Name: Preparazione e analisi di In Vitro Tridimensionale carcinoma mammario mondo dei replicanti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Impara a generare surrogati tridimensionali di carcinoma mammario in vitro e a misurare la densità cellulare nelle sezioni istologiche. Questo metodo utilizza bioreattori a perfusione per modellare il comportamento cellulare in modo fisiologicamente rilevante.

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L'Università dell'Alabama presso il Birmingham Center for Metabolic Bone Disease ha eseguito l'elaborazione istologica e il sezionamento dei surrogati. Southern Research (Birmingham, AL) ha fornito supporto per la produzione del sistema di bioreattore. Il finanziamento è stato fornito dal Programma di ricerca sul cancro al seno (BC121367 del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti.

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<li>Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+in+tumor+microenvironment+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).</li>
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<li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+fibroblasts+modulate+epithelial+cell+proliferation+in+three-dimensional+in+vitro+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture.</a> Breast Cancer Res. 4, (2004).</li>
<li>Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+perfusion+of+cell+suspensions+through+three-dimensional+scaffolds+enhances+cell+seeding+efficiency+and+uniformity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).</li>
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<li>Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+foams+with+functional+nanocomposite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Polymeric foams with functional nanocomposite cells.</a> RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).</li>
<li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+matrix+constituents+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).</li>
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<li>Varsegi, G. M., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Block+Preparation+from+Cytology+Specimen+with+Predominance+of+Individually+Scattered+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells.</a> J Vis Exp. (29), e1316(2009).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui, un metodo di coltura 3D è stato descritto che incorpora i componenti del microambiente tissutale, tra la matrice extracellulare (ECM) e fibroblasti stromali umane, in un volume che modelli più strettamente carcinoma mammario umano per consentire lo sviluppo di una morfologia 3D riepilogativo . Il metodo di coltura 3D descritto è più rappresentativo delle malattie umane di coltura cellulare in 2D tradizionale in quanto più tipi di cellule sono incorporati in un volume 3D di ECM. E &#39;stato osservato che questi par...

Tridimensionale modelli (3D) cultura che imitano in modo più accurato l&#39;architettura tumorale e microambiente in vivo sono importanti per gli studi volti a sezionare le complesse interazioni tra le cellule e il loro microambiente e per testare l&#39;efficacia delle terapie candidati. Tumore impatti dimensionalità ossigeno e gradienti di nutrienti, l&#39;uniformità di esposizione al farmaco, interstiziale flusso di pressione / del sangue, e l&#39;architettura 3D 1-4. La presenza di un adeguato microambiente stromale contribuisce tumore dimensionalità e influenze segnalazione cellulare-ECM e segnalazione paracrina tra cellule stromali e cellule epiteliali maligne. Gli effetti della dimensionalità tumorale e il microambiente sulla funzione cellulare sono ben stabiliti, con entrambi i fattori che alterano la risposta ai farmaci 1,3,5-8. Inoltre, la cinetica cellulari crescita, tassi metabolici e segnalazione cellulare differiscono tra due dimensioni (2D) la cultura e la cultura in 3D, con questi fattori affecting risposta cellulare 1,3,8-10. In vitro, il microambiente tumorale surrogata può essere modulata includendo componenti ECM rappresentative e popolazioni di cellule stromali. Cellule epiteliali maligne sono influenzati dalla ECM e cellule stromali cancro-associata sia in modo sinergico / protettivo per promuovere la progressione del tumore o in maniera soppressiva per inibire ulteriormente 5,6,10 tumorale propagazione. In entrambi i contesti, lo stroma può influenzare la risposta terapeutica e somministrazione di farmaci mediante segnali paracrini e / o aumentando la pressione interstiziale nel tumore conseguente diminuzione drug delivery 1,6. Pertanto, l&#39;aggiunta