Name: Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Impara a preparare matrici di collagene 3D allineate e casuali per studiare la migrazione cellulare e le interazioni con la matrice extracellulare. Questo metodo economico consente di manipolare l'organizzazione tridimensionale dell'ambiente.

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Gli autori vorrebbero riconoscere i numeri di sovvenzione UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 e T32-GM008692-18 per finanziare questo lavoro. Riconosciamo anche Jeremy Bredfelt e Yuming Liu di loci per lo sviluppo e l&#39;assistenza con l&#39;analisi CT-FIRE.

1. neutralizzazione, diluizione e la polimerizzazione del collagene soluzioni per il 3D investigazione e cellulari Contrazione saggi <ol><li> Il ghiaccio in cappa coltura tissutale sterili, neutralizzare collagene (1: 1) con una soluzione sterile, ghiacciata 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4, in un tubo da 15 ml. Mescolare accuratamente con pipetta di plastica fino a quando la soluzione è omogenea e turbinii di miscelazione non sono più visibili. Fare attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria durante il processo di miscelazione. Conservare brevemente su ghiaccio. </li><li> Diluire collagene neutralizzato alla concentrazione appropriata con mezzi di cellule (ad esempio RPMI, DMEM, etc.). <ol><li> Per calcolare la quantità di collagene neutralizzato necessaria per compensare concentrazione collagene desiderato, utilizzare l&#39;equazione N = (D * V) / (S / 2), dove N è quantità di collagene neutralizzato richiesto, D è la concentrazione di collagene desiderato, V è il volume finale della concentrazione collagene desiderato e S è tegli concentrazione iniziale magazzino collagene. </li><li> Portare la quantità di collagene neutralizzato a volume con l&#39;aggiunta di una soluzione cellulare e supporti delle cellule. Mescolare accuratamente e memorizzare sul ghiaccio fino al momento di lanciare. <ol><li> Esempio: Per un 2 mg / gel ml in un volume di gel 1 ml (volume tipico per un cast gel in 6 pozzetti o mm vetro 50 piatto inferiore), prima moltiplicare la concentrazione desiderata (2 mg / ml) per il volume finale desiderato (1 ml). Prendete questo numero (2 mg) e dividerlo per la metà della concentrazione di azioni quotate sulla bottiglia (9,49 mg / ml). In questo caso, 0,42 ml di collagene neutralizzato vengono diluiti con 0,58 ml di miscela di / cell media. </li></ol></li></ol></li><li> Dispensare il collagene / miscela ghiacciata cellule / media in entrambi una cultura non-tessuto trattato 6 pozzetti o un bicchiere 50 millimetri piatto fondo. Utilizzare punta della pipetta per diffondere uniformemente la soluzione. NOTA: È importante usare una coltura non-tessuti piastra trattata per minimizzare l&#39;attacco o la crescita delle cellule al di fuori del collagen gel. </li><li> Lasciar polimerizzare a temperatura ambiente per circa 10 - 15 minuti. I gel devono girare opaco su di polimerizzazione. </li><li> Dopo si è trasformato opaca, spostare piatto o un piatto a 37 ° C per ulteriori 45 - 60 minuti per completare la polimerizzazione. </li><li> Dopo 45 - 60 minuti, aggiungere 2 - 3 ml di supporti e rilasciare i gel dalle pareti del pozzo eseguendo una punta p200 pipetta intorno al perimetro del bene o un piatto. piatto Swirl delicatamente per rilasciare il gel. Il gel di collagene deve essere galleggiare in media. </li></ol> 2. Western Blotting, cellulare morfogenesi e Gel Gontractility Assay <ol><li> Per valutare i livelli di proteina, la morfologia o la contrattilità cellulare in relazione alla ECM rigidità, iniziare versando gel di collagene, secondo 1,1-1,6, seminati con cellule di un 7 - saggio di 10 giorni. Determinare ogni tasso di semina linea cellulare empiricamente a seconda del tasso di crescita e confluenza. Per un dosaggio di 10 giorni, la densità di semina può variare da 20.000 - 100.000 cellule / gel. </li><li> Misurarecontrattilità cellulare, misurare il diametro gel utilizzando un righello o una fotocamera ogni 24 ore o l&#39;intervallo di tempo appropriato. Nota: Inoltre, corrispondenti immagini raccolte da un microscopio possono essere esaminati per caratteristiche morfologiche caratteristica della linea di cellule seminate nel gel, come ad esempio strutture acini simili, tubuli epiteliali, sporgenze cellulari e lameliapodia. </li><li> Per