Name: Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Scopri come stabilire un modello di fegato fibrotico indotto da etanolo in zebrafish per studiare la rigenerazione epatocitaria. Questo metodo consente screening chimici economici e analisi temporali dettagliate in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal GTEC (2.731.336 e 1.411.318), il NIH (K01DK081351), e la NSF (1.354.837) per CHS Ringraziamo Alem Giorgis per la lettura critica del manoscritto.

Zebrafish sono state sollevate e cresciuto utilizzando un protocollo standard che soddisfa i criteri del National Institutes of Health e approvati dal Georgia Institute of Technology Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso. 1. preparazione di soluzioni <ol><li> Preparare acqua uovo 20 L (intercambiabile usato con &#39;media embrione&#39;) per mantenere embrionale zebrafish / larvale. Sciogliere 1,5 g CaSO 4 e 6 g oceano istante sale marino in 250 ml di acqua distillata. Versare in una damigiana piena di 20 L di acqua distillata e agitare. </li><li> Preparare 1 L soluzione di 1-fenil-2-tiourea (PTU) stock (20x). Sciogliere 0,6 g di polvere in 1 PTU acqua distillata L. Aggiungere 1 ml di soluzione madre per 20 ml di mezzo embrione ad una concentrazione finale di 0,003% in una soluzione di lavoro. ATTENZIONE: PTU può causare tossicità sistemica a seguito di inalazione o l&#39;esposizione cutanea. Preparare e utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate. </li><li> Preparare 1 L etil 3-aminobenzoate soluzione madre metanosolfonato (Tricaine) (20x). Sciogliere 4 g di polvere Tricaine in acqua distillata. Aggiustare il pH a 7 con l&#39;aggiunta di 1 M Tris (pH 9), e portare il volume finale a 1 L con acqua distillata. Aliquota in 50 ml e conservare a -20 ° C. Scongelare prima dell&#39;uso. ATTENZIONE: Tricaine può indurre una perdita di sensibilità. Preparare e utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate. </li><li> Preparare 100 larvale metronidazolo (MTZ) soluzione di lavoro ml. Fare fresco 15 mM soluzione MTZ sciogliendo 0,25 g di polvere MTZ nello 0,1% dimetilsolfossido (DMSO) in 100 ml di mezzo embrione. Sciogliere MTZ polvere completamente di agitazione vigorosa. Fai la soluzione fresca MTZ e utilizzare un foglio di alluminio per evitare la degradazione fotocatalitica di MTZ. ATTENZIONE: MTZ può causare irritazione. Preparare e utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate. </li><li> Preparare 100 ml di soluzione di lavoro larvale etanolo / metronidazolo (EtOH / MTZ). Fai la soluzione fresca MTZ e utilizzare un foglio di alluminio per evitare fotocatalitico degradazione di MTZ. Aggiungere 1,5 ml di etanolo al 100% in 100 ml di soluzione MTZ ad una concentrazione finale di 1,5% al ​​momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare 500 ml di soluzione di lavoro degli adulti MTZ. Fare fresco 10 mM soluzione MTZ sciogliendo 0,83 g di polvere MTZ nello 0,1% DMSO in 500 ml di acqua del sistema. Sciogliere MTZ polvere completamente di agitazione vigorosa. Fai la soluzione fresca MTZ e utilizzare un foglio di alluminio per evitare la degradazione fotocatalitica di MTZ. </li><li> Preparare 1 L PEM tampone. Sciogliere 30.2 g TUBI, 0,74 g EGTA, e 0,12 g MgSO 4 in acqua distillata. Regolare il pH a 7 con NaOH. Portare il volume finale a 1 L con acqua distillata. </li></ol> 2. Preparazione di larve Zebrafish <ol><li> Impostare l&#39;accoppiamento di [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 zebrafish adulto con Tg (hand2: EGFP) PD24 13 zebrafish adulto in serbatoi di accoppiamento. Utilizzare divisori per condurre l&#39;accoppiamento a tempo. </li><li> Rimuovere il divider la mattina seguente e permettono di pesce per accoppiarsi senza interruzioni. embrioni Harvest 2 ore più tardi da sforzare l&#39;acqua del sistema e trasferire gli embrioni in 100 mm piastre di Petri con terreno di embrione. </li><li> Mantenere non più di 100 embrioni per piastra di Petri. