Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D In Vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è generare matrici di collagene 3D allineate e casuali, allo scopo di osservare la migrazione cellulare o altri processi cellulari nel contesto di un ambiente 3D. Questo metodo è progettato per catturare le caratteristiche del collagene che troviamo nei tessuti reali, che possono aiutare a rispondere a domande chiave come i meccanismi che le cellule utilizzano per riconoscere una matrice extracellulare allineata o casuale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile manipolare l'organizzazione dell'ambiente 3D, le celle dell'immagine all'interno e si può fare questo in modo economico con le apparecchiature comunemente disponibili.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non mescolano abbastanza bene la soluzione di collagene e il tampone di neutralizzazione e aspirano il collagene attraverso i canali in modo incoerente. A dimostrare questa procedura sarà Brian Burkel, che è uno scienziato senior nel mio laboratorio. Per iniziare, mescola accuratamente il collagene e il tampone HEPES prima di aggiungere cellule e terreni per garantire una corretta neutralizzazione del collagene.

Quindi, aggiungere le cellule e i terreni alla miscela di collagene neutralizzato e posizionarla sul ghiaccio come descritto nel protocollo di testo allegato. Pipettare la miscela ghiacciata in una superficie sterile non trattata con coltura tissutale per ridurre al minimo l'adesione e la crescita delle cellule al di fuori del gel di collagene. Utilizzare una pipetta per distribuire uniformemente la soluzione.

Lasciare polimerizzare il gel a temperatura ambiente per circa 10-15 minuti. Quindi, copri i gel e spostali in un incubatore a 37 gradi Celsius per altri 45-60 minuti per completare la polimerizzazione. Dopo la polimerizzazione, il gel diventerà opaco.

Una volta polimerizzato, aggiungere da due a tre millilitri di terreno. Quindi, rilasciare i gel dai lati del pozzetto facendo scorrere una pipetta da 200 attorno al perimetro del pozzetto. Agitare delicatamente il piatto per rilasciare il gel dalla superficie inferiore.

Al fine di creare PDMS Microcanali per l'allineamento di matrici di collagene. Per prima cosa preparare un master in silicio SuA, utilizzando le tecniche standard di litografia morbida descritte altrove. Quindi, usa un bastoncino artigianale per mescolare accuratamente 20 grammi di base in elastomero con 2 grammi di agente indurente in una tazza usa e getta.

Una volta ben miscelata, degassare la miscela PDMS posizionando il bicchiere usa e getta in una camera a vuoto a una pressione di vuoto di 550 millimetri di mercurio. Degassare la miscela per circa un'ora o un'ora e mezza. Durante il degasaggio del PDMS, preparare il master in silicone posizionando un foglio pulito di pellicola trasparente su una piastra calda seguita dal master in silicone.

Assicurarsi che lo stampo del microcanale sia rivolto verso l'alto. Dopo un'ora o un'ora e mezza, rimuovere il PDMS degassato dalla camera a vuoto. Versare lentamente il PDMS al centro del master e lasciare che la gravità lo distribuisca uniformemente.

Quindi, arrotolare con cura un secondo foglio di pellicola trasparente sopra il master in silicone e il PDMS per evitare bolle d'aria. Posiziona delicatamente un foglio di gomma sopra la trasparenza, seguito da un foglio di acrilico da 1/8 di pollice, quindi aggiungi il primo di tre pesi da dieci libbre sopra il foglio acrilico. Inizialmente, il primo peso galleggerà, lo lascerà assestare e stabilizzarsi prima di procedere con i due dischi rimanenti.

Quando sei pronto per continuare, imposta una piastra calda a 70 gradi Celsius e polimerizza il PDMS per quattro ore. Una volta indurito, lasciare raffreddare il PDMS per almeno un'ora in più, quindi sbucciare con cura la pellicola trasparente superiore per il wafer. Infine, rimuovere i canali con la pinza.

Posiziona i canali capovolti su una nuova pellicola trasparente pulita e pulisci tutte le porte con un movimento circolare con una pinza affilata. Rimuovere eventuali frammenti di PDMS che si staccano. Quindi, posiziona un pezzo di nastro adesivo sul banco, con il lato adesivo rivolto verso l'alto e posiziona il canale PDMS con il lato rivolto verso il basso sopra il nastro.

