Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire un modello di fegato fibrotico indotto da etanolo nel pesce zebra e di eseguire schermate chimiche utilizzando questo modello. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della rigenerazione epatica, come i meccanismi molecolari e cellulari attraverso cui gli epatociti si rigenerano nel fegato fibrotico.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è economica e risparmia tempo nella schermatura chimica in vevo. Inoltre, un'analisi dettagliata nel tempo può essere eseguita mediante la visualizzazione di una singola cellula. A dimostrare la procedura saranno Mianbo Huang, un ricercatore postdottorato, e Jin Xu, uno studente laureando del laboratorio.

Dopo aver preparato i reagenti secondo il protocollo descritto nel testo, allestire vasche per l'accoppiamento con divisori utilizzando Zebrafish transgenici adulti contenenti fatty acid binding protein 10a:CFP-NTR con Tp1:mCherry e Tg(hand2:EGFP)Zebrafish. La mattina seguente, due ore dopo la rimozione dei divisori, raccogliere le uova filtrando l'acqua del sistema e trasferendo gli embrioni in piastre di Petri da 100 millimetri contenenti mezzo per embrioni. A 56 ore dalla fecondazione, o HPF, aggiungere agli embrioni il 1,5 percento di etanolo.

Utilizzare della pellicola di plastica per coprire le piastre ed evitare l'evaporazione dell'etanolo. Incubare quindi a 28 gradi Celsius per 24 ore. Preparare fresco il MTZ 15 millimolare e il mezzo per embrioni con DMSO 0,1 percento, aggiungendo etanolo fino a una concentrazione finale del 1,5 percento.

Quindi, a 80 HPF, trattare gli embrioni ordinati con 20 millilitri di soluzione di etanolo MTZ per ogni piastra di Petri. Utilizzare della pellicola trasparente per coprire le piastre ed evitarne l'evaporazione, quindi ricoprirle con della stagnola per proteggerle dalla luce. Incubare successivamente a 28 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno seguente, osservare gli embrioni al microscopio epifluorescente utilizzando un filtro CFP e un'ingrandimento di 80x per selezionare le larve con ablazione quasi completa degli epatociti. Per eseguire schermate chimiche, rimuovere le piastre a 96 pozzetti contenenti stock chimici di dieci millimolari in DMSO dal congelatore a meno 80 gradi. Utilizzare della carta d'alluminio per coprire le piastre ed evitare il degrado fotocatalitico dei composti, quindi scongelare delicatamente con movimenti oscillanti a temperatura ambiente.

In tubi da 1,5 millilitro, preparare le soluzioni chimiche diluendo cinque microlitri di soluzioni stock da dieci millimolari con un millilitro di mezzo per embrioni, ottenendo una concentrazione finale di 50 micromolari. Successivamente, trasferire cinque larve per pozzetto, con ablazione epatocitaria quasi completa, in piastre a 24 pozzetti riempite con mezzo per embrioni. Quindi, rimuovere il mezzo per embrioni e aggiungere 500 microlitri delle soluzioni chimiche in ciascun pozzetto.

Coprire le piastre con carta d'alluminio e incubare le larve a 28 °C per 50 ore. Al termine dell'incubazione, osservare il numero e/o l'intensità degli epatociti esprimenti CFP al microscopio epifluorescente con un ingrandimento di 80x. Acquisire immagini di larve vive che mostrano un numero aumentato o ridotto e/o un'intensità alterata di epatociti esprimenti CFP.

Impostare gli incroci di Zebrafish transgenici contenenti la proteina legante gli acidi grassi 10a:CFP-NTR con TP1:mCherry ed allevare le larve selezionate fino all'età di sei-dodici mesi. Utilizzare una rete per trasferire gli Zebrafish transgenici adulti nei serbatoi di accoppiamento. Preparare al momento un'etanolo al uno percento in acqua di sistema, quindi utilizzare 500 millilitri della soluzione per sostituire l'acqua di sistema nei serbatoi di accoppiamento.

Incubare i contenitori a 28 gradi Celsius per 72 ore, trasferendo i pesci in una soluzione fresca di etanolo e rimuovendo ogni giorno i pesci morti durante l'incubazione. Preparare una soluzione fresca di MTZ 10 millimolare in acqua del sistema con il 0,1 percento di DMSO, quindi aggiungere 500 millilitri di soluzione di MTZ preriscaldata ai pesci in contenitori da accoppiamento da un litro. Coprire i contenitori con carta d'alluminio.