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere uova non fecondate utilizzando una pipetta di vetro. Crescere embrioni a 28 ° C e aggiungere feniltiourea (PTU) ad una concentrazione finale di 0,003% dopo 10 ore di post-fecondazione (HPF) per inibire lo sviluppo del pigmento. </li></ol> 3. L&#39;etanolo, Trattamento metronidazolo e fegato Rigenerazione in larvali Zebrafish <ol><li> Preparare la soluzione EtOH fresca aggiungendo etanolo in un mezzo embrione ad una concentrazione finale di 1,5%. Non aggiungere PTU. </li><li> Trattare embrioni con 20 ml di soluzione di etanolo per ogni capsula di Petri 56-80 HPF. Coprire piastre di Petri con pellicola trasparente per evitare l&#39;evaporazione di etanolo. </li><li> Classificare [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11 </sup&gt;; Tg (hand2: EGFP) PD24] larve con dimensioni del fegato simile, come determinato da espressione CFP, a 80 HPF. Non utilizzare Tricaine durante l&#39;ordinamento le larve EtOH-trattati, perché questo farà sì alto tasso di mortalità, con successivo trattamento EtOH / MTZ. Mantenere le larve ordinato con una densità di 30 embrioni per piastra di Petri. </li><li> Preparare fresco 15 mm MTZ nel medio embrione nello 0,1% DMSO. Aggiungere corretta quantità di EtOH in soluzione MTZ fare una concentrazione finale di 1,5%. Incubare le larve in 20 ml di soluzione EtOH / MTZ per capsula di Petri per 24 ore a 28 ° C. Coprire piastre di Petri con involucro di plastica per mantenere la concentrazione EtOH e con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. </li><li> Alla fine del trattamento, rimuovere la soluzione EtOH / MTZ trasferendo larve di nuove piastre Petri con terreno fresco embrione. Lavare le larve 3 volte con media embrione e tenerli in 20 ml di mezzo embrione senza PTU. </li><li> Per risolvere le larve con quasi completa ablazione della epatociti, osservare la fluorescenzasotto un microscopio a epifluorescenza con il filtro PCP con un ingrandimento di 80X. risultati ablazione di successo in minima fluorescenza PCP nel fegato e volume del fegato significativamente ridotto. </li><li> Per evitare la morte delle larve EtOH / MTZ-trattati, non utilizzare Tricaine per l&#39;ordinamento. Fissare le larve per immunocolorazione (vedere la sezione 5) o tenere larve ordinati in piastre di Petri a 28 ° C per ulteriori analisi. </li></ol> 4. Schermi chimici in EtOH / MTZ-trattati larvale Zebrafish <ol><li> Portare le piastre a 96 pozzetti contenenti 10 mM scorte chimiche in DMSO (consultare l&#39;elenco dei materiali per i dettagli delle librerie chimiche commerciali) dal -80 ° C freezer. Coprire con un foglio di alluminio per evitare la degradazione fotocatalitica dei prodotti chimici. Scongelare soluzioni madre a temperatura ambiente con dolce dondolio. </li><li> Preparare soluzioni chimiche diluendo 10 soluzioni madri mm con medio embrione ad una concentrazione finale di 50 micron (in 96 pozzetti: s inizialicreen; in provette da 1,5 ml: nuovo test). larve di controllo sono stati trattati con uguali concentrazioni di DMSO in media embrione. </li><li> Trasferimento larve con quasi completa ablazione epatociti, che sono stati trattati con 1,5% EtOH / 15 mm MTZ e allineati secondo quanto sopra indicato, a uno a 96 pozzetti (schermata iniziale) o 24 pozzetti (ripetere il test) piastre preriempite con media embrione ad una densità di 5 larve per bene. Utilizzare pozzetti in duplicato per ogni sostanza chimica. </li><li> Rimuovere media embrione e aggiungere o 250 ml (piastre a 96 pozzetti) o 500 ml (24 pozzetti) soluzioni chimiche in ciascun pozzetto. piastre di copertura con un foglio di alluminio e trattare le larve per 50 ore a 28 ° C. Ispezionare larve chimico-immersione quotidiana e rimuovere eventuali larve morte da singoli pozzi. </li><li> Alla fine del trattamento chimico, osservare il numero e / o intensità di epatociti CFP-esprimono sotto un microscopio a epifluorescenza con il filtro PCP con un ingrandimento di 80X. Fotografia dal vivo che mostra larve migliorata o ridurreil numero d e / o intensità di epatociti PCP che esprimono