Name: siRNA Transfection e lEMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Scopri la transfezione siRNA mediante microporazione e l'analisi EMSA su citotrofoblasti villosi umani isolati. Questo metodo efficiente permette di studiare le interazioni DNA-proteina nella ricerca sulla placenta.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Scienze e della Ricerca Ingegneria Consiglio Nazionale del Canada (NSERC) (# 298.527) (BB). CT è stato sostenuto da una borsa di studio FARE istituzionale. AV è stato sostenuto da un Ph.D. NSERC Graham Bell Borsa di studio. BB ha tenuto un Canada Research Chair in Retrovirology umana (Livello 2). Grazie a Beatrix Beisner per un aiuto nella revisione del testo.

Il comitato etico ha approvato UQAM questi protocolli, che sono in accordo con le linee guida del comitato etico di St-Luc Ospedale del Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montréal, Canada). I partecipanti hanno firmato un modulo di consenso informato. 1. Preparazione medio e isolamento delle primarie dei villi citotrofoblasti <ol><li> Preparare terreno di coltura per citotrofoblasti villi primari umani, completandolo Modified Media Dulbecco di Eagle (DMEM) con 25 mM HEPES, 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Filtrare il mezzo preparato attraverso sterile filtro 0,22 micron e conservare in un freezer a -20 ° C in aliquote di 50 ml. </li><li> Isolare citotrofoblasti villi primari da placente freschi seguenti protocolli standard 3. <ol><li> Utilizzando pinze, rimuovere la membrana fetale dal tessuto da graffi delicatamente fuori, facendo attenzione a non rimuovere il tessuto dei villi. Taglia ilrimanendo villi della placenta in cubetti di circa 3 x 3 cm utilizzando bisturi e le forbici. Lavare accuratamente con acqua contenente 0,9% di NaCl per rimuovere sangue materno. <ol><li> Tenendo ogni cubo con le pinze, rimuovere con attenzione il tessuto dei villi da rimanenti navi e forbici tessuti utilizzando fibrose. </li><li> Da 15 a 30 mg di tessuto dei villi, digerire quattro volte in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente tripsina (da 9,6 x 10 5 1,8 x 10 6 U; concentrazione finale 1,2 mg / ml) e deossiribonucleasi I (DNasi I) ( concentrazione finale 200 ug / ml) per 30 min a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua con agitazione continua. Nota: Utilizzare 150 ml di volume totale per la prima digestione, 100 ml per il secondo digestione e 75 ml per i due digestioni rimanenti. </li></ol></li><li> Raccogliere il surnatante contenente cellule disperse e centrifugare a 1250 xg per 15 minuti senza freno. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di DMEM contenente preriscaldata1% di penicillina / streptomicina. </li><li> Strato le cellule disperse sulla cima di una discontinua 5% - pendenza 70% polivinilpirrolidone rivestite di silice (vedi Tabella 1 per la preparazione gradiente) e centrifugare per 23 min a 507 xg senza freno. Rimuovere lo strato di densità tra 1.017 al 1.033 per aspirazione e raccogliere gli strati tra il 40% e il 50% in gradiente con una nuova pipetta. Lavare le cellule estensivamente con 10 ml di preriscaldata DMEM contenente 1% di penicillina / streptomicina. Nota: La frazione raccolta corrisponde alla densità tra i 1.048 e 1.062, che ospita trofoblasto. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. In breve, le cellule mescolare e aggiungere 10 ml in una nuova provetta. Aggiungere 10 ml di trypan blu e mescolare delicatamente di nuovo. Stilare la sospensione cellulare e riempire le camere emocitometro. Contare le cellule sotto obiettivo 10X. </li><li> Mettere 1 x 10 6 e 4,5 x 10 6 cellule in tubi separati per l&#39;impiego nelle sezioni 1.3 e 2, rispettivamentely. Seme le cellule rimanenti ad una densità di 1,5 x 10 6 cellule / pozzetto in terreno DMEM e cultura a 37 ° C e 5% CO 2 per un massimo di 4 giorni per altri esperimenti. </li></ol></li><li> Valutazione della purezza dei isolate citotrofoblasti villi primarie <ol><li> Spin 1 x 10 6 delle citotrofoblasti appena isolate in tubi microcentrifuga a 300 x g. Eliminare il surnatante e aggiungere 1 ml di preriscaldata PBS (PBS). cellule centrifugare a 300 xg e rimuovere PBS mediante aspirazione. </li><li> Aggiungere 1 ml di metanolo freddo per cellule e incubare a -20 ° C per 20 min. cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti e rimuovere il metanolo per aspirazione. Attenzione: Utilizzare maschera scatola metallica, occhiali protettivi e guanti di gomma durante la manipolazione metanolo. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS a temperatura ambiente per reidratare cellule, centrifugare a 300 xg e rimuovere PBS per aspirazione. </li><li> Incubare le cellule in PBS contenente FBS (1:50 [v / v] diluizione) e un FcRreagente bloccante (1,10) per 45 min a temperatura ambiente per eliminare legami non specifici. </li><li> Lavare due volte con 500 microlitri di PBS temperatura ambiente, cellule centrifugare a 300 xg per 5 min e rimuovere PBS per aspirazione. Risospendere le cellule in 100 microlitri temperatura ambiente PBS. </li><li> Incubare le cellule con un isotiocianato monoclonale di topo fluoresceina (FITC) coniugata LP5K antiumano citocheratina-7 anticorpi clone (1: 200) o un anticorpo di controllo isotipo-matched non specifico in PBS contenente 0,2% BSA per 45 min a temperatura ambiente in il buio. Lavare le cellule in PBS. </li><li> Analizzare le cellule mediante citometria di flusso 3. Utilizzare preparazioni cellulari, che dimostrano un minimo del 96% di cellule CK-7-positivi mediante citometria di flusso per ulteriori esperimenti. </li></ol></li></ol> 2. siRNA Transfection di primari umani dei villi citotrofoblasti <ol><li> Transfection di umani citotrofoblasti villi principale utilizzando un dispositivo microperforazione <ol><li> Preparare 6 pozzetti contenenti2 ml di terreno DMEM per l&#39;incubazione di cellule microporated. </li><li> Dopo