valutare i livelli di proteina, la lisi dei gel in RIPA buffer e processo per l&#39;analisi Western Blot di proteine ​​di interesse, come descritto nel Wozniak et al. 17 e Gallagher et al. 18. <ol><li> IMPORTANTE: Nel confronto di contrattilità tra le linee cellulari, normalizzare la contrattilità di DNA totale, che può essere estratto dal gel, come delineato da Lui, et al 19, o per un immutabili, di proteine ​​di pulizia (istoni, GAPDH, etc.) tramite Western. blot, come descritto in Wozniak et al. 17 e Gallagher et al. 18. Se le cellule conteggio all&#39;interno del gel utilizzando un emocitometro, assicurarsi di normalizzare numero di cellulare per un&#39;area totale di gel come il gel amministrazione si concentrerà cellule. </li></ol></li><li> gel feed ogni 3 - 4 giorni per la rimozione di 1 ml di mezzi di comunicazione e la sua sostituzione con 1 ml di mezzi freschi. Assicurati di alimentare gel dopo la misura viene effettuata come l&#39;aggiunta di mezzi freschi / siero causerà un picco di contrattilità. </li></ol> 3. Generazione di PDMS microcanali per il collagene fibra Allineamento Nota: Per generare matrici di collagene allineati, uno stampo per PDMS microcanali (Figura 2A) richiede un maestro SU-8 di silicio realizzato tramite soft-litografia 15. <ol><li> Per rendere i canali PDMS, PDMS mescolare accuratamente in una tazza a gettare con un bastone artigianale. Per un maestro silicone 6 pollici, mescolare 20 g di base di elastomero con 2 g di catalizzatore. </li><li> De-gas miscela PDMS ponendo la tazza monouso in una camera a vuoto ad una pressione di vuoto550 millimetri Hg. De-gas per 1-1,5 ore. </li><li> Mentre de-gassificazione la PDMS, preparare il maestro silicone per versare. Preparare mettendo un foglio di pellicola trasparente su una piastra seguita dal maestro silicone. Assicurarsi che lo stampo microcanali rivolto verso l&#39;alto. NOTA: Durante PDMS casting e stagionatura, il padrone di silicone viene inserito tra due fogli di pellicola trasparente. </li><li> Con 1 - 1,5 ore, rimuovere i PDMS degasificati dalla camera a vuoto, e lentamente versare sopra il master silicone. IMPORTANTE: evitare bolle d&#39;aria. Continuare a versare nel centro di maestro, e consentire la gravità di diffondersi in modo uniforme. NOTA: La caduta di PDMS non deve estendersi fino al bordo della matrice. </li><li> Dopo PDMS è stato versato sul master, applicare un secondo foglio di pellicola trasparente sulla sommità del master silicone e PDMS. Attenzione, rotolare il secondo foglio trasparenza fino in cima master PDMS / silicone per evitare bolle d&#39;aria. Non abbiate fretta. PDMS dovrebbero essere ora equamente distribuite omaestro ver. </li><li> Delicatamente posizionare un foglio di gomma sulla parte superiore della trasparenza, seguito da un &quot;foglio acrilico 1/8. </li><li> Aggiungere tre 10 lb pesi sulla parte superiore del foglio acrilico. Inizialmente, i pesi si &quot;galleggiare&quot;. Consentire loro di stabilirsi e stabilizzare prima di procedere ulteriormente. </li><li> Impostare la temperatura di cottura a 70 C e cura PDMS per 4 ore. Lasciare raffreddare per almeno 1 ora aggiuntiva prima di disturbare. </li><li> sbucciare accuratamente cima foglio di pellicola trasparente dal wafer, e rimuovere i canali con una pinza. </li><li> Conservare in piatto privo di polvere fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 4. preparando PDMS microcanali per l&#39;uso <ol><li> Posizionare i canali a testa in giù sul nuovo, lucidi pulito. Pulire tutte le porte (Figura 2b) con movimento circolare con una pinza taglienti. Rimuovere eventuali frammenti di PDMS. </li><li> canali Clean con un pezzo di nastro adesivo come un panno dell&#39;aderenza. Applicare nastro adesivo sulla superficie del banco (lato adesivo verso l&#39;alto), e quindi impostare il canale on top. Premere verso il basso i canali con estremità rotonda di pinze per assicurare un buon contatto. Rimuovere e ripetere su entrambi i lati fino a quando i detriti visibile viene rimosso. </li><li> Trasferimento puliti, preparata canali PDMS in una conica da 50 ml con il 70% EtOH. Vortex alla massima velocità per 30 sec. Scartare EtOH e sostituirlo con fresco il 70% EtOH. Conservare in 70% EtOH fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Nel cofano coltura tissutale e l&#39;utilizzo di tecniche asettiche, trasferire i canali PDMS ad un vetro