare complessa di componenti diversi. I singoli componenti separati vengono poi combinati usando un filtro Wiener generalizzato. Per una descrizione dettagliata di entrambi estrazione di parametri e attuazione del filtro Wiener generalizzato rimandiamo al Gustafssonet al. 23 in cui viene utilizzato lo stesso algoritmo.

<table><tbody><tr><td>Laser 488 nm</td><td>Toptica</td><td>iBeam SMART</td><td>con modulazione digitale Laser</td></tr><tr><td>561 nm</td><td>OBIS</td><td>LS</td><td>coerente con modulazione digitale</td></tr><tr><td>Laser 640 nm</td><td>Cobolt</td><td>MLD</td><td>con modulazione digitale</td></tr><tr><td>Specchi dicroici passa-lungo</td><td>Thorlabs</td><td>per la combinazione di</td><td></td> fasci di eccitazione</tr><tr><td>Specchio dicroico quad band</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>spessore 3 mm, imaging TIRF piatto, montato in cubo filtrante Olympus BX</td></tr><tr><td>Specchio dicroico quad band</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>Dallo stesso lotto di cui sopra, 25 x 25 mm</td></tr><tr><td>1" montatura cinematica quadrata</td><td>Edmund Optics</td><td>58-860</td><td></td></tr><tr><td>Calcite Glan-Taylor polarizzatori</td><td>Thorlabs</td><td>GT5-A</td><td>Per l'allineamento di LCVR</td></tr><tr><td>Montatura Glan-Taylor</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PM5</td><td></td></tr><tr><td>Piastra acromatica a semionda</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-600</td><td>400-800 nm</td></tr><tr><td>Montatura a gabbia rotante</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>Per HWP</td></tr><tr><td>Rallentatore variabile a cristalli liquidi</td><td>Meadowlark Optics</td><td>SWIFT</td><td>Costruito su misura per fornire un ritardo d'onda completo nell'intervallo da 488 a 640 nm.</td></tr><tr><td>Controllore LCVR</td><td>Meadowlark Optics</td><td>D3060HV</td><td>Regolatore ad alta tensione a due canali per ritardatori a cristalli liquidi</td></tr><tr><td>Piastra acromatica a quarto d'onda</td><td>Meadowlark Optics</td><td>AQM-100-0545</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per gabbia di rotazione</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1P/M</td><td>Per</td></tr><tr><td>QWP 10 mm doppietto acromatico</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-010-A-ML</td><td>Per espansore di fascio</td></tr><tr><td>200 mm acromatico doppietto</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>per l'espansore del fascio</td></tr><tr><td>Gabbia XY Traduttori</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>Modulatore di luce spaziale ferroelettrico</td><td>Quarta dimensione Visualizza</td><td>M0787-00249&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Microdisplay SXGA-3DM (IFF) tipo M249, 1.280 x 1.024 pixel, con scheda driver</td></tr><tr><td>Telaio di montaggio SLM</td><td>Display Forth Dimension</td><td>M0787-10014</td><td>Fissato a supporto in alluminio costruito su misura</td></tr><tr><td>&Oslash; Supporto per specchio cardanico da 50,8 mm</td><td>Thorlabs</td><td>GM200/M</td><td>Per montaggio SLM</td></tr><tr><td>Palco di traslazione lineare a due assi con piattaforma rotante</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1/M</td><td>Per montaggio SLM</td></tr><tr><td>Supporto per guida</td><td>Newport</td><td>M-PRC-3</td><td>Per montaggio SLM</td></tr><tr><td>Guida ottica di precisione</td><td>Newport</td><td>PRL-6</td><td>Per montaggio SLM</td></tr><tr><td>Lente doppietta acromatica da 300 mm</td><td>Qioptiq</td><td>G322 273 322&nbsp;</td><td>f = 300 mm, diametro 31,5 mm</td></tr><tr><td>Lente doppietta acromatica da 140 mm</td><td>Qioptiq</td><td>G322 239 322</td><td>f = 140 mm, diametro 31,5 mm</td></tr><tr><td>Supporti di traslazione XY di precisione Adattatori</td><td>per montaggio obiettivo Thorlabs</td><td>LM2XY</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>SM2AD32</td><td>Per il montaggio di obiettivi da 31,5 mm in montature da 2"</td></tr><tr><td>Stadi di traslazione</td><td>Comar</td><td>12XT65</td><td>a coda di rondine, traslatore XY a trazione laterale</td></tr><tr><td>con azionamenti differenziali</td><td>Thorlabs</td><td>ST1XY-D/M</td><td>per filtro spaziale</td></tr><tr><td>Montaggio a gabbia di rotazione</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>per filtro spaziale</td></tr><tr><td>Doppietto acromatico da 300 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-300-A-ML</td><td>Lente del tubo di eccitazione</td></tr><tr><td>Stadio XY automatizzato con piastra superiore piezoelettrica a Z</td><td>ASI</td><td>PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&nbsp;</td><td>con controller MS-2000</td></tr><tr><td>Telaio per microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>UAPON100XOTIRF</td><td>100X/1.49NA</td></tr><tr><td>Ruota portafiltri ad alta velocità</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110A</td><td>con controller Prior ProScan III</td></tr><tr><td>Filtri di emissione passa-banda</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30, FF01-676/29</td><td></td></tr><tr><td>fotocamera sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA Flash v4.0</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore da palco</td><td>OKO Lab</td><td>H301-K-FRAME</td><td>Per l'imaging di cellule vive, con controller di temperatura e CO2</td></tr><tr><td>Colonnine ottiche in acciaio inox</td><td>Serie TR Thorlabs</td><td></td><td>per il montaggio di componenti ottici</td></tr><tr><td>Supporti</td> per pali <td>Serie PH Thorlabs</td><td></td><td>per il montaggio di componenti ottici</td></tr><tr><td>Supporti per specchi cinematici</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>per il montaggio di specchi da 1"</td></tr><tr><td>Interferometro di taglio</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere fluorescenti da 100 nm Life</td><td>Technologies</td><td>T-7279</td><td>Tetraspeck</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83697-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro a 8 pozzetti</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td>con vetro di copertura #1.5</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>con vetrino coprioggetto #1,5</td></tr><tr><td>da 0,01 mm</td><td>EMS</td><td>68039-22</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10613</td><td></td></tr></tbody></table>