di ECM e cellule stromali in modelli preclinici aiuterà Ricapitolando aspetti del tumore che non può essere modellato bene in coltura 2D. Qui un metodo per stabilire surrogati del cancro al seno che incorporano un microambiente riepilogativo, tra cui componenti ECM e scellule tromal, in un volume 3D è descritto. Nel carcinoma mammario, la popolazione di cellule stromali è prevalentemente composto di cancro associato fibroblasti (CAF) e l&#39;ECM stromale è in gran parte composto da collagene di tipo I, con una minore percentuale di componenti della matrice che si trovano nella membrana basale, tra cui laminina e collagene di tipo IV 1,4,11-13. Pertanto, questi componenti del microambiente carcinoma della mammella (cioè, CAF, collagene I, e membrana basale) sono stati incorporati nei surrogati. Questo metodo può essere utilizzato per generare solido, surrogati 3D non-perfusi (Figura 1A) o può essere adattato per includere perfusione del mezzo attraverso il surrogato tramite un sistema di bioreattore (Figura 1B). Entrambi gli approcci sono descritte qui. Questo metodo potrebbe anche essere modificato per includere altri elementi stromali, come macrofagi associati al tumore, o per modellare altri tumori solidi regolando i componenti cellulari e ECM, come appropriato. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Per il surrogato carcinoma mammario qui descritto, abbiamo utilizzato la MDA-MB-231 (231) la linea del seno delle cellule del cancro, CAF precedentemente isolato da carcinoma mammario umano 14, e un ECM composto da 90% di collagene I ( fattore di crescita materiale 6 mg / ml) e 10% ridotta membrana basale (BM). Il surrogata o è coltivato in 8 pozzetti slitta camera (surrogato solido) oppure un sistema bioreattore viene utilizzato per fornire perfusione continue dei nutrienti (surrogato perfuso). Qualsiasi sistema di perfusione bioreattore che può ospitare un volume di cellule ECM contenente può essere utilizzato 15. A titolo di esempio, si descrive la preparazione dei surrogati dei tessuti nel nostro sistema bioreattore. Questo sistema è stato sviluppato internamente e non è disponibile in commercio. Perché la nostra attenzione è rivolta alla preparazione e l&#39;analisi dei surrogati del tessuto 3D, non siamo andati in ampio dettaglio per quanto riguarda le specifiche di fabbricazione e montaggio del nostro sistema bioreattore. Tuttavia, una descrizione dettagliata diquesto sistema e il suo sviluppo è stato pubblicato 16. In questo sistema bioreattore, un canale di flusso polidimetilsilossano (PDMS) viene utilizzato per ospitare il surrogato, che è supportato da una schiuma PDMS (formato usando metodi simili a quelli descritti da Calcagnile et al. 17). Questo volume è penetrato da 4 microcanali (ogni 400 micron di diametro) che vengono continuamente perfusi da media tramite una pompa microphysiologic per la fornitura di ossigeno e sostanze nutritive per la surrogata. analisi appropriata dei surrogati è fondamentale per ottenere informazioni pertinenti per quanto riguarda la funzione cellulare in risposta al trattamento o di altre manipolazioni. Surrogati possono essere analizzati con vari metodi tra cui l&#39;imaging diretto di surrogati intatte usando la microscopia confocale o altri mezzi di imaging non invasiva, analisi cellulare indiretta analizzando i media condizionata, o perfusato, per i prodotti secreti, o analisi su sezioni istologiche dopo la fissazione e di trasformazione aparaffina. Una tale parametro che può essere valutata su sezioni istologiche è densità cellulare. Presentiamo un metodo per misurare la densità delle cellule (cioè, il numero di cellule nucleate per area sezione) utilizzando tecniche di elaborazione di immagini semi-automatizzato applicati alle microfotografie di sezioni istologiche surrogati colorate con ematossilina ed eosina (H &amp; E). La densità cellulare può essere utilizzato come indicatore della variazione relativa del numero di cellule nel tempo o risultante da diverse condizioni di crescita e trattamenti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54004/54004fig1.jpg" /> Figura volume 1. 