l&#39;isolamento di citotrofoblasti primari (vedi paragrafo 1.2), prendere una aliquota di cellule in sospensione e determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Trasferire 1,5 x 10 6 cellule in una provetta e le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule con 1 ml di PBS Dulbecco (DPBS) (Mg 2+, Ca 2+ -free) e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule delicatamente in 100 ml di buffer di risospensione. Nota: Evitare di tenere sospensione cellulare per più di 15-30 min a temperatura ambiente, per massimizzare la vitalità cellulare e l&#39;efficienza di trasfezione. </li><li> Aggiungere 300 ng di sincitina-2 siRNA (o di controllo-scrambled siRNA) al tubo di 1,5 ml microcentrifuga e aspirare la miscela di cellule-siRNA utilizzando un 100 ul trasfezione pipetta. Inserirela pipetta nella stazione (vedi elenco dei materiali) e fatte salve le cellule ad una 1300 V singolo impulso di 30 msec. </li><li> trasferire immediatamente le cellule a 6 pozzetti (previste al punto 2.1.1) contenenti terreno integrato 37 ° C pre-riscaldato per evitare danni alle cellule. </li><li> Ripetere i punti 2.1.5 e 2.1.6 per i restanti campioni. </li><li> oscillare delicatamente la piastra per 30 secondi per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare la piastra a 37 ° C in un umidificata CO 2 incubatore per 24 a 48 ore. Aggiornare terreno di coltura 24 ore dopo la trasfezione. </li><li> Valutare l&#39;efficienza di trasfezione da analisi Western Blot (vedere i passi da 3 a 6). </li></ol></li><li> Lipofezione di siRNA in citotrofoblasti primari umani <ol><li> Dopo l&#39;isolamento di cytotrophoblasts villi, seme le cellule ad una densità di 1,5 x 10 6 cellule per pozzetto in piastre da 6 pozzetti in 2 ml di terreno di coltura e incubare per 18 ore. </li><li> Diluire 300 ng di sincitina-2-specifici siRNA (o di controllo-strapazzatesiRNA) e 5 ml di base lipidica reagente di trasfezione in distinte provette 1,5 ml in un volume totale di 10 ml di mezzo agli antibiotici e privo di siero. Incubare per 5 min. </li><li> Mescolare i reagenti diluiti e incubare per altri 20 minuti a temperatura ambiente per formare il complesso trasfezione. Aggiungere 90 ml di mezzo agli antibiotici e privo di siero alla miscela per un volume finale di 100 microlitri. </li><li> Togliere terreno di coltura dalle 6 pozzetti (passo 2.2.1). Aggiungere 2 ml di mezzo fresco e la trasfezione mix 100 ml ad ogni pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 24 a 48 ore. Aggiornare terreno di coltura 24 ore dopo la trasfezione. </li><li> Valutare l&#39;efficienza di trasfezione da analisi Western Blot (vedere i passi da 3 a 6). </li></ol></li></ol> 3. Preparazione di lisati da tutta la cultura cellulare <ol><li> Rimuovere il supporto e lavare ogni pozzetto (dai passi 2.1.8 e 2.2.4) utilizzando DPBS pre-riscaldato (Mg 2+, Ca 2+ gratuito). Aspirare il DPBS e aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare per 1-3 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2. Interrompere il trattamento tripsina con l&#39;aggiunta di 500 ml di siero contenente terreni di crescita. Nota: utilizzare il volume supporto appropriato in base al tipo di pallone / piatto: 1 ml per 10 7 cellule / 100 mm piatto / 150 cm 2 fiasco; 0,5 ml per 5 x 10 6 cellule / 60 millimetri piatto / 75 cm 2 pallone. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule con DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -free) e le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. Posizionare la provetta in ghiaccio. Risospendere il pellet in 50-200 ml di buffer ghiacciata Radio-Saggio di immunoprecipitazione (RIPA) (vedi Tabella 2 per la composizione del buffer) contenente appena aggiungereEd proteasi e gli inibitori della fosfatasi ad una concentrazione finale 1x. Brevemente, agitare la provetta e lasciare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Spin a 16.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. posizionare con cura il tubo in ghiaccio. Usando una pipetta, trasferire il surnatante in una provetta fresco pre-raffreddata tenuti in ghiaccio. Eliminare il pellet. </li></ol> 4. Preparazione di estratti nucleari da cellule in coltura <ol><li> Per ogni (fase 1.2.5) bene, lavare citotrofoblasti coltivate due volte con 1 ml di pre-riscaldato DPBS (Mg 2+, Ca 2+ gratuito). Aspirare DPBS e aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina / EDTA. Incubare per 1-3 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2 e interrompere il trattamento tripsina aggiungendo 500 ml di siero contenente mezzi di crescita. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, le cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule con DPBS (Mg 2+, Ca 2+-free) e le cellule pellet per centrifugazionea 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione tutto il surnatante senza disturbare il pellet e posizionare il tubo in ghiaccio. </li><li> Estrarre proteina nucleare in base alle istruzioni del produttore. Determinare la concentrazione di proteine ​​di ogni campione utilizzando test della proteina quantificazione (Bradford e il dosaggio dell&#39;acido bicinconinico (BCA)). </li></ol> 5. Preparazione del campione e elettroforesi <ol><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​per ogni estratto cellulare utilizzando un saggio proteico quantificazione (ad esempio, Bradford 8 o 9 BCA). </li><li> Come da istruzioni del produttore (se anticorpi potrebbero essere utilizzati in condizioni di riduzione e denaturazione), aggiungere un volume equivalente di 2x Laemmli Sample Buffer (Tabella 2) per 20-30 mg di proteine ​​totali. </li><li> lisati cellulari bollire a 100 ° C per 5 min. Aliquota 50-100 ml di lisato di evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento e memorizzare i tubi rimanenti a -20 ° C per un uso futuro. </li&gt; <li> Mentre i campioni sono il riscaldamento, preparare 1 