di copertura pulito e sterile o vetro piatti inferiori. Mettere il canale laterale e raggi UV trattare fino EtOH è evaporata. </li><li> Una volta asciutto, capovolgere le PDMS in modo che i canali sono rivolti verso il basso verso coprioggetti. Premere il canale PDMS verso il basso sul vetro per fare una buona tenuta. Aggiungere un pezzo di PDMS sterili per coprire / chiudere la porta centrale (porta B, Figura 2b). Lasciare asciugare bene prima di procedere. </li><li> Pre-rivestire l&#39;interno del canale con 10 ug collagene / ml in acqua sterile. Per coat, posizionare una gocciolina 100 microlitri sulla sommità di un channEL, e disegnare attraverso con il vuoto. Dopo 1 ora a 37 ° C, i canali di trasferimento riempito con soluzione di rivestimento collagene ad un frigorifero. Mettere in frigorifero per circa il 15 - 30 min. </li><li> Rimuovere soluzione di rivestimento di collagene con aspiratore o pipetta, e iniziare la preparazione del collagene. </li></ol> 5. Il collagene Preparativi per l&#39;uso in microcanali <ol><li> Il ghiaccio, neutralizzare collagene (1: 1) con ghiacciata 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4. Mescolare accuratamente fino omogeneo (Per maggiori dettagli, vedere la sezione 1.1). </li><li> Diluire collagene neutralizzato alle concentrazioni appropriate con i media cella (Per maggiori dettagli, vedere la sezione 1.2). Incubare per 15 minuti in ghiaccio. </li><li> Allo stesso tempo, chill canali su ghiaccio montato. NOTA: L&#39;obiettivo è quello di avere tutti i componenti per il processo di canale a 4 ° C o al di sotto. Collagene temperatura e tempo nucleazione sono parametri fondamentali per il processo di polimerizzazione, e può essere il punto di partenza per ulteriore ottimizzazione, se necessario. </li><li> CounLe cellule T con un emocitometro e risospendere alla densità di semina appropriata in questo momento. Per facilità di calcoli, risospendere a 1 - 3 milioni di cellule / ml. (Per maggiori dettagli, vedere anche paragrafo 2.1). </li><li> Una volta che le cellule sono state contate e 15 minuti sono passati, procedere al collagene versare. </li></ol> 6. Versare allineati e casuale collagene microcanali <ol><li> Prima di trarre il collagene attraverso i canali, regolare e impostare la pressione di vuoto con un regolatore di vuoto in linea. pressione di vuoto fornisce la forza di indurre e controllare la velocità del flusso di collagene, che determina il grado di allineamento. <ol><li> Per matrici casuali o non allineati, utilizzare un ampio canale (3mm di larghezza x 200 micron di altezza) con una pressione di vuoto di 10 mm Hg o meno. </li><li> Per matrici allineate, usare il canale stretto (1 mm di larghezza x 200 micron di altezza) con una pressione di vuoto di 60 mm Hg o superiore. </li></ol></li><li> Rimuovere canale montato da ghiaccio e posto sulla superficie pulita, sterilizzata di flusso laminare hOOD. </li><li> Lavorare velocemente e caricare 120 - 150 ml di collagene neutralizzato nella porta A (Figura 2b). </li><li> Disegnare collagene attraverso il canale posizionando una pipetta 25 ml collegata alla linea del vuoto sulla porta c (Figura 2b). Disegnare il collagene attraverso in un unico, moto uniforme. IMPORTANTE: Per le matrici casuali o non allineati, disegnare lentamente collagene attraverso canale (circa 0,5-1 mm al secondo), e fermare una volta raggiunta la fine. Per matrici allineate, disegnare il collagene attraverso più rapidamente, ma fare attenzione ad evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di collagene dalla regione porto con Pipetman P200 o aspiratore. </li><li> Posizionare patch PDMS sterili su entrambe le porte A e C. Tutte le porte dovrebbero ora essere coperti. </li><li> Dopo 2 - 3 minuti, togliere il centro delle patch PDMS (porta B) e aggiungere 2 - 3 ml di cellule (5 - 10 mila cellule) nella porta centrale. Lasciare polimerizzare parzialmente (girare opaco) a temperatura ambiente per altri 10 - 15 min. </li><li> dopo 10- 15 min, il trasferimento a 37 ° C per altri 15 - 30 minuti per completare la polimerizzazione. Rimuovere i coperchi PDMS e aggiungere supporti per coprire completamente le cellule del canale e della cultura in base alle esigenze. Le cellule possono essere alimentati rimuovendo un ml di vecchi media, e la sua sostituzione con un ml di nuovi media. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare

gel di collagene 3D sono una preziosa aggiunta alla nostra cassetta degli attrezzi per capire come le cellule interpretano e rispondere alla loro microambiente locale. Questo manoscritto ha fornito un protocollo molto semplice per l&#39;incorporamento celle all&#39;interno di una matrice di collagene 3D, e generare riproducibile matrici con fibre collagene casuali o allineate. Entrambi i protocolli funzionano come piattaforme adattabili dove potrebbero potenzialmente essere aggiunte diverse isoforme collagene, reticolan...

Molti processi cellulari sono stati ampiamente studiati in 2 dimensioni, formando così una conoscenza collettiva dei meccanismi di segnalazione cellulare di base. Questi studi, tuttavia, trascurano importanti segnali cellulari ricevuti dalle proprietà strutturali e meccaniche del microambiente cellulare locale e della matrice extracellulare (ECM). Per comprendere meglio come le cellule interagiscono in un contesto fisiologico, è importante studiarle in saggi tridimensionali (3D). L'ECM per questi saggi 3D può essere derivata da cellule o ricostituita da proteine purificate. Indipendentemente dalla fonte della MEC, i saggi di matrice 3D si sono dimostrati preziosi per comprendere come le cellule navigano e interagiscono all'interno del mondo fisiologico. Ad esempio, le cellule cresciute in matrici 3D mostrano modalità di locomozione distinte che dipendono dalla natura meccanica della ECM circostante che non sono osservate negli esperimenti 2D4-6. Inoltre, le cellule coltivate in 3D hanno anche meno fibre di stress e aderenze focali meno pronunciate rispetto alle loro controparti coltivate su superfici dure come vetro o plastica7. 
Tuttavia, l'importanza dei saggi 3D contestuali non si limita alla migrazione cellulare. Alcuni altri eventi di segnalazione cellulare possono essere studiati solo attraverso l'uso di saggi 3D. Durante la differenziazione tissutale e cellulare, la rigidità dell'ambiente extracellulare e della ECM fornisce segnali che possono influenzare gli eventi morfogenici. Ad esempio, la tubulogenesi epiteliale mammaria si verifica solo in matrici 3D a bassa rigidità, ma non in matrici rigide né su substrati 2D8,9. Quando coltivate all'interno di matrici 3D rigide, queste stesse cellule epiteliali assumono un fenotipo aberrante con aumento della proliferazione e sporgenze della membrana cellulare guidate da segnali FAK e ERK alterati10. È noto che molte altre vie di segnalazione e processi cellulari sono influenzati in modo simile dalla rigidità dell'ambiente cellulare locale, e queste cascate di segnalazione evidenziano l'importanza di studiare gli eventi di segnalazione e il fenotipo cellulare nel contesto delle appropriate proprietà meccaniche locali di una ECM 3D. 
Il collagene I è una proteina particolarmente rilevante da utilizzare per gli studi in vitro in quanto è il componente più abbondante della MEC ed è responsabile di molte delle proprietà meccaniche del microambiente cellulare. Mentre originariamente si pensava che fosse solo una proteina strutturale, il suo ruolo è ora noto per essere molto più complesso. La composizione, l'architettura, l'orientamento, la densità e la rigidità delle fibre di collagene forniscono un ambiente concentrato di informazioni di segnalazione5. Durante la progressione di alcune malattie, come l'infiammazione cronica e la tumorigenesi, la rete di collagene viene drasticamente rimodellata2,11. Più specificamente, nei tumori al seno, l'aumento della deposizione di collagene e la rigidità dei tessuti accompagnano e probabilmente contribuiscono alla progressione del tumore. In questi tumori precoci, la rete di collagene irrigidita appare tesa e più allineata, in modo tale che la maggior parte delle fibre incapsula il tumorein crescita 2. Man mano che il tumore progredisce, il collagene continua a riorganizzarsi e le regioni della rete fibrillare si orientano perpendicolarmente al confine del tumore2,12. L'allineamento perpendicolare funge da biomarcatore prognostico in cui questi pazienti hanno una progressione libera da malattia euna sopravvivenza globale 1 più scarse. Una spiegazione di questa correlazione è che gli scarsi risultati sono una conseguenza dell'aumento della disseminazione delle cellule tumorali attraverso la migrazione cellulare persistente nelle reti di collagene allineate3. 
Per capire come le cellule rispondono specificamente all'allineamento e all'organizzazione che si osserva nella progressione tumorale, è necessario generare matrici di collagene 3D sia casuali che allineate per la sperimentazione. Esistono tre metodologie di base per indurre l'allineamento all'interno delle reti fibrillari. La prima tecnica utilizza un dispositivo che induce la tensione in cui il collagene tra due punti viene contratto o allungato per generare l'allineamento. Le fibre parallele all'asse di forza vengono tese mentre le fibre perpendicolari all'asse vengono compresse e deformate. Mentre le tecniche indotte dalla deformazione offrono in genere un eccellente allineamento, questo approccio richiede apparecchiature ingombranti che non sono facilmente adattabili a molte piattaforme3,13. In alternativa, il ceppo indotto dalle cellule può essere creato posizionando tappi localizzati di cellule che successivamente si contraggono e allineano il collagene13. Questo metodo ha il problema di essere variabile, in quanto molti parametri possono essere soggetti a modifiche. Il secondo metodo utilizza perle magnetiche e un campo magnetico durante la polimerizzazione per indurre l'allineamento del collagene13,14. Buoni risultati possono essere ottenuti da questo metodo con apparecchiature non sofisticate, ma richiede l'uso di anticorpi o qualche altro metodo per magnetizzare il polimero. Pertanto, può essere un po' costoso da usare e la rigidità del gel di collagene è potenzialmente modificata dall'aumento delle connessioni nella rete. Inoltre, le microsfere magnetiche utilizzate in questo processo sono spesso autofluorescenti, il che è problematico per gli esperimenti di imaging. Infine, l'allineamento può essere generato dai canali microfluidici PDMS3,15,16. In questo metodo, l'allineamento del collagene si ottiene facendo fluire il collagene polimerizzando attraverso piccoli canali microfluidici. Questi canali microfluidici possono essere realizzati in una moltitudine di design e sono facilmente adattabili a molte piattaforme. Inoltre, sono molto economici in quanto vengono utilizzate quantità molto piccole di collagene e altri reagenti a causa delle loro dimensioni ridotte.
Fornito qui è un semplice protocollo per incorporare le cellule all'interno di un idrogel di collagene fibrillare tridimensionale. Inoltre, viene fornita anche una tecnica più avanzata, in cui vengono utilizzati canali microfluidici PDMS per controllare l'organizzazione e l'allineamento della matrice di collagene. Questo protocollo è facilmente adattabile a molte piattaforme e può generare in modo riproducibile matrici di collagene allineate e casuali per lo studio della migrazione cellulare, della divisione cellulare e di altri processi cellulari in un microambiente fisiologico tridimensionale.