con una macchina fotografica digitale per i record. </li><li> Conserva le larve da formaldeide fissazione per l&#39;imaging confocale come descritto nella sezione 5. </li><li> Per testare nuovamente i prodotti chimici che facilitano la rigenerazione degli epatociti nella schermata iniziale, esaminare la loro efficacia a concentrazioni superiori e inferiori per trovare la concentrazione più efficace con le procedure descritte nel 4,1-4,5 ( &#39;nuovo test&#39;). </li></ol> 5. larvale Zebrafish Fixation, Immunocolorazione, e confocale Imaging <ol><li> Anestetizzare larve aggiungendo Tricaine ad una concentrazione finale di 0,02%. Trasferire 10-15 larve in una provetta da 1,5 ml e lavare una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di preparati al momento 2% di formaldeide in tampone PEM di risolvere O / N a 4 ° C. ATTENZIONE: La formaldeide provoca irritazione ed è noto per essere cancerogeno per l&#39;uomo. Maneggiare in una cappa. </li><li> Scartare il fissaggio soluzione correttamente e poi wash 3 volte con PBS a temperatura ambiente. larve fisso può essere conservato in PBS a 4 ° C fino a diversi giorni. Di procedere alla fase successiva dà subito risultati migliori immunocolorazione. </li><li> Rimuovere con attenzione il tuorlo e la pelle che copre la zona del fegato utilizzando una pinza # 55 allo stereomicroscopio. </li><li> Permeabilize e blocco larve nel Blocco tampone (4% di siero albumina bovina e 0,3% Triton X-100 in PBS) O / N a 4 ° C. </li><li> Incubare con coniglio anti-collagene I anticorpi alla diluizione di 1: 100 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte per 15 minuti ciascuno con tampone di lavaggio (0,3% Triton X-100 in PBS). </li><li> Incubare con AlexaFluor 647 coniugato asino anticorpi anti-coniglio alla diluizione di 1: 200 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte per 15 minuti ciascuno con tampone di lavaggio. Quindi lavare una volta con PBS. </li><li> Delicatamente trasferire le larve di vetrini utilizzando una pipetta di vetro, e orientare le larve fissato con il lato laterale sinistro rivolto verso l&#39;alto. Rimuovere l&#39;eccesso di PBS usando Kimwipes. Aggiungere una goccia di mezzi di montaggioE vetro di copertura di tenuta con smalto. Condurre confocale immediatamente è fortemente raccomandato. </li><li> Utilizzare un sistema confocale dotata di un obiettivo 40X / 1.3 olio per catturare le immagini. Usare la forza del laser al 20-50%. Catturare immagini dello stack Z a intervalli di 1 micron. </li></ol> 6. Preparazione di Zebrafish adulti <ol><li> Impostare l&#39;accoppiamento di [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 zebrafish adulto in serbatoi di accoppiamento. Harvest embrioni la mattina seguente da sforzare l&#39;acqua del sistema e trasferire gli embrioni in 100 mm piastre di Petri con terreno di embrione. </li><li> Mantenere non più di 100 embrioni per piastra di Petri. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere uova non fecondate utilizzando una pipetta di vetro. Crescere embrioni a 28 ° C e aggiungere PTU ad una concentrazione finale di 0,003% dopo 10 HPF per inibire lo sviluppo del pigmento. </li><li> A 4 dpf, usare Tricaine per anestetizzare le larve e risolvere [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larve. Lavare Tricaine passando a nuove embrione medio più volte. Lasciare che le larve di recuperare a 28 ° C fino a raggiungere la frequenza cardiaca normale di 120-180 battiti al minuto 18. </li><li> Sollevare larve ordinato per 6-12 mesi in base alla procedura standard 19. </li></ol> 7. L&#39;etanolo, Trattamento Metronidazolo, e fegato Rigenerazione in Zebrafish adulti <ol><li> Trasferire 6-12 mesi di età [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] adulto zebrafish ai serbatoi di accoppiamento con una rete. Mantenere pesci ad una densità non superiore a 10 pesci per vasca. </li><li> Preparare la soluzione EtOH fresca aggiungendo EtOH in acqua sistema a una concentrazione finale di 1%. Trattare pesci adulti con 500 ml di