L di 1x tampone di corsa (Tabella 2). </li><li> Spin i campioni a 16.000 xg per pochi secondi e disporli sul ghiaccio. </li><li> Caricare uguale quantità di proteina in ciascun pozzetto di un gel SDS-PAGE 12% (vedi Tabella 2 per la composizione gel), insieme ad un marcatore di peso molecolare. Eseguire il gel per 1 a 2 ore a 100 V. </li></ol> 6. Trasferimento del Protein dal gel alla membrana <ol><li> Attiva polivinilidenfluoruro membrana (PVDF) con metanolo per 1 min e risciacquare con trasferimento 1x soluzione tampone / 10% metanolo. Secondo le istruzioni del produttore, trasferire per 30 minuti a 1 ora a seconda delle dimensioni della proteina. Nota: l&#39;efficienza di trasferimento può essere valutata utilizzando Ponceau Red colorazione prima della fase di bloccaggio. </li></ol> 7. colorazione degli anticorpi <ol><li> Bloccare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C con la soluzione di bloccaggio 5%. </li><li> Incubare la membrana con sincitina-2 anti-anticorpi (4 mg / ml; 1: 5.000) 6 o anti-gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 0,4 mg / ml; 1: 500) in soluzione di saturazione 5% notte a 4 ° C (anti-sincitina-2) o per 45 min a temperatura ambiente. Lavare la membrana tre volte in soluzione salina tamponata con Tris Tween (TBST; vedi Tabella 2 per la composizione buffer) per 5 min. </li><li> Incubare la membrana con appropriata perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-coniglio o anticorpi anti-topo (1: 10.000) in 5% in tampone di bloccaggio TBST a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la membrana tre volte in TBST per 5 minuti e poi risciacquare in TBS. Rilevare segnali mediante il substrato blotting chemiluminescenza-based. </li></ol> 8. radiomarcatura di oligonucleotidi a singolo filamento <ol><li> reazione di fosforilazione <ol><li> In una provetta, aggiungere 50 ng di un oligonucleotide avanti con 1x tampone T4 polinucleotide chinasi, 1 UT4 polinucleotide chinasi e 20 pCi (γ- 32 P) ATP e portare il volume di reazione di 20 microlitri di acqua priva di nucleasi. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30 min. Arrestare la reazione aggiungendo 5 ml di 0,5 M EDTA. Portare al volume di 50 ml con acqua priva di nucleasi. </li></ol></li><li> La rimozione dei nucleotidi prive di personalità giuridica da oligonucleotidi <ol><li> Preparare una colonna G-25 equilibrata con tampone TE (Tabella 2) seguendo le istruzioni del produttore. Porre la colonna in 1,5 ml provetta fresco-free DNasi. </li><li> Aggiungere lentamente 50 ml di sonda (dal punto 8.1.2) sopra la resina, facendo attenzione a non disturbare il letto di resina. Spin per 2 min a 350 xg per raccogliere il campione purificato nella provetta da 1,5 ml. Lavare la colonna G-25 con 36 ml di acqua priva di nucleasi e rotazione per 2 min a 350 xg per raccogliere nella provetta. </li></ol></li><li> Ibridazione con l&#39;OL filamento complementareigonucleotide <ol><li> Trasferire la sonda radiomarcata (86 mL) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 200 ng del oligonucleotide inversa e 1x di tampone ricottura (Tabella 2). Riscaldare 5 min a 95 ° C e lasciare per una notte a temperatura ambiente per il raffreddamento. </li><li> Preparare non radioattivi oligonucleotidi a doppio filamento con l&#39;aggiunta di 50 ng di senza etichetta in avanti e oligonucleotidi e 1x di tampone ricottura invertire in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Portare al volume di 100 ml con acqua priva di nucleasi. Il calore e mantenerlo a temperatura ambiente come descritto al punto 8.3.1. </li></ol></li></ol> 9. Preparazione di un gel poliacrilammide non denaturante per EMSA <ol><li> Preparare un gel nativo 4% (10 x 12 cm) con 1,5 mm di spazio-pettine (vedi Tabella 2 per la composizione di gel). Pulire tutte le lastre di vetro con acqua distillata. Nota: E &#39;fondamentale che le piastre di essere completamente privo di detergente ionico, come SDS. </li><li> immediatamente pnostra soluzione acrilammide tra le piastre e permettere polimerizzazione procedere (circa 30 min). </li><li> Montare l&#39;apparato di elettroforesi e riempire il serbatoio con 0.5x TBE. Pre-eseguire il gel per 30 minuti a 1 ora a 150 V prima di caricamento del campione. </li></ol> 10. DNA reazione di legame <ol><li> In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 10 mg di estratto nucleare (passo 4.3) 1x Gel Spostamento Binding Buffer (Tabella 2) e portare il volume finale di 10 ml con acqua priva di nucleasi. Come controllo, predisporre un tubo senza estratto nucleare. Per la reazione della concorrenza, aggiungere 1 ml di non-specifica o specifiche oligonucleotide a doppio filamento a freddo (punto 8.3.2). </li><li> Aggiungere 1 ml di sonda radioattiva dal punto 8.3.1 a ogni reazione. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 20 min. Aggiungere 1 ml di tampone di caricamento 10x gel per reazione e caricare ogni campione sul gel preparata nella sezione 9. </li><li> Eseguire il gel per 1 1/2 a 2 ore a 150 V. Dopo la migrazione, avvolgere il gel e il vetro in un involucro di plastica e la posizione in una cassetta esposizione al di sotto uno schermo al fosforo. Lasciare cassette a 4 ° C per 24 ore. </li><li> Rimuovere lo schermo dalla cassetta di esposizione e inserire nel dispositivo di imaging di fosforo per la scansione. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Gli studi sulla funzione della placenta umana e lo sviluppo sono state notevolmente migliorate dai protocolli volti ad ottimizzare l&#39;isolamento di varie popolazioni di cellule placentari. Uno dei migliori popolazione di cellule placentari studiata rimane il citotrofoblasti villi, il cui studio ha notevolmente beneficiato di protocolli ottimizzati che permettono l&#39;isolamento efficiente e affidabile. Questo ha permesso inoltre una serie di esperimenti, come gli studi di trasfezione e promotore. Utilizzando un prot...