<table><tbody><tr>Kit di elastomeri <td>Corning</td><td>354249</td><td></td>di <td>collagene ad alta concentrazione per coda di ratto</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Elastomero per</td><td>NC9285739</td><td>per canali PDMS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FISHER</td><td>BP310</td><td>per tampone di neutralizzazione HEPES</td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>Per tampone di neutralizzazione HEPES</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td>Per tampone di neutralizzazione HEPES</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S374</td><td>Per tampone di neutralizzazione HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Per tampone di neutralizzazione HEPES</td></tr><tr><td>Levy Emocitometro Neubauer migliorato</td><td>Fisher</td><td>15170-208</td><td>Conta cellulare</td></tr><tr><td>Piastra di coltura non tissutale a 6 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro da 50 mm</td><td>MatTek</td><td>P50g-1.5-30-f</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Essiccatore sottovuoto in plastica</td><td>Bel-Art</td><td>F4200-2021</td><td>Camera di degasaggio per</td></tr><tr><td>film trasparente PDMS&nbsp;</td><td>3M</td><td>pp2950</td><td>Film plastico per colata canali pdms</td></tr><tr><td>ThermoScientific CimaRec</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>HP141925</td><td>Piastra riscaldante per l'indurimento di microcanali PDMS</td></tr><tr><td>Regolatore di vuoto</td><td>Precision Medical</td><td>PM3100</td><td>Regolatore di vuoto per microcanali di collagene</td></tr><tr><td>Foglio di gomma da 8" x 8"</td><td>Amazon - Rubber-Cal</td><td>Silicone - Foglio di gomma 60A</td><td>per versare microcanali PDMS</td></tr><tr><td>Foglio acrilico da 8" x 8" x 0,125"</td><td>Amazon</td><td>Fogli di plexiglass</td><td>per il versamento di microcanali PDMS</td></tr><tr><td>Pesi da 10 libbre Bilanciere</td><td>Amazon</td><td>CAP</td><td>per microcanali PDMS</td></tr> da <tr><td>15 ml Tubi conici</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici da 50 ml</td><td>Fisher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in plastica</td><td>Dot Scientific</td><td>229202B, 229206B e 667225B</td><td>2&nbsp; ml, 5&nbsp; ml, e 25&nbsp; ml</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Fisher</td><td>NC9663244</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione del 3d collagene gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3d<em&gt; in vivo</em