soluzione di EtOH in ogni serbatoio e mantenerli in un incubatore a 28 °. </li><li> pesce Trasferimento adulto per soluzione EtOH fresco tutti i giorni, degli scarti prop pesci mortirettamente come un rischio biologico. Continuamente trattare gli animali per 72 ore prima del trattamento MTZ. </li><li> Preparare fresco soluzione 10 mM MTZ in acqua sistema in 0.1% DMSO. Pre-riscaldare la soluzione MTZ in un incubatore a 28 °. Trattare pesce con 500 ml di soluzione MTZ in 1 L Serbatoio di passaggio per 8 ore a 28 ° C, al riparo dalla luce con un foglio di alluminio. </li><li> Osservare ogni ora durante il trattamento e rimuovere immediatamente pesci morti. Scartare pesci morti correttamente come un rischio biologico. Alla fine del trattamento MTZ, lavare MTZ trasferendo animali all&#39;acqua sistema fresco due volte. </li><li> Consentire agli animali di recuperare e mantenerli in un incubatore a 28 ° C. Mangimi e trasferire i pesci di acqua sistema fresca tutti i giorni fino al punto di tempo per le analisi. </li></ol> 8. Zebrafish adulti Fegato Fixation, Immunocolorazione, e confocale Imaging <ol><li> Anestetizzare il pesce adulto con 0,02% Tricaine e euthanize in acqua ghiacciata per 15 minuti. Pat secco pesce su un tovagliolo di carta e posizionarlo su una stuoia di dissezione. </li><li> Esporre organi gastrointestinali, eliminando la pelle e muscoli come descritto in precedenza 20. Utilizzare forbici per tagliare la pelle e muscolo sottostante lungo il ventre dalla pinna anale alla opercolo, e quindi posteriormente lungo il lato del pesce torna alla pinna anale. </li><li> Mettete il pesce in un tubo da 15 ml e lavare una volta con PBS. Rimuovere PBS e aggiungere 4 ml di preparati al momento 2% di formaldeide in tampone PEM di risolvere O / N a 4 ° C. </li><li> Scartare fissa soluzione correttamente, e lavare 3 volte con PBS a temperatura ambiente. campioni fissi possono essere tenuti in PBS a 4 ° C per diversi giorni. Di procedere alla fase successiva dà subito risultati migliori immunocolorazione. </li><li> Sezionare l&#39;intero intestino con fegato dalla cavità corpo del pesce tagliando l&#39;esofago. Incorporare gli organi gastrointestinali con 4% a basso punto di fusione agarosio in uno stampo di sezionamento. </li><li> Utilizzare un vibratome per tagliare campioni in sezioni trasversali a 50 micron intervalli in ghiaccio PBS freddo, a partire dall&#39;estremità anteriore. Trasferimento seczioni a 6 pozzetti con PBS utilizzando un pennello # 1. </li><li> Permeabilize e le sezioni di blocco in blocco buffer di O / N a 4 ° C. </li><li> Incubare con coniglio anti-collagene I anticorpi alla diluizione di 1: 100 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte, 15 minuti ciascuno con tampone di lavaggio. </li><li> Incubare con AlexaFluor 647 coniugato asino anticorpi anti-coniglio alla diluizione di 1: 200 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte, 15 min ciascuno con tampone di lavaggio e una volta con PBS. </li><li> trasferire delicatamente sezioni per vetrini utilizzando un pennello # 1. Rimuovere l&#39;eccesso di PBS utilizzando Kimwipes, aggiungere una goccia di mezzi di montaggio e vetro di copertura di tenuta con smalto. Condurre confocale immediatamente è altamente consigliato. </li><li> Utilizzare un sistema confocale dotata di un obiettivo 40X / 1.3 olio per catturare le immagini. Usare la forza del laser al 20-50%. Catturare immagini dello stack Z a intervalli di 1 micron. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo osservato rigenerazione degli epatociti HPC-mediata nel fegato recupero EtOH / MTZ-trattati, suggerendo che anche in presenza di notevoli quantità di proteine ​​ECM compresi tipo fibrillare collagene, i HPCs conservano la loro competenza per rigenerare come epatociti. L&#39;unico MTZ-trattamento non ha aumentato la deposizione di proteine ​​ECM in modo significativo, mentre il EtOH unico trattamento non ha indotto attivazione HPC 15. Utilizzando il trattamento EtOH / MTZ combinato, siamo stati in grad...