La disfunzione placentare umana è associata allo sviluppo di diverse malattie associate alla gravidanza come la preeclampsia e la restrizione della crescita intrauterina 1. Un importante costituente cellulare della placenta sono i trofoblasti, che possono essere classificati come citotrofoblasti extravillosi o villosi. Dopo la fusione, i citotrofoblasti villosi si differenziano ulteriormente nello strato di sinciziotrofoblasto, una struttura cellulare multinucleare con un ruolo importante nello scambio feto-materno e nella produzione di ormoni 2. I citotrofoblasti villosi primari umani e le loro controparti differenziate rappresentano importanti campioni biologici e consentono ai ricercatori di studiare una serie di processi correlati alla placenta, come la fusione cellulare, in coltura. Inoltre, sono in corso sforzi sostanziali per identificare marcatori che facilitino una gestione appropriata e migliorino le terapie preventive specifiche per le malattie legate alla gravidanza. I laboratori isolano abitualmente i citotrofoblasti primari dei villi umani da placente fresche, utilizzando una procedura di isolamento standard basata sulla digestione della tripsina dei villi della placenta 3. Poiché i citotrofoblasti in coltura perdono la loro capacità di proliferare e differenziarsi rapidamente in uno strato simile a quello dei sinciziotrofoblasti dopo la coltura 4, sono necessari metodi di trasfezione molto efficienti e approcci di analisi ottimizzati. Studi precedenti hanno determinato le condizioni ottimali di trasfezione di questi citotrofoblasti primari 5. Qui viene presentato un metodo diverso di trasfezione di siRNA, che è stato precedentemente testato in questa cellula di tipo 6. Rispetto a un approccio basato sulla lipofezione, questo metodo di microporazione migliora la trasfezione, valutata in base all'entità del silenziamento di geni specifici.
Gli studi sul promotore e sull'espressione genica forniscono anche una migliore comprensione della funzione placentare. Sebbene sia più difficile da utilizzare a causa del breve lasso di tempo per il quale i citotrofoblasti villosi primari possono essere coltivati, le analisi dei promotori utilizzando protocolli standard possono comunque essere affrontate, come precedentemente pubblicato 7. L'Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) è uno di questi metodi in vitro comunemente usati, che consente un monitoraggio rapido e semplice delle interazioni DNA-proteina. Estratti nucleari da questi trofoblasti primari sono stati utilizzati per testare una regione del promotore della sincitina-2 per interazioni specifiche. I risultati hanno rivelato che i fattori legati possono essere rilevati in diversi momenti della coltura e in modo specifico e riproducibile.
I dati presentati in questo protocollo confermano che il nostro approccio di trasfezione e il protocollo EMSA possono essere utilizzati per citotrofoblasti villosi primari isolati e saranno di grande utilità per studiare le diverse funzioni dei citotrofoblasti villosi in condizioni normali o patologiche.

