Una guida per Strutturato illuminazione TIRF Microscopia a alta velocità con colori multipli

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di costruire e allineare un microscopio a illuminazione strutturata adatto per l'imaging a super risoluzione di cellule vive ad alta velocità in grado di operare in modalità TIRF e sezionamento ottico con più colori. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare che attualmente non possono essere risolte utilizzando la microscopia TIRF standard a diffrazione limitata. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua rapida risoluzione temporale rispetto ad altre tecniche di microscopia a super risoluzione, che la rendono adatta ai processi dinamici di imaging nelle cellule viventi.

Sebbene questo protocollo descriva i passaggi per la costruzione di un microscopio TIRF-SIM, la configurazione è flessibile e facilmente modificabile per implementare modalità di imaging come 3D-SIM, SIM multifocale e SIM non lineare. Per organizzare e allineare il percorso di eccitazione per un microscopio a illuminazione strutturata, iniziare segnando le posizioni dei componenti sul tavolo ottico come indicato qui. Dopo aver inserito il primo specchio dicroico, DM4, nella torretta del cubo del filtro del telaio del microscopio, inserire il secondo specchio dicroico, DM3, in un supporto per specchio cinematico quadrato da un pollice e posizionarlo a una lunghezza focale di distanza dalla lente del condensatore, L5. Successivamente, per definire con precisione l'accesso ottico per il sistema, rimuovere la lente dell'obiettivo, OB, dalla torretta e avvitare invece uno strumento di allineamento.

Quindi, utilizzare lo specchio dicroico DM3 e uno specchio di allineamento temporaneo posizionato nella posizione finale approssimativa dell'SLM per guidare un raggio di riferimento collimato dal laser uno attraverso il centro dei fori nei due dischi di allineamento. Utilizzando tre specchi e lo specchio dicroico DM2 come illustrato qui, dirigere il raggio dal laser uno allo specchio temporaneo. Una volta determinato l'asse ottico grossolano, rimuovere lo strumento di allineamento.

Quindi inserire un'iride nel percorso del raggio prima che entri nel corpo del microscopio e centrarlo sul raggio. Attacca un pezzo di cartoncino bianco con un piccolo foro centrato sull'iride, quindi reinserisci la lente dell'obiettivo. Quindi, effettuare regolazioni angolari iterative agli specchi DM3 e alla posizione SLM per centrare la riflessione posteriore sulla scheda con il raggio in entrata.

Quindi rimuovere temporaneamente la lente dell'obiettivo e contrassegnare il punto laser sul soffitto per creare una posizione di riferimento. Inserire la lente del tubo, L5, a circa una lunghezza focale di distanza dall'obiettivo, montandola su un tavolino di traslazione lineare impostato per traslare lungo la direzione del raggio di riferimento. Regolare la posizione e l'angolazione della lente del tubo in modo che il raggio in uscita dall'obiettivo venga collimato e colpisca il punto di riferimento sul soffitto.

Verificare che la lente sia perpendicolare al fascio controllando nuovamente la riflessione posteriore con il diaframma e il cartoncino bianco. Quindi rimuovere la lente dell'obiettivo e inserire la seconda lente del telescopio a trasmissione immagini, L4. Utilizzare il tavolino di traslazione lineare per regolare la posizione e l'angolo di questa lente per mantenere la collimazione e per garantire che il raggio di riferimento colpisca ancora il punto contrassegnato sul soffitto. Sostituire la lente dell'obiettivo e inserire la prima lente del telescopio, L3. Regolare la posizione e l'angolazione di questa lente per garantire la collimazione e la non deflessione come descritto in precedenza.

Dopo aver montato il chip SLM secondo il protocollo di testo, con le lenti allineate, inserire l'SLM al posto dello specchio. Regolare la posizione dell'SLM in modo che il raggio di riferimento si trovi al centro del chip SLM e regolare l'angolo in modo che il raggio passi attraverso le due lenti del relè. Quindi verificare che la trave di riferimento sia ancora centrata sul punto contrassegnato.

Montare il rallentatore variabile a cristalli liquidi, o LCVR, con il suo asse veloce a 45 gradi rispetto alla polarizzazione incidente. Quindi, dopo aver completato l'allineamento del rotatore di polarizzazione secondo il protocollo di testo, utilizzando la luce trasmessa attraverso gli oculari, mettere a fuoco un reticolo e fissare la lente dell'obiettivo in questa posizione. Quindi preparare un monostrato di perle fluorescenti stendendo una goccia di perline multicolori da 100 nanometri su un coprioggetto numero 1,5.

Lasciare asciugare le perle per adsorbire le perle sul vetro prima di immergerle nuovamente in acqua. Utilizzando l'olio da immersione, posizionare il campione di perline sull'obiettivo. Regolare con precisione la posizione della fotocamera in modo che lo strato di perline fluorescenti sia a fuoco.

Dopo aver generato i modelli di reticolo binario della SIM come file bitmap e averli caricati sull'SLM secondo il protocollo di testo, caricare il software di controllo SLM e fare clic su Connetti. Nella scheda Repertorio, fare clic su Caricaper aprire il file del repertorio e controllare il numero di ordini di esecuzione contenuti nel file. Fai clic su Invia alla scheda"per caricare il file del repertorio sull'SLM.