Nonostante la notevole capacità di rigenerazione degli epatociti 1, che sono il principale tipo di cellule parenchimali del fegato, insufficienza epatica cronica altera questa capacità, portando a cellule progenitrici epatiche (HPC) -dipendente rigenerazione 2. Danni al fegato cronica è derivato principalmente da abuso di alcool, cronica da virus dell&#39;epatite C (HCV) 3 e steatosi epatica non alcolica (NAFLD) 4. Si porta a fibrosi epatica sostenuta, che è associato con l&#39;accumulo di matrice extracellulare (ECM) proteine. Accumulo ECM Persistendo distorce architettura epatica intatta formando un tessuto cicatriziale fibroso 5, successivamente, con conseguente cirrosi con alta morbilità e mortalità. Molti tentativi sono stati fatti per mitigare la risposta fibrotica soprattutto concentrandosi su inibendo citochine profibrogenic e miofibroblasti attivati ​​6. Quest&#39;ultimo deriva principalmente dalle cellule stellate epatiche (HSC), le cellule non parenchimali epatiche principali responsabili della formazione della cicatrice fegato 4. Tuttavia, terapie rigenerative che stimolano fonti endogene cellulari tra cui HPC per rigenerare epatociti in presenza di insulti fibrogeniche sostenuti attendono ulteriori indagini. Molti modelli sperimentali di fibrosi epatica sono stati descritti nei mammiferi. Iniezione ripetitiva di tetracloruro di carbonio (CCL 4) è stato ampiamente utilizzato per indurre la fibrosi epatica in murine e ratto modelli 7. In combinazione con una dieta ad alto contenuto di grassi (HF), l&#39;alcol ha portato ad una sostanziale upregulation dell&#39;espressione genica profibrogenic e fibrosi epatica 8. Mentre steatosi (accumulo di lipidi) risulta dall&#39;esposizione alcol acuta, rende il fegato suscettibile di più grave danno epatico 9. Il zebrafish, Danio rerio, è emerso come un prezioso sistema modello per lo studio dei vertebrati la rigenerazione. Anche sealtri vertebrati inferiori, come tritoni e Axolotl hanno una notevole capacità di rigenerazione, il pesce zebra ha vantaggi rispetto ad altri sistemi modello per quanto riguarda la manipolazione genetica e la visualizzazione strategie necessarie per manipolare i fattori di potenziale rigenerativo 10. Il pesce zebra rappresenta anche un modello vertebrato interessante per lo studio della malattia epatica alcolica (ALD) con la semplice aggiunta di etanolo (EtOH) per la loro acqua. L&#39;esposizione acuta EtOH di zebrafish larvale e adulto causato steatosi epatica 11-13. Quando zebrafish adulto ha ricevuto l&#39;esposizione prolungata EtOH, deposizione di collagene è stata osservata con up-regulation dei geni fibrosi correlati 14. Tuttavia, esiste la necessità di sviluppare modelli per studiare rigenerazione epatica in risposta ad EtOH come stimolo fibrogenico. Recentemente, abbiamo sviluppato un modello di fegato fibrotico EtOH indotta in zebrafish 15. Abbiamo combinato un sistema di ablazione genetica specifica-epatociti con il trattamento EtOH in larvale e Adult zebrafish. Abbiamo generato due linee transgeniche, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 e Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, in cui E.coli nitroreduttasi (NTR) si fondono al ciano e proteina fluorescente mCherry, rispettivamente sotto il controllo dell&#39;acido grasso specifico epatociti legame 10a proteine, fegato base (fabp10a) promotore. In questo sistema, NTR converte un metronidazolo profarmaco non tossico (MTZ) in un DNA inter-strand reticolante 16, inducendo la morte esplicita di epatociti. Utilizzando questo modello, abbiamo dimostrato che una popolazione di cellule epatiche, che sono sensibili alle segnalazione Notch, convertito in epatociti nella quasi totale assenza di epatociti e l&#39;eccesso di ECM. Designiamo queste cellule come HPC. Inoltre, attraverso schermi chimici, abbiamo identificato piccoli attivatori molecola di segnalazione Wnt e inibitori di Notch che aumentano la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico. therefori, il nostro modello di fegato fibrotico in zebrafish rappresenta un eccellente sistema di screening chimico rispetto alla cultura- cellulare o sistema di screening dei mammiferi-based. Si tratta di un sistema in vivo con in termini di costi e benefici significativi di risparmio di tempo. Qui si descrivono le procedure dettagliate per la creazione di un modello di fegato fibrotico EtOH-indotta e per l&#39;esecuzione di schermi chimici che utilizzano questo modello in zebrafish. Inoltre, le analisi tempo-corso sono stati effettuati per studiare come epatociti rigenerazione avviene nel fegato fibrotico. Questo protocollo fornirà uno strumento prezioso per studiare i meccanismi e le strategie per potenziare la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico.