<table><tbody><tr><td>HBSS senza&nbsp; Ca2+, Mg2+&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#H2387</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Sigma</td><td>#14060-057</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Alto glucosio senza Hepes</td><td>Gibco</td><td>#12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td><td>Gibco</td><td>#15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina-Neomicina (100x)</td><td>Gibco</td><td>#15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma</td><td>#A2411</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>#16170-078&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P-1644</td><td>Per gradiente di densità</td></tr><tr><td>Syncytin-2 siRNA</td><td>Ambion Life technologies</td><td>#AM16708</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled siRNA</td><td>Qiagen</td><td># SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D5025</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, tipo I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#T8003</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT Lipotrasfezione&nbsp; reagenti&nbsp;</td><td>GEhealthcare</td><td># T-2001-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi Cocktail</td><td>Roche Diagnostic#</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine BCA Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>#P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coniglio IgG, anticorpo legato HRP&nbsp;</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>#7074</td><td></td></tr><tr><td>Substrato di Western Blotting (POD) a chemiluminescenza BMRoche</td> <td>Diagnostic</td><td>#11500708001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>#14287-080</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleotide chinasi T4</td><td>NEB</td><td>#M0201S</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]</td><td>Perkin Elmer</td><td>#BLU002A100UC</td><td></td></tr><tr><td>Acrylmide</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A9099</tr><tr><td>TEMED</td><td>Life technologies</td><td>#17919</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>#A3678</tr><tr><td>Clone di anticorpi anti-citocheratina-7 umana LP5K,</td><td>Millipore</td> coniugato FITC <td>CBL194F</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Reagente bloccante FcR&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>Diluizione 1:10</td></tr><tr><td>Citometro a flusso BD Sistema Acuri</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microporator MP-100 apparato&nbsp;</td><td>Tampone di</td> risospensione bio <td></td><td></td>digitale</tr><tr><td>R (sistema di trasfezione al neon 100&nbsp; &micro; l Kit)</td><td>Life technologies</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>membrana PVDF&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010&nbsp;</td><td>Attiva con metanolo</td></tr><tr><td>Anticorpo GAPDH umano</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-137179</td><td>1:500</td></tr><tr><td>CavalloRubino Perossidasi (HRP) - capra coniugato anticorpo anti-coniglio o anticorpo anti-topo</td><td>Segnalazione cellulare #</td><td>7074</td><td>1:10.000</td></tr><tr><td>Cavallo Perossidasi di ravanello (HRP) - anticorpo anti-topo coniugato</td><td>Segnalazione cellulare</td> #<td>7076&nbsp;</td><td>1:10.000</td></tr><tr><td>NE-PER Reagente per Estrazione Nucleare e Citoplasmatica</td><td>Thermo Scientific</td><td>#78833</td><td></td></tr><tr><td>G-25 column&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>#27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di imaging a chemiluminescenza e fluorescenza</td><td>Montr&eacute; al Biotech</td><td>Fusion FX5</td><td></td></tr><tr><td>4% gel nativo</td><td>Fatto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>in casa PBS</td><td>Fatto</td><td></td> in casa <td>1x</td></tr><tr><td>Personal Molecular Imager (PMI) Sistema</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sirna transfection e l&#39;emsa analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