3D e sistema di bioreattore. A) Schema del processo di generare surrogati 3D solidi. Top: cartone animato di volume di solido 3D contenente ECM (rosa), cellule di carcinoma epiteliali (di colore giallo), e CAF (arancione); In basso:. Vista dall&#39;alto di 8 pozzetti scivolo camera contenente surrogati B) Schema del processo per generare perfuso surrogati 3D. Top: cartoon di volume 3D con canali per consentire mezzo di perfusione e contenente ECM (rosa), cellule di carcinoma epiteliali (giallo), e CAF (arancione); Al centro: immagine di canale di flusso PDMS contenente PDMS schiuma (freccia nera) da iniettare con cella + ECM e penetrato da fili di acciaio inossidabile con rivestimento polimerico (freccia rosa), di 400 micron di diametro; In basso:. Immagine del canale di flusso PDMS contenente un surrogato e collegato al sistema di bioreattore per consentire continuo perfusione media (pompa peristaltica e serbatoio media non mostrato) C) Immagini di fasi di lavorazione per entrambi surrogati solidi e perfusi dopo coltura. A sinistra: immagine del cryomold contenente campioni di elaborazione gel e surrogati; Al centro: immagine di un blocco di paraffina contenente un surrogato fisso ed elaborati; A destra:. Immagine di un vetrino con una sezione istologica H &amp; E-macchiato di un surrogato <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un</a>grande versione di questa figura.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM)</td><td>Corning CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina + 2,21&nbsp; mM EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale, 100&nbsp; mm</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229620</td><td>Piastre sterili</td></tr><tr><td>per colture tissutali, 35&nbsp; mm</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229638</td><td>Per la formazione di schiuma PDMS&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetta in vetro da 9"</td><td>Fisher</td><td>13-678-20D</td><td>Pipetta sterile</td></tr><tr><td>da 10 ml</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229210B</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>1.000 & micro; l punte per piptette</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-166</td><td>Sterile Filtrato</td></tr><tr><td>200 &; l puntali per pipette</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-141</td><td>Sterile Filtrato 10</td></tr><tr><td>&; l puntali per pipette</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-158</td><td>Provette coniche da</td></tr><tr><td>15 ml</td> filtrate sterili <td>CellTreat Scientific Products</td><td>229410</td><td>Provette coniche sterili</td></tr><tr><td>da 50 ml</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229422</td><td>Provette per</td></tr><tr><td>microcentrifuga sterili da 1,5 ml</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td>Trypan</td></tr><tr><td>blue</td><td>sterile Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td>sterile</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>24236-10</td><td>PDMS elastomero e agente indurente. Utilizzato per il nostro bioreattore interno.</td></tr><tr><td>Schiuma</td><td></td><td></td> PDMS <td>Prodotta internamente per l'uso nel nostro bioreattore interno.</td></tr><tr><td>Collagene bovino ad alta concentrazione di tipo I</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5133-A</td><td>FibriCol ~10 mg/ml</td></tr><tr><td>Fattore di crescita ridotto Matrigel (membrana basale)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Materiale della membrana basale</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado di biologia molecolare</td><td>Fisher</td><td>BP2819-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 10x&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di scorrimento a camera Nunc Lab-Tek&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>177402</td> Bioreattore <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> a 8 pozzetti <td>realizzato internamente.</td></tr><tr><td>Ritorno elastico in acciaio inossidabile 304 Rivestito con fili</td> di acciaio inossidabile <td>McMaster-Carr</td><td>1749T19</td> in polimero PTFE <td>per generare microcanali nel nostro sistema di bioreattore interno.</td></tr><tr><td>Tubo della pompa in silicone polimerizzato al platino BioPharm Plus</td> da 0,016" di diametro, L/S 14 <td>Masterflex</td><td>EW-96440-14</td><td>Per l'uso nel nostro sistema di bioreattore interno. ID tubo: 1,6 mm, dimensione portagomma: 1/16 poll.</td></tr><tr><td>Set di tubi a 2 fermi, PVC non svasato, 1,52&nbsp; mm ID</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>EW-74906-36</td><td>Per l'uso nel nostro sistema di bioreattore interno (con pompa microperistalitica).