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Storicamente, la maggior parte dei processi cellulari sono stati studiati in sole 2 dimensioni. Sebbene questi studi siano stati informativi sui meccanismi generali di segnalazione cellulare, trascurano importanti segnali cellulari ricevuti dalle proprietà strutturali e meccaniche del microambiente locale e della matrice extracellulare (ECM). Per capire come le cellule interagiscono all'interno di una ECM fisiologica, è importante studiarle nel contesto di saggi tridimensionali. La migrazione cellulare, la differenziazione cellulare e la proliferazione cellulare sono solo alcuni dei processi che hanno dimostrato di essere influenzati da cambiamenti locali nelle proprietà meccaniche di una ECM tridimensionale. Il collagene I, un componente fibrillare centrale della MEC, è più di un semplice elemento strutturale di un tessuto. In condizioni normali, i segnali meccanici della rete di collagene dirigono la morfogenesi e mantengono le strutture cellulari. Nei microambienti malati, come il microambiente tumorale, la rete di collagene viene spesso drasticamente rimodellata, dimostrando una composizione alterata, una maggiore deposizione e un'organizzazione delle fibre alterata. Nel carcinoma mammario, il grado di allineamento delle fibre è importante, poiché un aumento delle fibre allineate perpendicolarmente al confine del tumore è stato correlato a una prognosi peggiore del paziente1. Le matrici di collagene allineate determinano un aumento della disseminazione delle cellule tumorali attraverso la migrazione persistente2,3. Quello che segue è un semplice protocollo per incorporare le cellule all'interno di un idrogel di collagene fibrillare tridimensionale. Questo protocollo è facilmente adattabile a molte piattaforme e può generare in modo riproducibile matrici di collagene allineate e casuali per lo studio della migrazione cellulare, della divisione cellulare e di altri processi cellulari in un microambiente fisiologico tridimensionale, sintonizzabile.