I citotrofoblasti villosi primari umani sono una fonte molto utile di cellule primarie per studiare le funzioni placentari e i meccanismi di regolazione e per comprendere le malattie legate alla gravidanza. In questo protocollo, i citotrofoblasti villosi primari umani appena isolati dalla placenta attraverso un protocollo standard DNasi/tripsina sono microporosi con piccoli RNA interferenti (siRNA). Questo approccio ha fornito una maggiore efficienza per la trasfezione di siRNA rispetto a un metodo basato sulla lipofezione. Le cellule trasfettate possono essere successivamente analizzate mediante Western blot standard entro un lasso di tempo di 3-4 giorni dopo la trasfezione. Inoltre, utilizzando citotrofoblasti villosi primari in coltura, l'analisi EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) è stata ottimizzata ed eseguita su estratti dai giorni 1 a 4. L'uso di queste cellule primarie in coltura e il protocollo descritto consentono una valutazione dell'implicazione di specifici geni e fattori di trascrizione nel processo di differenziazione del citotrofoblasto villoso in uno strato cellulare simile a quello dei sinciziotrofoblasti. Tuttavia, l'intervallo di tempo limitato consentito nella coltura preclude l'uso di metodi che richiedono più tempo, come la generazione di una popolazione cellulare stabile. Pertanto, il test di questa popolazione cellulare richiede protocolli di trasferimento genico altamente ottimizzati.