una guida per strutturato illuminazione tirf microscopia a alta velocità con colori multipli

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

immagini super-risoluzione ottica con illuminazione microscopia strutturato (SIM) è una tecnologia chiave per la visualizzazione dei processi a livello molecolare nelle scienze biomediche e chimiche. Anche se i sistemi di SIM commerciali sono disponibili, i sistemi che sono progettati in laboratorio in grado di sovraperformare sistemi commerciali, questi ultimi in genere progettati per facilità d&#39;uso e applicazioni di uso generale, sia in termini di immagini fedeltà e velocità. Questo articolo presenta una guida dettagliata per la costruzione di un sistema di SIM che utilizza illuminazione a riflessione interna totale (TIR) ​​ed è capace di immagini fino a 10 Hz in tre colori con una risoluzione di raggiungere 100 nm. Grazie alla combinazione di SIM e TIRF, il sistema fornisce una migliore contrasto dell&#39;immagine rispetto alle tecnologie concorrenti. Per ottenere queste specifiche, diversi elementi ottici sono usati per attivare il controllo automatico sulla struttura stato di polarizzazione e spaziale della luce di illuminazione per tutti wav eccitazione disponibileelengths. I dettagli completi sulla attuazione e controllo dell&#39;hardware sono dati per ottenere la sincronizzazione tra la generazione di luce di eccitazione modello, lunghezza d&#39;onda, stato di polarizzazione e controllo della telecamera con l&#39;accento sul raggiungimento massimo frame rate di acquisizione. Un protocollo passo-passo per l&#39;allineamento del sistema e calibrazione viene presentato e il miglioramento risoluzione ottenibile è convalidato su provini ideali. La capacità per l&#39;imaging super-risoluzione video-rate è dimostrato con cellule viventi.

Questo articolo fornisce una guida approfondita per l'assemblaggio e il funzionamento di un microscopio a illuminazione strutturata operante con illuminazione a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF-SIM) per visualizzare processi biologici dinamici con super-risoluzione ottica in più colori.

Una guida per Strutturato illuminazione TIRF Microscopia a alta velocità con colori multipli