&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro pompa peristaltica di precisione a sei canali</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74906-04</td><td>Da utilizzare con il nostro sistema di bioreattori interno</td></tr><tr><td>Siringhe per tubercolina</td><td>BD Medical</td><td>309625</td><td>ago calibro 26 da 3/8 pollici; Pinze</td></tr><tr><td>sterili per tessuti da dissezione</td><td>FisherBrand</td><td>13-812-36</td> Mini rotatore per tubi da <td>5,5 pollici</td></tr><tr><td></td><td>Boekel Scientific</td><td>260750</td><td>Opzione attrezzatura per la rotazione surrogata. Utilizzato con giostra per provette da 50 ml (numero di modello 260753)</td></tr><tr><td>Carosello per provette da 50 ml</td><td>Boekel Scientific</td><td>260753</td><td>Utilizzato con mini rotatore per provette</td></tr><tr><td>Bambino&nbsp; Forno di ibridazione</td><td>Boekel Scientific</td><td>230301</td><td>Opzione di attrezzatura per la rotazione surrogata</td></tr><tr><td>Gel per l'elaborazione dei campioni</td><td>HistoGel Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>Gel per l'elaborazione dei campioni descritto nel passaggio 5.2</td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Andwin Scientific</td><td>4566</td><td>15 mm x 15 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Marcatura dei tessuti Colorante Cancer</td><td>Diagnostics, inc.</td><td>03000P</td><td>Può essere utilizzato per marcare i surrogati,&nbsp; consentendo di includere più campioni in una cassetta di tessuto&nbsp;</td></tr><tr><td>Cassette di tessuto incernierate&nbsp;</td><td>FisherBrand</td><td>22-272-416</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Fisher</td><td>23-245-685</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini in vetro semplice GoldSeal</td><td>Thermo Scientific</td><td>3048-002</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 200 proof (100%), USP</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7211</td><td></td></tr><tr><td>Clarifier</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7401</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione azzurrante</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL montaggio media</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>83124</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione e analisi di<em&gt; in vitro</em&gt; tridimensionale carcinoma mammario mondo dei replicanti

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Tridimensionale (3D) cultura è un metodo più fisiologicamente rilevanti per modellare il comportamento delle cellule in vitro di due coltura dimensionale. I carcinomi, tra carcinomi mammari, sono tessuti 3D complessi composti da cellule epiteliali cancro e componenti stromali, tra cui fibroblasti e la matrice extracellulare (ECM). Tuttavia la maggior parte modelli in vitro di carcinoma mammario costituiti solo da cellule epiteliali cancerose, omettendo lo stroma e, di conseguenza, l&#39;architettura 3D di un tumore in vivo. Appropriata modellazione 3D del carcinoma è importante per la comprensione accurata della biologia del tumore, il comportamento e la risposta alla terapia. Tuttavia, la durata della cultura e volume di modelli 3D è limitata dalla disponibilità di ossigeno e nutrienti all&#39;interno della cultura. Qui, dimostriamo un metodo in cui le cellule di carcinoma mammario epiteliali e fibroblasti stromali sono incorporati in ECM per generare un surrogato cancro al seno 3D che include stroma e possono essere coltivate comestruttura 3D solido o utilizzando un sistema di bioreattore perfusione di fornire ossigeno e nutrienti. Dopo l&#39;installazione e un periodo di crescita iniziale, surrogati possono essere utilizzati per il test della droga preclinica. In alternativa, i componenti cellulari e matrice della surrogata possono essere modificati per risolvere una varietà di questioni biologiche. Dopo coltura, surrogati sono fissi ed elaborati per paraffina, in modo simile al trattamento di campioni di carcinoma mammario clinica, per la valutazione dei parametri di interesse. La valutazione di un tale parametro, la densità di cellule presenti, è spiegato, dove sono applicati ai microfotografie di sezioni istologiche di surrogati sistemi software di analisi di immagine ImageJ e CellProfiler di quantificare il numero di cellule nucleate per area. Questo può essere usato come un indicatore della variazione del numero di cellule nel tempo o la variazione del numero di cellule risultanti da diverse condizioni di crescita e trattamenti.

Entrambi surrogati di cancro al seno in 3D solidi e irrorati sono stati preparati come descritto sopra e alla produzione di 7 giorni. Successivamente, surrogati sono stati fissati, elaborati per paraffina, sezionati e colorati con ematossilina ed eosina, come descritto sopra. Il numero di cellule nucleate per area (sia 231 cellule e CAF) di ciascun surrogata è stata misurata. Come si vede nella figura 12, microfotografie rappresentativi delle sezioni H colorati con EE di...