placente freschi dal gravidanze termine sono stati usati per isolare citotrofoblasti villi primari umani per condurre la serie di esperimenti presentati nella sezione Protocollo. Dopo l&#39;isolamento, abbiamo prima analizzato la purezza cytotrophoblasts attraverso l&#39;uso del marcatore citocheratina-7 (Figura 1). Preparazioni di cellule sono state quindi colorati con un anticorpo monoclonale anti-citocheratina-7 anticorpi. La figura 1 rappresenta i ri...

Questo protocollo descrive un metodo per trasfezione efficiente siRNA in appena isolate citotrofoblasti villi umani con microperforazione e identificando complessi DNA-proteina in queste cellule. cellule trasfettate possono essere monitorati da Western Blot e EMSA analisi durante il tempo della cultura di 4 giorni.

siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare le condizioni ottimali per la trasfezione di citotrofoblasti villosi primari appena isolati e presentare un metodo per l'identificazione dell'interazione DNA-proteina a livello dei siti promotori. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca placentare, come quelle relative ai geni coinvolti nella differenziazione dei citotrofoblasti e ai meccanismi regolatori implicati nella loro espressione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è semplice da eseguire e molto efficiente.Inoltre, il tempo necessario per eseguire questo esperimento è breve e può includere un gran numero di campioni diversi. La dimostrazione di queste procedure sarà effettuata da Chirine Toufaily, ex studentessa di dottorato del mio laboratorio, e da Yong Xiao, ricercatore associato. Qui, i citotrofoblasti villiferi primari vengono isolati da placente fresche seguendo protocolli standard.Il primo passaggio di questo protocollo consiste nell'analizzare la purezza della preparazione mediante analisi FACS. Per prima cosa, centrifugare 1 × 10⁶ citotrofoblasti appena isolati in provette da microcentrifuga a 300 × g per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante.Aggiungere un millilitro di PBS preriscaldato e ripetere la centrifugazione. Dopo aver rimosso il PBS per aspirazione, aggiungere un millilitro di metanolo freddo alle cellule e incubare a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, dopo aver pellettizzato le cellule mediante centrifugazione, rimuovere il metanolo per aspirazione.Quindi aggiungere un millilitro di PBS a temperatura ambiente al pellet per reidratare le cellule. Dopo aver centrifugato le cellule e rimosso il PBS, aggiungere PBS contenente FBS con reagente bloccante per il recettore FC e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente per eliminare il legame non specifico. Trascorso il tempo di incubazione, lavare le cellule due volte con 500 microlitri di PBS a temperatura ambiente, centrifugando a 300 ×g per cinque minuti ogni volta.Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio con PBS, risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS a temperatura ambiente. Quindi incubare le cellule con un anticorpo monoclonale murino coniugato con FITC anti-citocheratina 7 umana, clone LP5K, oppure con un anticorpo non specifico di controllo appaiato per isotipo, per 4 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo aver lavato le cellule con PBS, analizzare la fluorescenza mediante citometria a flusso.Utilizzare preparazioni cellulari che dimostrino almeno il 96% di cellule positive per CK7 mediante citometria a flusso per ulteriori esperimenti. Per trasfettare citotrofoblasti villosi primari umani mediante un dispositivo di microporazione, preparare innanzitutto piastre a sei pozzetti contenenti due millilitri di mezzo DMEM integrato e posizionarle in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius. Successivamente, trasferire aliquote di 1,5 × 10⁶ citotrofoblasti primari isolati in provette per microcentrifuga.Successivamente a una centrifugazione per ottenere il pellet cellulare, lavare con un millilitro di PBS di Dulbecco. Dopo aver rimosso il PBS e aver risospeso delicatamente le cellule lavate in 100 microlitri di buffer di risospensione, aggiungere 300 nanogrammi di siRNA contro Syncytin-2 o siRNA di controllo mescolato. Quindi aspirare la miscela di cellule e siRNA utilizzando una pipetta da 100 microlitri per la trasfezione.Ora inserire la pipetta nella stazione di trasfezione ed esporre le cellule a un singolo impulso di 1300 volt della durata di 30 millisecondi. Successivamente, trasferire immediatamente le cellule nelle piastre a sei pozzetti precedentemente preparate e agitare delicatamente la piastra per 30 secondi per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. È molto importante non formare bolle d'aria durante la risospensione delle cellule e trasferirle immediatamente nel mezzo.Altrimenti ciò influirà sulla vitalità delle cellule e sull'efficienza di trasfezione. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un'incubatrice a anidride carbonica umidificata per 24-48 ore. Per prima cosa, lavare due volte i citotrofoblasti coltivati con un millilitro di DPBS preriscaldato.Dopo aver aspirato il DPBS, aggiungere 500 microlitri di tripsina-EDTA 0,25% e incubare da uno a tre minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore a biossido di carbonio. Successivamente, interrompere il trattamento con la tripsina aggiungendo 500 microlitri di mezzo di crescita contenente siero e trasferire le cellule da ogni pozzetto in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro. Raccogliere le cellule in pellet mediante centrifugazione a 300 × g per due minuti a temperatura ambiente.Dopo aver lavato e centrifugato nuovamente le cellule, rimuovere con attenzione tutto il soprannatante senza disturbare il pellet e posizionare le provette sul ghiaccio fino all'estrazione delle proteine. Preparare la reazione di fosforilazione in una provetta da microcentrifuga aggiungendo 15 nanogrammi di un oligonucleotide diretto insieme a 1X tampone T4 Polinucleotide chinasi, un'unità di T4 Polinucleotide chinasi e 20 microcurie di ATP marcato con gamma-32P in acqua priva di nucleasi, per un volume finale di 20 microlitri. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi, arrestare la reazione aggiungendo 5 microlitri di EDTA 0,5 M. Portare il volume a 50 microlitri con acqua priva di nucleasi. Procedere quindi alla rimozione dei nucleotidi non incorporati e all'ibridazione del filamento complementare seguendo le istruzioni riportate nella parte scritta del protocollo.Impostare la reazione di legame del DNA aggiungendo innanzitutto 10 microgrammi di estratto nucleare in 1X tampone di legame per gel shift in acqua priva di nucleasi, per un volume finale di 10 microlitri. Per la reazione di competizione, aggiungere un microlitro di oligonucleotide a doppio filamento freddo non specifico o specifico. Successivamente, aggiungere un microlitro della sonda oligonucleotidica radioattiva a ciascuna reazione.Incubare la reazione a temperatura ambiente per 20 minuti. Aggiungere quindi un microlitro di buffer di caricamento per gel 10X per ogni reazione. Caricare ogni campione su un gel di poliacrilamide non denaturante ed eseguire l'elettroforesi per 1,5-2 ore a 150 volt.Dopo la migrazione, avvolgere il gel e il vetro con della pellicola trasparente. Quindi posizionare il gel avvolto in una cassetta per esposizione e appoggiarvi sopra uno schermo al fosforo. Lasciare la cassetta a 4 gradi Celsius per 24 ore.Il giorno successivo, rimuovere lo schermo dalla cassetta di esposizione e inserirlo in un dispositivo di phosphorimaging per la scansione. La microporazione di un siRNA di controllo randomizzato o specifico per Syncytin-2 in citotrofoblasti villosi viene confrontata con un approccio di trasfezione basato su lipidi mediante rilevamento tramite western blot di Syncytin-2 e della proteina di controllo GAPDH. I livelli proteici di Syncytin-2 sono stati normalizzati in termini di intensità delle bande rispetto ai segnali corrispondenti di GAPDH.La microporazione porta in modo conclusivo a un abbattimento più significativo dell'espressione di Syncytin-2. Questa immagine mostra un'analisi EMSA di estratti nucleari di citotrofoblasti villiferi incubati con una sonda corrispondente a una regione del promotore di Syncytin-2, in presenza o assenza di un eccesso di oligonucleotide freddo specifico o non specifico, per 24 o 48 ore. La sonda sotto il controllo del promotore di Syncytin-2 ha evidenziato la presenza di due complessi DNA-proteina.L'aggiunta di oligonucleotide wildtype freddo ha competuto per la formazione del complesso, mentre nessuna competizione è stata osservata con un oligonucleotide freddo non correlato. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante manipolare con attenzione i citotrofoblasti dopo la trasfezione e trasferirli immediatamente nel mezzo. Successivamente alla procedura EMSA, può essere eseguito un saggio di supershift al fine di identificare il fattore di trascrizione legato al DNA.Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come manipolare e trasfettare con attenzione un citotrofoblasto, nonché su come eseguire un saggio EMSA con questo tipo di cellule.