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di costruire e allineare un microscopio a illuminazione strutturata adatto per l'imaging a super risoluzione di cellule vive ad alta velocità in grado di operare in modalità TIRF e sezionamento ottico con più colori. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare che attualmente non possono essere risolte utilizzando la microscopia TIRF standard a diffrazione limitata. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua rapida risoluzione temporale rispetto ad altre tecniche di microscopia a super risoluzione, che la rendono adatta ai processi dinamici di imaging nelle cellule viventi.Sebbene questo protocollo descriva i passaggi per la costruzione di un microscopio TIRF-SIM, la configurazione è flessibile e facilmente modificabile per implementare modalità di imaging come 3D-SIM, SIM multifocale e SIM non lineare. Per organizzare e allineare il percorso di eccitazione per un microscopio a illuminazione strutturata, iniziare segnando le posizioni dei componenti sul tavolo ottico come indicato qui. Dopo aver inserito il primo specchio dicroico, DM4, nella torretta del cubo del filtro del telaio del microscopio, inserire il secondo specchio dicroico, DM3, in un supporto per specchio cinematico quadrato da un pollice e posizionarlo a una lunghezza focale di distanza dalla lente del condensatore, L5. Successivamente, per definire con precisione l'accesso ottico per il sistema, rimuovere la lente dell'obiettivo, OB, dalla torretta e avvitare invece uno strumento di allineamento.Quindi, utilizzare lo specchio dicroico DM3 e uno specchio di allineamento temporaneo posizionato nella posizione finale approssimativa dell'SLM per guidare un raggio di riferimento collimato dal laser uno attraverso il centro dei fori nei due dischi di allineamento. Utilizzando tre specchi e lo specchio dicroico DM2 come illustrato qui, dirigere il raggio dal laser uno allo specchio temporaneo. Una volta determinato l'asse ottico grossolano, rimuovere lo strumento di allineamento.Quindi inserire un'iride nel percorso del raggio prima che entri nel corpo del microscopio e centrarlo sul raggio. Attacca un pezzo di cartoncino bianco con un piccolo foro centrato sull'iride, quindi reinserisci la lente dell'obiettivo. Quindi, effettuare regolazioni angolari iterative agli specchi DM3 e alla posizione SLM per centrare la riflessione posteriore sulla scheda con il raggio in entrata.Quindi rimuovere temporaneamente la lente dell'obiettivo e contrassegnare il punto laser sul soffitto per creare una posizione di riferimento. Inserire la lente del tubo, L5, a circa una lunghezza focale di distanza dall'obiettivo, montandola su un tavolino di traslazione lineare impostato per traslare lungo la direzione del raggio di riferimento. Regolare la posizione e l'angolazione della lente del tubo in modo che il raggio in uscita dall'obiettivo venga collimato e colpisca il punto di riferimento sul soffitto.Verificare che la lente sia perpendicolare al fascio controllando nuovamente la riflessione posteriore con il diaframma e il cartoncino bianco. Quindi rimuovere la lente dell'obiettivo e inserire la seconda lente del telescopio a trasmissione immagini, L4. Utilizzare il tavolino di traslazione lineare per regolare la posizione e l'angolo di questa lente per mantenere la collimazione e per garantire che il raggio di riferimento colpisca ancora il punto contrassegnato sul soffitto. Sostituire la lente dell'obiettivo e inserire la prima lente del telescopio, L3. Regolare la posizione e l'angolazione di questa lente per garantire la collimazione e la non deflessione come descritto in precedenza.Dopo aver montato il chip SLM secondo il protocollo di testo, con le lenti allineate, inserire l'SLM al posto dello specchio. Regolare la posizione dell'SLM in modo che il raggio di riferimento si trovi al centro del chip SLM e regolare l'angolo in modo che il raggio passi attraverso le due lenti del relè. Quindi verificare che la trave di riferimento sia ancora centrata sul punto contrassegnato.Montare il rallentatore variabile a cristalli liquidi, o LCVR, con il suo asse veloce a 45 gradi rispetto alla polarizzazione incidente. Quindi, dopo aver completato l'allineamento del rotatore di polarizzazione secondo il protocollo di testo, utilizzando la luce trasmessa attraverso gli oculari, mettere a fuoco un reticolo e fissare la lente dell'obiettivo in questa posizione. Quindi preparare un monostrato di perle fluorescenti stendendo una goccia di perline multicolori da 100 nanometri su un coprioggetto numero 1,5.Lasciare asciugare le perle per adsorbire le perle sul vetro prima di immergerle nuovamente in acqua. Utilizzando l'olio da immersione, posizionare il campione di perline sull'obiettivo. Regolare con precisione la posizione della fotocamera in modo che lo strato di perline fluorescenti sia a fuoco.Dopo aver generato i modelli di reticolo binario della SIM come file bitmap e averli caricati sull'SLM secondo il protocollo di testo, caricare il software di controllo SLM e fare clic su Connetti. Nella scheda Repertorio, fare clic su Caricaper aprire il file del repertorio e controllare il numero di ordini di esecuzione contenuti nel file. Fai clic su Invia alla scheda"per caricare il file del repertorio sull'SLM.Quindi, seleziona la scheda Stato"e inserisci il numero dell'ordine di esecuzione. Fare clic su Seleziona"per modificare l'ordine