Dimostriamo un metodo per generare surrogati 3D del cancro al seno, che possono essere coltivati utilizzando un sistema di bioreattori di perfusione per fornire ossigeno e sostanze nutritive. Dopo la crescita, i surrogati vengono fissati e trasformati in paraffina per la valutazione dei parametri di interesse. Viene spiegata la valutazione di uno di questi parametri, la densità cellulare.

Preparazione e analisi di<em&gt; In Vitro</em&gt; Tridimensionale carcinoma mammario mondo dei replicanti

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

L'obiettivo generale di questo insieme di procedure è generare colture cellulari tridimensionali da utilizzare come surrogati del cancro al seno in vitro e presentare un metodo per misurare la crescita cellulare in sezioni istologiche dei surrogati. La coltura cellulare tridimensionale è un metodo più fisiologicamente rilevante per modellare il comportamento cellulare in vitro rispetto alla coltura cellulare bidimensionale. Modificando la composizione cellulare nelle condizioni sperimentali, questo insieme di procedure può essere adattato per affrontare una varietà di domande biologiche e per valutare l'efficacia di potenziali terapie. Per incorporare le cellule nella matrice extracellulare (ECM), aggiungere su ghiaccio le cellule e i primi quattro componenti correlati elencati nella tabella uno del manoscritto allegato in una provetta microcentrifuga da due millimetri. Successivamente, mescolare delicatamente mediante pipettaggio, evitando la formazione di bolle. Monitorare il livello di pH utilizzando il rosso fenolo nel MEM 10XD per assicurarsi che la miscela presenti un colore rosa-arancio, indicativo di un pH pari a sette.Se la miscela appare gialla e il pH è troppo basso, aggiungere lentamente il bicarbonato di sodio al 7,5 percento, una goccia alla volta, fino a raggiungere il colore appropriato. Ricordare di mantenere la miscela sul ghiaccio e lavorare rapidamente per evitare la polimerizzazione prematura della matrice extracellulare (ECM). Per colture 3D solide, mantenere la camera per colture su vetrino sul ghiaccio per prevenire la polimerizzazione prematura della ECM.Pipettare lentamente 100 microlitri della miscela cellulare di ECM in ciascun pozzetto della camera da coltura a otto pozzetti, e pipettare la miscela cellulare di ECM lungo i bordi del pozzetto per favorire una migliore distribuzione della miscela. Successivamente, incubare i surrogati a 37 gradi Celsius, 5 percento di CO2, per 45 minuti per consentire la polimerizzazione dell'ECM. Dopo quarantacinque minuti, aggiungere 100 microlitri di mezzo di coltura in ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius e 5 percento di CO2 per tutta la durata dell'esperimento.Cambiare il mezzo di coltura ogni due giorni. Un limite della coltura 3D è che la diffusione di ossigeno e nutrienti all'interno del volume potrebbe essere inadeguata a mantenere la vitalità cellulare. L'aggiunta di un sistema bioreattore potrebbe aiutare a superare questo limite e migliorare la crescita.Per perfondere colture 3D in un sistema di biorreattore, preparare e assemblare in modo sterile la parte del sistema di biorreattore che ospita i surrogati. All'interno di una cappa a flusso laminare, utilizzando una siringa con un ago da 26 gauge, iniettare la miscela di cellule e matrice extracellulare nell'area del biorreattore a perfusione progettata per contenere le cellule, quindi procedere rapidamente al passaggio successivo. Per garantire una distribuzione più uniforme delle cellule all'interno dei surrogati, posizionare il componente del biorreattore che contiene i surrogati in un tubo conico da 50 millilitri.Ruotare continuamente i surrogati a 18 giri al minuto durante l'incubazione a 37 gradi Celsius in un fornetto per ibridazione in situ o in un incubatore per 45 minuti, per consentire la polimerizzazione della matrice extracellulare (ECM). Dopo la polimerizzazione e l'aggiunta del mezzo, collegare l'assemblaggio del bioreattore alla pompa. Avviare la perfusione del mezzo in un incubatore a 37 gradi Celsius, con il 5 percento di CO2.Continuare la perfusione del mezzo per tutta la durata dell'esperimento e cambiare il mezzo di coltura secondo le esigenze del disegno sperimentale specifico. Alla fine dell'esperimento, racchiudere