Mentre saggi 3D possono essere eseguite nella stessa rigidità del gel di collagene, variando la rigidità gel può essere usato per determinare come le cellule rispondono a modifiche meccaniche nel loro microambiente cellulare. Un idrogel collagene rigido è definito come un gel in cui le cellule incorporate potuto localmente contrarre il collagene circostante. La contrattilità intrinseca di tipi cellulari è unico, e quindi è meglio iniziare con una curva contrattilità semplice per stabilir...

Il collagene è una componente fondamentale della ECM, e fornisce spunti essenziali per molti processi cellulari che vanno dalla migrazione verso la differenziazione e la proliferazione. Qui fornito è un protocollo per l&#39;incorporamento celle all&#39;interno di idrogel di collagene 3D, e una tecnica più avanzata per la generazione di matrici di collagene randomizzati o allineati con microcanali PDMS.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare matrici tridimensionali di collagene allineate e casuali, al fine di osservare la migrazione cellulare o altri processi cellulari nel contesto di un ambiente tridimensionale. Questo metodo è stato progettato per riprodurre caratteristiche del collagene presenti nei tessuti reali, il che può aiutare a rispondere a domande fondamentali, come i meccanismi che le cellule utilizzano per riconoscere una matrice extracellulare allineata o casuale. Il vantaggio principale di questa tecnica è la possibilità di manipolare l'organizzazione dell'ambiente tridimensionale, di acquisire immagini delle cellule al suo interno e di farlo in modo economico, utilizzando attrezzature comunemente disponibili.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontrano difficoltà perché non mescolano adeguatamente la soluzione di collagene e il buffer di neutralizzazione, e perché prelevano il collagene attraverso i canali in modo non uniforme. A dimostrare questa procedura sarà Brian Burkel, ricercatore senior del mio laboratorio. Per iniziare, mescolare accuratamente il collagene e il buffer HEPES prima di aggiungere le cellule e il terreno,

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Fabbricazione di micro-tessuti utilizzando i moduli di Collagene Gel cellule contenenti

Questo articolo presenta un metodo per etichettare fluorescently collagene che può essere ulteriormente utilizzato sia per correzione e di imaging vivo di colture cellulari 3D. Forniamo anche un protocollo ottimizzato per visualizzare endogene proteine ​​del citoscheletro delle cellule coltivate in ambienti 3D.

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Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

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Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

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Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura di cellule IDG-SW3 in una matrice extracellulare tridimensionale (3D).

Colture cellulari IDG-SW3 in una matrice extracellulare tridimensionale

Impara a preparare matrici di collagene 3D allineate e casuali per studiare la migrazione cellulare e le interazioni con la matrice extracellulare. Questo metodo economico consente di manipolare l'organizzazione tridimensionale dell'ambiente.

Preparazione del 3D collagene Gel e microcanali per lo studio delle interazioni 3D

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