Premere sui canali con l'estremità arrotondata di un paio di pinze per garantire un buon contatto. Rimuovere i canali e ripetere questo processo su entrambi i lati fino a rimuovere tutti i detriti visibili. Quindi, trasferire i canali PDMS puliti e preparati in una provetta conica da 50 millilitri riempita con etanolo al 70%.

Agitare i canali alla massima velocità per 30 secondi, quindi sostituire la soluzione con etanolo fresco al 70%. Utilizzando tecniche asettiche, trasferire il canale PDMS con il lato rivolto verso l'alto in una capsula pulita e sterile. Quindi, trattare i canali con l'UV fino a quando l'etanolo non è evaporato.

Una volta asciutti, capovolgi i canali su un vetrino coprioggetto o su un piatto con fondo di vetro e premili sul vetro per ottenere una buona tenuta. Aggiungere un cerotto di PDMS sterile per coprire e chiudere la parte centrale dei canali e lasciare asciugare completamente la configurazione prima di procedere. Quindi, posiziona una goccia da 100 microlitri di una soluzione di collagene da 10 microgrammi per millilitro sulla parte superiore di un canale e aspirala attraverso il canale usando un vuoto.

Incubare i canali a 37 gradi Celsius per un'ora e poi trasferire i canali, ancora riempiti con soluzione di rivestimento di collagene, in frigorifero. Raffreddare il set up per circa 15-30 minuti, quindi utilizzare un aspiratore o una pipetta per rimuovere la soluzione di rivestimento del collagene dai canali. Inizia neutralizzando la soluzione di collagene, diluendola con mezzi cellulari e incubandola su ghiaccio per 15 minuti.

Quindi, posizionare da 120 a 150 microlitri della soluzione di collagene nella porta A di un canale pre-raffreddato. Quindi, collegare una pipetta da 25 millilitri a una linea del vuoto e posizionarla sopra la porta C.Usala per aspirare la miscela attraverso un unico movimento uniforme, fermandoti una volta che il collagene raggiunge la fine. Il passaggio più importante per generare matrici casuali è quello di aspirare lentamente il collagene attraverso il canale.

Se viene tirato troppo rapidamente, si verificherà un maggiore allineamento nella parte del canale o in tutto il canale. Rimuovere con cautela la soluzione in eccesso dalle regioni delle porte, quindi posizionare i cerotti PDMS sterili su entrambe le porte, A e C. Dopo due o tre minuti, rimuovere il cerotto PDMS centrale che copre la porta B e aggiungere due o tre micro litri di cellule a una concentrazione da uno a tre milioni di cellule per millilitro nella porta centrale. Lasciare che il gel polimerizzi parzialmente a temperatura ambiente per altri 10-15 minuti, quindi trasferire il contratto in un incubatore a 37 gradi Celsius per altri 15-30 minuti.

Una volta polimerizzato, rimuovere i coperchi delle porte PDMS e aggiungere il supporto per coprire completamente il canale. Qui 50.000 quattro cellule T 1 sono state incorporate in un gel di collagene da 2 mg/ml o 3,5 mg/ml per 5 giorni. La linea a quattro cellule T è una linea di cancro Med Aesthetic altamente contrattile, ma è in grado di contrarre il gel ad alta densità solo di circa il 10%I gel componibili a bassa densità sono contratti del 57% durante lo stesso periodo di tempo.

Il grado di allineamento del collagene è modulato dalla velocità del flusso di collagene in modo tale che una maggiore velocità di flusso del collagene produca un migliore allineamento. L'uso di canali più stretti accoppiato con pressioni di vuoto più elevate migliora l'allineamento della rete di collagene, mentre un canale più ampio utilizzato in combinazione con basse pressioni di vuoto genera matrici casuali. Una volta padroneggiato, il versamento di gel o canali di collagene può essere eseguito in due ore e mezza se eseguito correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di configurare i componenti prima di iniziare. Una volta che inizi a lavorare con il collagene, devi lavorare rapidamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare 3D, per esplorare l'adesione, la migrazione e l'invasione cellulare in ambienti extracellulari tridimensionali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come versare gel di collagene di varie densità e di come generare matrici di collagene sia casuali che allineate.