<table><tbody><tr><td>Solfato di calcio emiidrato (CaSO4)</td><td>Acros</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio (MgSO4)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>Acido 1,4-piperazinediethanesulfonico (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)- N,N,N&prime;,N&prime; Acido -tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazolo (MTZ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-fenil-2-tiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-amminoacido benzoico estere etilico (Tricaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Compressa di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Amresco</td><td>E404</td><td>Sciogliere una compressa con 100 ml di acqua distillata</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Bassopunto di fusione agarosio&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td>Libreria di composti di segnalazione con cellule staminali</td><td>Selleck Chemicals</td><td>L2100</td><td>10&nbsp; mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>ActiProbe-1K Libreria</td><td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&nbsp; Azioni mM in DMSO</td></tr><tr><td>SB 415286</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2729</td><td>Dissolvere con DMSO a 10&nbsp; mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>Dissolvere con DMSO a 10&nbsp; </td></tr><tr><td>mM Anti-Collagene I anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab23730</td><td>Utilizzare in scala 1:100 per l'immunocolorazione, reagisce con il pesce</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Asino IgG anti-coniglio (H+L)</td><td>Sonde molecolari</td><td>A31573</td><td>Da utilizzare in scala 1:200 per l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>Mezzi di montaggio (Vectorshield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 100 mm</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>a 24 pozzetti piastra</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Dumont #55</td></tr><tr><td>Vetrino VWR</td><td></td><td>48312-003</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 mm</td></tr><tr><td>Involucro di plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotomo</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per epifluorescenza</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Confocol</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di un modello di fegato fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti rigenerazione

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

La fibrosi epatica sostenuta con continuazione dell'accumulo di proteina della matrice extracellulare (ECM) provoca la perdita della competenza cellulare del fegato, portando alla cirrosi con disfunzione epatocellulare. Tra i molteplici insulti epatici, l'abuso di alcol può portare a significativi problemi di salute tra cui insufficienza epatica e carcinoma epatocellulare. Tuttavia, l'identità delle fonti cellulari endogene che rigenerano gli epatociti in risposta all'alcol non è stata adeguatamente studiata. Inoltre, pochi studi hanno modellato efficacemente la rigenerazione degli epatociti sul danno indotto dall'alcol. Recentemente abbiamo riportato la creazione di un modello di fegato fibrotico indotto da etanolo (EtOH) in zebrafish in cui le cellule progenitrici epatiche (HPC) hanno dato origine a epatociti in seguito a perdita quasi completa di epatociti in presenza di stimolo fibrogenico. Inoltre, attraverso screening chimici che utilizzano questo modello, abbiamo identificato diverse piccole molecole che migliorano la rigenerazione degli epatociti. Qui descriviamo in dettaglio le procedure per sviluppare un modello di fegato fibrotico indotto da EtOH e per eseguire screening chimici utilizzando questo modello nel pesce zebra. Questo protocollo sarà uno strumento fondamentale per delineare i meccanismi molecolari e cellulari di come gli epatociti si rigenerano nel fegato fibrotico. Inoltre, questi metodi faciliteranno la potenziale scoperta di nuove strategie terapeutiche per la malattia epatica cronica in vivo.

La figura 1 mostra lo sviluppo di un modello di fegato fibrotico EtOH indotta in zebrafish larvale. Per ottimizzare un protocollo per esporre le larve zebrafish di EtOH, in primo luogo abbiamo valutato la tossicità EtOH. 2,5 giorni post-fecondazione (DPF) larve sono stati esposti a concentrazioni EtOH 1%, 1,5%, o del 2% per 24 ore seguita da una 24 ore EtOH trattamento concomitante / MTZ. L&#39;esposizione al 2% EtOH causato alto tasso di mortalità, mentre quasi tutte le...

La fibrosi sostenuta con deposizione di proteine della matrice extracellulare eccessive porta alla cirrosi. L'abuso di alcol è una delle principali cause di gravi malattie del fegato. Abbiamo stabilito un modello di fegato fibrotico di zebrafish indotto da etanolo per studiare i meccanismi e le strategie di promozione della rigenerazione degli epatociti in seguito a danno indotto dall'alcol.