Quindi, seleziona la scheda Stato"e inserisci il numero dell'ordine di esecuzione. Fare clic su Seleziona"per modificare l'ordine di marcia in base alla griglia di allineamento. Inserire una maschera spaziale, o SM, montata su uno stadio XY nel percorso del fascio in posizione focale di L3, e traslare la sua posizione rispetto all'asse ottico in modo tale che vengano passati solo i primi ordini desiderati.

Subito dopo il filtro spaziale, saranno visibili solo due raggi circolari. Controlla l'immagine dello strato di perline fluorescenti sulla fotocamera. Se i due raggi circolari non si sovrappongono come illustrato qui, riposizionare il piano di campionamento, regolando iterativamente la lente dell'obiettivo e la posizione della telecamera.

Dopo aver messo a punto la messa a fuoco e impostato il piano del campione in base al protocollo di testo, confermare l'illuminazione TIRF visualizzando, ad esempio, una soluzione di 10 coloranti micromolari di rodamina 6G mettendo a fuoco il colorante. Se i due raggi sono incidenti con l'angolo TIRF corretto, le singole molecole saranno visibili senza uno sfondo elevato e i bordi dell'apertura circolare saranno a fuoco. Le regolazioni di precisione della posizione dei raggi possono essere effettuate regolando lo specchio dicroico DM3.

Per sincronizzare e calibrare il sistema, posizionare il campione monostrato di perline sull'obiettivo e metterlo a fuoco. Utilizzare il software di controllo SLM per programmare l'SLM in modo che visualizzi ciascuna delle tre immagini di sfasamento a turno per il primo orientamento del modello. Quindi passa all'ordine di esecuzione quattro del repertorio di esempio.

Nel software di acquisizione, configurare la fotocamera per il periodo di esposizione globale scegliendo "Proprietà avanzate della fotocamera" e impostando il tipo di trigger di uscita 1" su positivo e il tipo di trigger di uscita 2" su negativo. Nel riquadro della sequenza, in Tipo di scansione, selezionare Record disco rigido e impostare il numero di fotogrammi su tre. Quindi fare clic su Avvia"per acquisire tre fotogrammi.

Il modello SLM cambierà ad ogni esposizione. Dopo aver calibrato il sistema secondo il protocollo di testo, nel software di controllo SLM, cambiare l'ordine di esecuzione SLM sulla serie completa di nove immagini di reticolo binario necessarie per TIRF-SIM. Si tratta dell'ordine zero di esecuzione nel repertorio di esempio.

Dopo aver acquisito nove immagini del campione di perline, nel riquadro della sequenza del software della fotocamera, selezionare Hard Disk Record" come tipo di scansione e modificare il numero di fotogrammi a nove. Quindi fare clic su Avvia"per acquisire le immagini. Infine, in Salva immagini memorizzate nel buffer, scegli TIFF come tipo di immagine e fai clic su OK. Ricostruisci un'immagine a super risoluzione secondo il protocollo di testo.

Qui sono state visualizzate perle fluorescenti multicolori di 100 nanometri di diametro per confrontare TIRF standard con TIRF-SIM. Il TIRF-SIM aveva chiaramente una risoluzione laterale significativamente più alta rispetto al TIRF. La risoluzione stimata del microscopio è di 90 nanometri e 120 nanometri per TIRF-SIM a 488 e 640 nanometri, rispettivamente.

Ciò corrisponde a un miglioramento di due volte della risoluzione laterale per entrambe le lunghezze d'onda rispetto al caso teorico di diffrazione limitata. Come si vede qui, le fibrille amiloidi marcate in fluorescenza sono state formate in vitro e utilizzate anche come campione di prova per dimostrare la risoluzione raddoppiata. Le strutture subcellulari ad alto contrasto, come i microtubuli marcati con emGFP o LifeAct-GFP, sono ideali per l'imaging TIRF-SIM e producono immagini ad alto contrasto e ad alta risoluzione.

L'imaging TIRF-SIM che utilizza la configurazione dimostrata consente l'osservazione di una sottopopolazione di microtubuli situati in prossimità della corteccia cellulare basale e la polimerizzazione e la depolimerizzazione dei microtubuli possono essere osservate nel tempo. I campioni a basso contrasto senza strutture discrete mancano di informazioni ad alta risoluzione, tranne che ai bordi della membrana plasmatica, e sono quindi non ottimali per l'imaging TIRF-SIM. Infine, l'elevato contrasto di modulazione è essenziale per il successo dell'imaging SIM.

Come dimostrato qui, la trasformata di Fourier dell'immagine ricostruita consente la visualizzazione della funzione di trasferimento ottico SIM. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa una settimana, se sono state acquisite tutte le parti necessarie. Quando si tenta questa procedura, è necessario essere consapevoli delle questioni più critiche per implementare con successo TIRF-SIM.

Innanzitutto, è essenziale un allineamento preciso delle travi. Questo può essere difficile, poiché devono essere posizionati ai bordi dell'apertura dell'obiettivo. In secondo luogo, è fondamentale che lo stato di polarizzazione della luce sia co-ruotato con il modello.

Senza questo, il contrasto del modello del campione sarà basso e la successiva costruzione dell'immagine sarà impossibile. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dei passaggi più importanti nella costruzione e nell'allineamento di un microscopio TIRF-SIM basato su SLM. Non dimenticare che lavorare con i laser di Classe 3B può essere estremamente pericoloso.

La potenza del laser deve essere mantenuta a livelli di sicurezza per gli occhi durante l'esecuzione del processo di allineamento con l'obiettivo TIRF in posizione.