Preparazione e analisi di In Vitro Tridimensionale carcinoma mammario mondo dei replicanti

L'obiettivo generale di questa serie di procedure è quello di generare colture cellulari tridimensionali per funzionare come surrogati del cancro al seno in vitro e di presentare un metodo per misurare la crescita cellulare nelle sezioni istologiche dei surrogati. La coltura cellulare tridimensionale è un metodo fisiologicamente più rilevante per modellare il comportamento cellulare in vitro rispetto alla coltura cellulare bidimensionale. Alterando la composizione cellulare in condizioni sperimentali, questo insieme di procedure può essere adattato per affrontare una varietà di questioni biologiche e per valutare l'efficacia delle terapie candidate.

Per incorporare le cellule nella MEC, con ghiaccio, aggiungere le cellule e i primi quattro componenti correlati elencati nella tabella uno del manoscritto di accompagnamento, in una provetta da microcentrifuga da due millimetri. Quindi, mescolarli delicatamente pipettandoli ed evitare la formazione di bolle. Monitorare il livello di pH utilizzando il rosso fenolo nel MEM 10XD per assicurarsi che la miscela mostri un colore rosa-arancio, indicando un pH di sette.

Se la miscela appare gialla e il pH è troppo basso, aggiungere lentamente il 7,5% di bicarbonato di sodio una goccia alla volta fino a raggiungere il colore appropriato. Ricordati di mantenere la miscela sul ghiaccio e lavora rapidamente per prevenire la polimerizzazione prematura della ECM. Per le colture 3D solide, mantenere il vetrino della camera sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione prematura della ECM.

Pipettare lentamente 100 microlitri della miscela ECM cellulare in ciascun pozzetto del vetrino della camera a otto pozzetti e pipettare la miscela ECM cellulare attorno ai bordi del pozzetto per distribuire meglio la miscela. Successivamente, incubare i surrogati a 37 gradi Celsius, il cinque percento di CO2, per 45 minuti per consentire la polimerizzazione ECM. Dopo quarantacinque minuti, aggiungere 100 micro-litri di terreno di coltura a ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2 per tutta la durata dell'esperimento.

Cambiare il terreno di coltura ogni due giorni. Un limite della coltura 3D è che la diffusione di ossigeno e sostanze nutritive nel volume può essere inadeguata a supportare la vitalità cellulare. L'aggiunta di un sistema di bioreattori può aiutare a superare questa limitazione e migliorare la crescita.

Per immergere le colture 3D in un sistema di bioreattori, preparare e assemblare sapientemente la porzione del sistema di bioreattore che ospita i surrogati. In una cappa di coltura cellulare, utilizzando una siringa con un ago calibro 26, iniettare la miscela ECM cellulare nell'area del bioreattore di perfusione progettato per contenere le cellule e procedere rapidamente alla fase successiva. Per garantire una distribuzione più uniforme delle cellule all'interno dei surrogati, posizionare il componente del bioreattore che ospita i surrogati in un tubo conico da 50 millilitri.

Ruotare continuamente i surrogati a 18 giri/min durante l'incubazione a 37 gradi Celsius in un forno di ibridazione in situ o in un incubatore per 45 minuti per consentire la polimerizzazione della ECM. Dopo la polimerizzazione e l'aggiunta del fluido, collegare il gruppo del bioreattore alla pompa. Avviare la perfusione media in un incubatore a 37 gradi Celsius, cinque percento di CO2.

Continuare la perfusione del terreno per tutta la durata dell'esperimento e cambiare il terreno di coltura come richiesto per lo specifico disegno sperimentale. Alla fine dell'esperimento, racchiudere i surrogati in gel per la lavorazione dei campioni per mantenere intatti i surrogati durante l'elaborazione e facilitare il sezionamento istologico. Per fare ciò, sciogliere il gel per la lavorazione dei campioni in un bagnomaria a 60 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Quindi, pipettare circa 300 microlitri di gel per la lavorazione dei campioni sul fondo di un criostampo etichettato. Utilizzando una lama di bisturi e una pinza, rimuovere con cura un surrogato dal bioreattore o dal pozzetto di un vetrino a camera a otto pozzetti e posizionarlo nei criostampi contenenti gel per la lavorazione dei campioni. Pipettare circa 300 micro-litri di gel per la lavorazione dei campioni per coprire il surrogato nel criostampo.

Quindi, incubarlo a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Una volta che il gel per la lavorazione dei campioni si è solidificato, rimuovere il gel per la lavorazione dei campioni contenente il surrogato dal criopoldo e inserirlo in una cassetta di tessuto. Se più di un surrogato deve essere inserito nella stessa cassetta di tessuto, i coloranti per la marcatura dei tessuti possono essere utilizzati per distinguere i campioni dopo la fissazione e la lavorazione.

Successivamente, posizionare la cassetta di tessuto contenente il surrogato in una formula tamponata neutra al dieci percento per dieci-dodici ore a temperatura ambiente per consentire una fissazione completa. Dopo la fissazione, trasferire la cassetta di tessuto contenente il surrogato al 70% di etanolo. Il surrogato fissato è ora pronto per il trattamento in paraffina e il successivo sezionamento istologico.

Per misurare la densità cellulare e le immagini fotomicroscopiche delle sezioni colorate con H ed E, aprire un file di immagine del surrogato. Utilizzando lo strumento Poligono in ImageJ e i bordi dell'ECM come guida, delineare l'area del surrogato trascinando il mouse e facendo clic per creare punti di ancoraggio. Una volta delineato, selezionare Misura nella scheda Analizza.

Quindi, caricare i file di immagine utilizzati per misurare l'area surrogata in Cell Profiler trascinando i file di immagine nell'elenco dei file. Quindi, assegna un nome a ciascuna immagine importata nel modulo Importazione nomi e tipi e seleziona il tipo di immagine. Dopo aver generato la pipeline di analisi, avviare la modalità test e fare clic su Esegui in Cell Profiler.

E valutare gli oggetti filtrati per assicurarsi che la maggior parte dei nuclei nell'immagine di prova siano identificati in modo appropriato e che i parametri ottimali siano scelti per identificare le cellule. I nuclei inclusi saranno cerchiati in verde. Quindi, salva il progetto, esci dalla modalità di test e fai clic su Analizza immagini.

Qui è mostrata un'immagine rappresentativa della sezione colorata H ed E da un surrogato perfuso cresciuto per sette giorni. E questa è un'immagine rappresentativa della sezione colorata H ed E da un surrogato solido cresciuto per sette giorni con il terreno cambiato ogni due giorni. La cellularità è molto più bassa nei surrogati solidi.

Questo grafico mostra il confronto del numero medio di cellule nucleate per area dopo sette giorni di crescita. Un surrogato perfuso e solido. Questi dati numerici supportano la cellularità nelle micrografie fotografiche delle sezioni colorate H ed E.

E questo grafico mostra il confronto dell'indice di marcatura del Ki-67, che è la misura della proliferazione cellulare dopo sette giorni di crescita di surrogati perfusi e solidi. Questi dati supportano ancora una volta una maggiore crescita dei surrogati perfusi. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'ibridazione in situ e l'amminoistochimica possono essere eseguiti su sezioni istologiche dei surrogati per rispondere a domande come l'RNA e l'espressione proteica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare ed elaborare surrogati di tessuto tridimensionali in vitro ed eseguire analisi surrogate su sezioni istologiche colorate con H ed E.