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire un modello di fegato fibrotico indotto da etanolo nel pesce zebra e di eseguire schermate chimiche utilizzando questo modello. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della rigenerazione epatica, come i meccanismi molecolari e cellulari attraverso cui gli epatociti si rigenerano nel fegato fibrotico.Il vantaggio principale di questa tecnica è che è economica e risparmia tempo nella schermatura chimica in vevo. Inoltre, un'analisi dettagliata nel tempo può essere eseguita mediante la visualizzazione di una singola cellula. A dimostrare la procedura saranno Mianbo Huang, un ricercatore postdottorato, e Jin Xu, uno studente laureando del laboratorio.Dopo aver preparato i reagenti secondo il protocollo descritto nel testo, allestire vasche per l'accoppiamento con divisori utilizzando Zebrafish transgenici adulti contenenti fatty acid binding protein 10a:CFP-NTR con Tp1:mCherry e Tg(hand2:EGFP)Zebrafish. La mattina seguente, due ore dopo la rimozione dei divisori, raccogliere le uova filtrando l'acqua del sistema e trasferendo gli embrioni in piastre di Petri da 100 millimetri contenenti mezzo per embrioni. A 56 ore dalla fecondazione, o HPF, aggiungere agli embrioni il 1,5 percento di etanolo.Utilizzare della pellicola di plastica per coprire le piastre ed evitare l'evaporazione dell'etanolo. Incubare quindi a 28 gradi Celsius per 24 ore. Preparare fresco il MTZ 15 millimolare e il mezzo per embrioni con DMSO 0,1 percento, aggiungendo etanolo fino a una concentrazione finale del 1,5 percento.Quindi, a 80 HPF, trattare gli embrioni ordinati con 20 millilitri di soluzione di etanolo MTZ per ogni piastra di Petri. Utilizzare della pellicola trasparente per coprire le piastre ed evitarne l'evaporazione, quindi ricoprirle con della stagnola per proteggerle dalla luce. Incubare successivamente a 28 gradi Celsius per 24 ore.Il giorno seguente, osservare gli embrioni al microscopio epifluorescente utilizzando un filtro CFP e un'ingrandimento di 80x per selezionare le larve con ablazione quasi completa degli epatociti. Per eseguire schermate chimiche, rimuovere le piastre a 96 pozzetti contenenti stock chimici di dieci millimolari in DMSO dal congelatore a meno 80 gradi. Utilizzare della carta d'alluminio per coprire le piastre ed evitare il degrado fotocatalitico dei composti, quindi scongelare delicatamente con movimenti oscillanti a temperatura ambiente.In tubi da 1,5 millilitro, preparare le soluzioni chimiche diluendo cinque microlitri di soluzioni stock da dieci millimolari con un millilitro di mezzo per embrioni, ottenendo una concentrazione finale di 50 micromolari. Successivamente, trasferire cinque larve per pozzetto, con ablazione epatocitaria quasi completa, in piastre a 24 pozzetti riempite con mezzo per embrioni. Quindi, rimuovere il mezzo per embrioni e aggiungere 500 microlitri delle soluzioni chimiche in ciascun pozzetto.Coprire le piastre con carta d'alluminio e incubare le larve a 28 °C per 50 ore. Al termine dell'incubazione, osservare il numero e/o l'intensità degli epatociti esprimenti CFP al microscopio epifluorescente con un ingrandimento di 80x. Acquisire immagini di larve vive che mostrano un numero aumentato o ridotto e/o un'intensità alterata di epatociti esprimenti CFP.Impostare gli incroci di Zebrafish transgenici contenenti la proteina legante gli acidi grassi 10a:CFP-NTR con TP1:mCherry ed allevare le larve selezionate fino all'età di sei-dodici mesi. Utilizzare una rete per trasferire gli Zebrafish transgenici adulti nei serbatoi di accoppiamento. Preparare al momento un'etanolo al uno percento in acqua di sistema, quindi utilizzare 500 millilitri della soluzione per sostituire l'acqua di sistema nei serbatoi di accoppiamento.Incubare i contenitori a 28 gradi Celsius per 72 ore, trasferendo i pesci in una soluzione fresca di etanolo e rimuovendo ogni giorno i pesci morti durante l'incubazione. Preparare una soluzione fresca di MTZ 10 millimolare in acqua del sistema con il 0,1 percento di DMSO, quindi aggiungere 500 millilitri di soluzione di MTZ preriscaldata ai pesci in contenitori da accoppiamento da un litro. Coprire i contenitori con carta d'alluminio.Incubare a 28 gradi Celsius per otto ore e analizzare secondo il protocollo indicato nel testo. Dopo aver anestetizzato secondo il protocollo indicato nel testo, esporre gli organi gastrointestinali utilizzando le forbici per tagliare la pelle e il muscolo