i surrogati in un gel per l'elaborazione dei campioni per mantenere i surrogati integri durante l'elaborazione ed agevolare il sezionamento istologico. Per fare ciò, sciogliere il gel per l'elaborazione dei campioni in un bagno d'acqua a 60 gradi Celsius fino al momento dell'uso.Quindi, pipettare circa 300 microlitri di gel per l'elaborazione del campione nel fondo di uno stampo criogenico etichettato. Utilizzando una lama di bisturi e pinzette, rimuovere con attenzione un surrogato dal bioreattore o dal pozzetto di una camera a otto pozzetti e posizionarlo negli stampi criogenici contenenti il gel per l'elaborazione del campione. Pipettare circa 300 microlitri di gel per l'elaborazione del campione per ricoprire il surrogato nello stampo criogenico.Quindi, incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Una volta che il gel di elaborazione del campione si è solidificato, rimuovere il gel di elaborazione del campione contenente il surrogato dal cryomold e posizionarlo in una cassetta per tessuti. Se più di un surrogato deve essere inserito nella stessa cassetta per tessuti, possono essere utilizzati coloranti per la marcatura dei tessuti per distinguere i campioni dopo la fissazione e l'elaborazione.Successivamente, posizionare la cassetta dei tessuti contenente il surrogato nella soluzione tamponata neutra al dieci percento per dieci-dodici ore a temperatura ambiente, in modo da consentire una fissazione completa. Al termine della fissazione, trasferire la cassetta dei tessuti contenente il surrogato nell'etanolo al settanta percento. Il surrogato fissato è ora pronto per essere processato in paraffina e successivamente sezionato per l'esame istologico.Per misurare la densità cellulare e ottenere immagini fotomicroscopiche di sezioni colorate con ematossilina ed eosina, aprire un file immagine del surrogato. Utilizzando lo strumento Poligono in ImageJ e i margini della matrice extracellulare come guida, delimitare l'area del surrogato trascinando il mouse e facendo clic per creare punti di ancoraggio. Una volta delimitata, selezionare Misura nella scheda Analizza.Successivamente, caricare i file delle immagini utilizzati per misurare l'area surrogata in Cell Profiler trascinando i file immagine nell'elenco dei file. Quindi, assegnare un nome a ciascuna immagine importata nel modulo Importa nomi e tipi e selezionare il tipo di immagine. Dopo aver generato la pipeline di analisi, avviare la modalità di prova e fare clic su Esegui in Cell Profiler.E valutare gli oggetti filtrati per assicurarsi che la maggior parte dei nuclei nell'immagine di prova sia correttamente identificata e che siano stati scelti i parametri ottimali per l'identificazione delle cellule. I nuclei inclusi verranno cerchiati in verde. Successivamente, salvare il progetto, uscire dalla modalità di prova e fare clic su Analizza immagini.Qui è mostrata un'immagine rappresentativa della sezione colorata con ematossilina ed eosina proveniente da un surrogato perfuso coltivato per sette giorni. E questa è un'immagine rappresentativa della sezione colorata con ematossilina ed eosina proveniente da un surrogato solido coltivato per sette giorni, con cambio del mezzo ogni due giorni. La cellularità è molto più bassa nei surrogati solidi.Questo grafico mostra il confronto del numero medio di cellule nucleate per area dopo sette giorni di crescita. Un surrogato perfuso e solido. Questi dati numerici supportano la cellularità nelle microfotografie delle sezioni colorate con ematossilina ed eosina.E questo grafico mostra il confronto tra l'indice di marcatura Ki-67, che rappresenta la misura della proliferazione cellulare dopo sette giorni di crescita di surrogati perfusi e solidi. Questi dati confermano nuovamente una crescita maggiore nei surrogati perfusi. Dopo questa procedura, altri metodi come ibridazione in situ e istochimica aminoacidica possono essere eseguiti su sezioni istologiche dei surrogati per rispondere a domande riguardanti l'espressione di RNA e proteine.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare ed elaborare surrogati tessutali tridimensionali in vitro e come eseguire l'analisi dei surrogati su sezioni istologiche colorate con ematossilina ed eosina.

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