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JoVE Journal

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Genetica

In questo protocollo, si descrive la dissezione placentae dal mouse sulla gravidanza D10.5, seguito da isolamento di cellule trofoblastiche mediante gradiente di Percoll. Abbiamo poi dimostrare l'utilizzo delle cellule isolate in un saggio di invasione Matrigel.

Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto

Questo manoscritto presenta un modello unico in vitro di cellule di citotrofoblasto villoso umano immunopurificate coltivate in ipossia/riossigenazione. Questo modello è adatto per studiare gli effetti protettivi di trattamenti promettenti, come la melatonina, sulle complicanze della gravidanza associate all'aumento dello stress ossidativo e all'alterazione della funzione placentare.

Umana Trophoblast primaria coltura cellulare modello per studiare gli effetti protettivi della melatonina contro ipossia / riossigenazione Disruption-indotta

Le cellule giganti del trofoblasto (TGC) svolgono un ruolo chiave nella placenta per garantire una gravidanza sana. Presentiamo un protocollo per valutare lo stato trascrizionale dei geni nei TGC mediante ibridazione fluorescente nascente in situ su sezioni criostatiche di embrioni post-impianto o colture a breve termine di coni ectoplacentari embrionali al 7° giorno.

Analisi trascrizionale dal nascente RNA FISH di<em&gt; In Vivo</em&gt; Cellule del trofoblasto giganti o<em&gt; In Vitro</em&gt; Culture a breve termine di Ectoplacental Cono espianti

Qui, presentiamo un protocollo per la dissezione di cordone umano ombelicale (UC) e il campione placenta fetale in cavo rivestimento (CL), gelatina di Wharton (WJ), cavo-placenta giunzione (CPJ), e placenta fetale (FP) per l'isolamento e caratterizzazione di cellule stromali mesenchimali (MSC) utilizzando la tecnica di espianto.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

Qui, presentiamo un protocollo per generare in modo efficiente cellule trofoblastiche umane da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando la proteina morfogenica ossea 4 e inibitori delle vie Activina/Nodale. Questo metodo è adatto per la differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane e può generare grandi quantità di cellule per la manipolazione genetica.

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

Presentato qui è un protocollo per il campionamento del tessuto villous placenta umano seguito da isolamento di cytotrophoblasts per colture cellulari primarie. Trattamento del trofoblasto con TNFα ricapitola l'infiammazione nell'ambiente intrauterino obeso e facilita la scoperta di bersagli molecolari regolati da infiammazione in placente con l'obesità materna.

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

Questo studio presenta un protocollo per il tessuto reversibile di compensazione, immunostaining, 3D-rendering e analisi di reti vascolari nei campioni di villi di placenta umana nell'ordine di 1-2 mm3.

Rendering tridimensionale e l'analisi di Immunolabeled, chiarito reti vascolari Villous placentare umani

Questo protocollo viene illustrato un metodo per l'isolamento di cellule deciduali umane primarie raccolti da membrane fetali di placente di termine che possono essere utilizzate per una varietà di applicazioni (cioè immunocitochimica, citometria a flusso, ecc.) con l'obiettivo per studiare il ruolo delle diverse popolazioni cellulari in complicazioni di gravidanza.

Isolamento di cellule deciduali umane primarie dalle membrane fetali del termine intempestivo della placenta

Qui, presentiamo un protocollo altamente accessibile per valutare il movimento delle cellule in cellule del trofoblasto umano utilizzando tre saggi in vitro: l'analisi di gratta e Vinci, l'analisi di invasione di transwell e l'analisi di proliferazione delle cellule.

Test in Vitro per valutare la migrazione, invasione e la proliferazione di linee cellulari immortalizzate umano primo-acetonide Trophoblast

Il presente protocollo consente il recupero di strutture tubolari formate nel classico saggio di angiogenesi in vitro di formazione di tubi in cui le cellule, come le cellule del trofoblasto, si organizzano in strutture capillari su uno strato di matrice di membrana basale extracellulare. Le strutture recuperate vengono utilizzate per l'isolamento di RNA e proteine per varie analisi biochimiche.

Recupero delle cellule del trofoblasto dall'angiogenesi - Saggio di formazione di provette per l'analisi dell'espressione del marcatore di differenziazione

Questo protocollo consente la purificazione, la caratterizzazione e la coltura dei trofoblasti extravillosi primari HLA-G+ (EVT) dalla decidua basali e dalla membrana corionica delle placente a termine umane. Le colture primarie di EVT mantengono la vitalità per 96 ore, permettendo la co-coltura con cellule immunitarie materne abbinate a campioni e la successiva analisi citometrica e molecolare del flusso delle loro interazioni.

Purificazione di trofoblasti extravillosi HLA-G+ da tessuti placentari a termine umani per fenotipizzazione e analisi funzionale

Scopri la transfezione siRNA mediante microporazione e l'analisi EMSA su citotrofoblasti villosi umani isolati. Questo metodo efficiente permette di studiare le interazioni DNA-proteina nella ricerca sulla placenta.

siRNA Transfection e l'EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

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