Incubare a 28 gradi Celsius per otto ore e analizzare secondo il protocollo indicato nel testo. Dopo aver anestetizzato secondo il protocollo indicato nel testo, esporre gli organi gastrointestinali utilizzando le forbici per tagliare la pelle e il muscolo sottostante lungo l'addome, dalla pinna anale all'opercolo. Successivamente, effettuare un taglio posteriore lungo il fianco del pesce fino alla pinna anale.

Posizionare il pesce in un tubo conico da quindici millilitri e lavare una volta con PBS. Quindi rimuovere il PBS e aggiungere quattro millilitri di formaldeide al tre percento appena preparata in tampone PEM. Incubare a quattro gradi Celsius per tutta la notte per fissare il pesce.

Il giorno seguente, dopo aver lavato i campioni secondo il protocollo indicato nel testo, tagliare l'esofago per dissezionare l'intero tratto intestinale con il fegato dalla cavità corporea. Successivamente, posizionare gli organi gastrointestinali in uno stampo per sezionamento e utilizzare agarosio al quattro percento a basso punto di fusione per includere il tessuto. Poi, modellare il blocco in forma trapezoidale e incollarlo alla base.

Quindi, utilizzare un vibratomo e, a partire dall'estremità interna del tessuto, tagliare campioni in sezioni trasversali a intervalli di cinquanta micrometri in PBS ghiacciato. Utilizzare un pennello di numero uno per trasferire le sezioni in una piastra a sei pozzetti contenente PBS. Dopo aver eseguito l'immunomarcatura delle sezioni secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare un pennello di numero uno per trasferire delicatamente le sezioni su vetrini in vetro.

Utilizzare salviette in carta kimwipe per rimuovere l'eccesso di PBS prima di aggiungere una goccia di mezzo di montaggio e un coprioggetto. Quindi sigillare il coprioggetto con smalto per unghie. Infine, utilizzando un sistema confocale dotato di un obiettivo ad olio 40x 1.3 NA, acquisire immagini in Z-Stack con intensità compresa tra il 20 e il 50 percento e intervalli di un microamperometro.

Questa figura mostra che le larve trattate con MTZ in etanolo sviluppano una curvatura verso l'alto del tronco e della coda, edema pericardico e mancata inflazione della vescica natatoria. Come mostrato qui, i fegati di controllo trattati con DMSO non hanno mostrato depositi di collagene di tipo uno di tipo fibulare. Al contrario, i fegati trattati con MTZ in etanolo hanno mostrato un accumulo elevato di collagene di tipo uno a 25 e 50 ore dopo l'ablazione.

Inoltre, rispetto ai fegati di controllo trattati con DMSO, le HSC sono aumentate di numero e hanno assunto una forma simile a quella dei miofibroblasti, priva di prolungamenti citoplasmatici, nei fegati rigeneranti trattati con etanolo e MTZ. Questa figura mostra lo sviluppo di un modello di fegato fibrotico indotto dall'etanolo in Zebrafish adulti trattati con l'uno percento di etanolo seguito da MTZ. Da queste analisi nel tempo, è stata osservata una deposizione significativamente maggiore di collagene di tipo uno nei fegati rigeneranti trattati con etanolo e MTZ a due, tre e quattro giorni dall'ablazione, rispetto ai fegati trattati con DMSO.

In questo esperimento di screening chimico, gli epatociti sono stati ablato in presenza di etanolo allo 1,5 percento e 15 millimolare di MTZ. Successivamente, le larve sono state esposte a sostanze chimiche per 50 ore. Diversi agonisti della via Wnt, come gli inibitori della glicogeno sintasi chinasi-3 e un attivatore di Wnt, hanno favorito la rigenerazione degli epatociti rispetto al DMSO.

Questi dati suggeriscono che questo modello fibrotico sostenuto fornisce uno strumento indispensabile per scoprire molecole piccole in grado di potenziare la rigenerazione degli epatociti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di ottenere un'ablazione quasi completa degli epatociti e di mantenere costante la concentrazione di etanolo per tutta la durata della procedura.

Seguendo questa procedura, l'efficacia dei composti chimici identificati può essere testata in modelli di danno epatico nei mammiferi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potrà aprire nuove strade nel campo della terapia rigenerativa cellulare, esplorando il potenziale di scoprire nuove strategie terapeutiche per i pazienti affetti da insufficienza epatica cronica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sviluppare un modello epatico fibrotico indotto da etanolo nel pesce zebra e di come eseguire schermate chimiche.

Ricordare che lavorare con formaldeide può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come indossare guanti e manipolare il reagente in una cappa chimica, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.