sottostante lungo l'addome, dalla pinna anale all'opercolo. Successivamente, effettuare un taglio posteriore lungo il fianco del pesce fino alla pinna anale.Posizionare il pesce in un tubo conico da quindici millilitri e lavare una volta con PBS. Quindi rimuovere il PBS e aggiungere quattro millilitri di formaldeide al tre percento appena preparata in tampone PEM. Incubare a quattro gradi Celsius per tutta la notte per fissare il pesce.Il giorno seguente, dopo aver lavato i campioni secondo il protocollo indicato nel testo, tagliare l'esofago per dissezionare l'intero tratto intestinale con il fegato dalla cavità corporea. Successivamente, posizionare gli organi gastrointestinali in uno stampo per sezionamento e utilizzare agarosio al quattro percento a basso punto di fusione per includere il tessuto. Poi, modellare il blocco in forma trapezoidale e incollarlo alla base.Quindi, utilizzare un vibratomo e, a partire dall'estremità interna del tessuto, tagliare campioni in sezioni trasversali a intervalli di cinquanta micrometri in PBS ghiacciato. Utilizzare un pennello di numero uno per trasferire le sezioni in una piastra a sei pozzetti contenente PBS. Dopo aver eseguito l'immunomarcatura delle sezioni secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare un pennello di numero uno per trasferire delicatamente le sezioni su vetrini in vetro.Utilizzare salviette in carta kimwipe per rimuovere l'eccesso di PBS prima di aggiungere una goccia di mezzo di montaggio e un coprioggetto. Quindi sigillare il coprioggetto con smalto per unghie. Infine, utilizzando un sistema confocale dotato di un obiettivo ad olio 40x 1.3 NA, acquisire immagini in Z-Stack con intensità compresa tra il 20 e il 50 percento e intervalli di un microamperometro.Questa figura mostra che le larve trattate con MTZ in etanolo sviluppano una curvatura verso l'alto del tronco e della coda, edema pericardico e mancata inflazione della vescica natatoria. Come mostrato qui, i fegati di controllo trattati con DMSO non hanno mostrato depositi di collagene di tipo uno di tipo fibulare. Al contrario, i fegati trattati con MTZ in etanolo hanno mostrato un accumulo elevato di collagene di tipo uno a 25 e 50 ore dopo l'ablazione.Inoltre, rispetto ai fegati di controllo trattati con DMSO, le HSC sono aumentate di numero e hanno assunto una forma simile a quella dei miofibroblasti, priva di prolungamenti citoplasmatici, nei fegati rigeneranti trattati con etanolo e MTZ. Questa figura mostra lo sviluppo di un modello di fegato fibrotico indotto dall'etanolo in Zebrafish adulti trattati con l'uno percento di etanolo seguito da MTZ. Da queste analisi nel tempo, è stata osservata una deposizione significativamente maggiore di collagene di tipo uno nei fegati rigeneranti trattati con etanolo e MTZ a due, tre e quattro giorni dall'ablazione, rispetto ai fegati trattati con DMSO.In questo esperimento di screening chimico, gli epatociti sono stati ablato in presenza di etanolo allo 1,5 percento e 15 millimolare di MTZ. Successivamente, le larve sono state esposte a sostanze chimiche per 50 ore. Diversi agonisti della via Wnt, come gli inibitori della glicogeno sintasi chinasi-3 e un attivatore di Wnt, hanno favorito la rigenerazione degli epatociti rispetto al DMSO.Questi dati suggeriscono che questo modello fibrotico sostenuto fornisce uno strumento indispensabile per scoprire molecole piccole in grado di potenziare la rigenerazione degli epatociti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di ottenere un'ablazione quasi completa degli epatociti e di mantenere costante la concentrazione di etanolo per tutta la durata della procedura.Seguendo questa procedura, l'efficacia dei composti chimici identificati può essere testata in modelli di danno epatico nei mammiferi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potrà aprire nuove strade nel campo della terapia rigenerativa cellulare, esplorando il potenziale di scoprire nuove strategie terapeutiche per i pazienti affetti da insufficienza epatica cronica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sviluppare un modello epatico fibrotico indotto da etanolo nel pesce zebra e di come eseguire schermate chimiche.Ricordare che lavorare con formaldeide può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come indossare guanti e manipolare il reagente in una cappa chimica, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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