di marcia in base alla griglia di allineamento. Inserire una maschera spaziale, o SM, montata su uno stadio XY nel percorso del fascio in posizione focale di L3, e traslare la sua posizione rispetto all'asse ottico in modo tale che vengano passati solo i primi ordini desiderati.Subito dopo il filtro spaziale, saranno visibili solo due raggi circolari. Controlla l'immagine dello strato di perline fluorescenti sulla fotocamera. Se i due raggi circolari non si sovrappongono come illustrato qui, riposizionare il piano di campionamento, regolando iterativamente la lente dell'obiettivo e la posizione della telecamera.Dopo aver messo a punto la messa a fuoco e impostato il piano del campione in base al protocollo di testo, confermare l'illuminazione TIRF visualizzando, ad esempio, una soluzione di 10 coloranti micromolari di rodamina 6G mettendo a fuoco il colorante. Se i due raggi sono incidenti con l'angolo TIRF corretto, le singole molecole saranno visibili senza uno sfondo elevato e i bordi dell'apertura circolare saranno a fuoco. Le regolazioni di precisione della posizione dei raggi possono essere effettuate regolando lo specchio dicroico DM3.Per sincronizzare e calibrare il sistema, posizionare il campione monostrato di perline sull'obiettivo e metterlo a fuoco. Utilizzare il software di controllo SLM per programmare l'SLM in modo che visualizzi ciascuna delle tre immagini di sfasamento a turno per il primo orientamento del modello. Quindi passa all'ordine di esecuzione quattro del repertorio di esempio.Nel software di acquisizione, configurare la fotocamera per il periodo di esposizione globale scegliendo "Proprietà avanzate della fotocamera" e impostando il tipo di trigger di uscita 1" su positivo e il tipo di trigger di uscita 2" su negativo. Nel riquadro della sequenza, in Tipo di scansione, selezionare Record disco rigido e impostare il numero di fotogrammi su tre. Quindi fare clic su Avvia"per acquisire tre fotogrammi.Il modello SLM cambierà ad ogni esposizione. Dopo aver calibrato il sistema secondo il protocollo di testo, nel software di controllo SLM, cambiare l'ordine di esecuzione SLM sulla serie completa di nove immagini di reticolo binario necessarie per TIRF-SIM. Si tratta dell'ordine zero di esecuzione nel repertorio di esempio.Dopo aver acquisito nove immagini del campione di perline, nel riquadro della sequenza del software della fotocamera, selezionare Hard Disk Record" come tipo di scansione e modificare il numero di fotogrammi a nove. Quindi fare clic su Avvia"per acquisire le immagini. Infine, in Salva immagini memorizzate nel buffer, scegli TIFF come tipo di immagine e fai clic su OK. Ricostruisci un'immagine a super risoluzione secondo il protocollo di testo.Qui sono state visualizzate perle fluorescenti multicolori di 100 nanometri di diametro per confrontare TIRF standard con TIRF-SIM. Il TIRF-SIM aveva chiaramente una risoluzione laterale significativamente più alta rispetto al TIRF. La risoluzione stimata del microscopio è di 90 nanometri e 120 nanometri per TIRF-SIM a 488 e 640 nanometri, rispettivamente.Ciò corrisponde a un miglioramento di due volte della risoluzione laterale per entrambe le lunghezze d'onda rispetto al caso teorico di diffrazione limitata. Come si vede qui, le fibrille amiloidi marcate in fluorescenza sono state formate in vitro e utilizzate anche come campione di prova per dimostrare la risoluzione raddoppiata. Le strutture subcellulari ad alto contrasto, come i microtubuli marcati con emGFP o LifeAct-GFP, sono ideali per l'imaging TIRF-SIM e producono immagini ad alto contrasto e ad alta risoluzione.L'imaging TIRF-SIM che utilizza la configurazione dimostrata consente l'osservazione di una sottopopolazione di microtubuli situati in prossimità della corteccia cellulare basale e la polimerizzazione e la depolimerizzazione dei microtubuli possono essere osservate nel tempo. I campioni a basso contrasto senza strutture discrete mancano di informazioni ad alta risoluzione, tranne che ai bordi della membrana plasmatica, e sono quindi non ottimali per l'imaging TIRF-SIM. Infine, l'elevato contrasto di modulazione è essenziale per il successo dell'imaging SIM.Come dimostrato qui, la trasformata di Fourier dell'immagine ricostruita consente la visualizzazione della funzione di trasferimento ottico SIM. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa una settimana, se sono state acquisite tutte le parti necessarie. Quando si tenta questa procedura, è necessario essere consapevoli delle questioni più critiche per implementare con successo TIRF-SIM.Innanzitutto, è essenziale un allineamento preciso delle travi. Questo può essere difficile, poiché devono essere posizionati ai bordi dell'apertura dell'obiettivo. In secondo luogo, è fondamentale che lo stato di polarizzazione della luce sia co-ruotato con il modello.Senza questo, il contrasto del modello del campione sarà basso e la successiva costruzione dell'immagine sarà impossibile. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dei passaggi più importanti nella costruzione e nell'allineamento di un microscopio TIRF-SIM basato su SLM. Non dimenticare che lavorare con i laser di Classe 3B può essere estremamente pericoloso.La potenza del laser deve essere mantenuta a livelli di sicurezza per gli occhi durante l'esecuzione del processo di allineamento con l'obiettivo TIRF in posizione.

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