Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

L'obiettivo generale di questo metodo è visualizzare la struttura della matrice cardiaca in assenza di cellule o altri materiali non matriciali. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della fibrosi, in particolare come le differenze nel contenuto della matrice possono influenzare l'organizzazione della matrice e come questi cambiamenti potrebbero influenzare diverse cardiomiopatie o altre malattie fibrotiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una visione qualitativa della matrice che può essere utilizzata per aumentare le misure quantitative.

Il Dr. Galindo e il Dr. Sawyer hanno avuto l'idea di utilizzare questa tecnica dopo aver scoperto che il trattamento regolare dei suini post-infartuale aveva cambiamenti nell'espressione genica che erano simili ai cambiamenti nel contenuto della matrice dopo il trattamento. Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà se non hanno precedenti esperienze di preparazione di campioni SEM, a causa delle capacità motorie richieste . Il campione di tessuto deve essere abbastanza grande da essere facilmente visibile e conservato in una soluzione di glutaraldeide al quattro percento a quattro gradi Celsius.

Rimuovere il fazzoletto dalla cella frigorifera e risciacquarlo in acqua distillata. Quindi, immergere il tessuto in una soluzione di idrossido di sodio al 10%, prodotta fresca da pellet in acqua. Assicurati di prendere le dovute precauzioni.

Conservare il tessuto nella soluzione di idrossido di sodio per sei-10 giorni a temperatura ambiente. Procedi quando il colore del fazzoletto diventa bianco sporco o bianco. Quindi, risciacquare il fazzoletto con acqua distillata fino a quando non diventa trasparente.

Successivamente, indossa i guanti e immergi il tessuto in acido tannico all'uno per cento per quattro ore a temperatura ambiente. Dopo il bagno di acido tannico, sciacquare il fazzoletto in acqua distillata per una notte. In preparazione, in una cappa aspirante con guanti, preparare una soluzione madre 0,2 molare di tampone cacodilato di sodio e una soluzione madre acquosa al due percento di tetrossido di osmio.

Utilizzare un paraspruzzi, poiché il tetrossido di osmio rappresenta un grave rischio di inalazione. Ora, fai una diluizione molare di 0,1 del tampone di cacodilato di sodio e incuba il tessuto in esso per cinque minuti con una leggera agitazione. Sostituire il tampone due volte per lavare il tessuto per un totale di tre volte con cacodilato di sodio.

Quindi, prepara una miscela uno a uno del cacodilato di sodio stock e del tetrossido di osmio stock. Incubare il tessuto nella nuova miscela su un rotatore per un'ora. Successivamente, riportare il tessuto a 0,1 molare di coccodrillo di sodio e incubarlo con leggera agitazione per cinque minuti.

Cambia questa soluzione per il bagno due volte nell'arco di 15 minuti. Quindi, disidratare il tessuto utilizzando una serie di bagni di etanolo con concentrazioni crescenti. Lasciare in ammollo il fazzoletto per 15 minuti in ogni bagno con una leggera agitazione.

Quindi, trasferire il tessuto e la soluzione in una capsula di Petri poco profonda riempita con etanolo al 100%. Quindi, con cura, tenere due lame di rasoio molto affilate in modo che le parti piatte dei lati siano a contatto tra loro e i bordi taglienti si incrocino per formare due lati di un triangolo equilatero sopra il campione. Ora, usa la tua mano dominante per posizionare la seconda lama all'estrema sinistra del campione e affetta verso destra.

Pertanto, far scorrere le lame l'una contro l'altra da direzioni opposte per eseguire un unico taglio liscio con una distorsione o una forza di strappo minima. L'obiettivo è quello di esporre la più ampia superficie possibile senza danneggiare il campione. Ripetere il processo fino a quando non vengono preparate sezioni trasversali sufficienti per l'esame da parte del SEM.

Utilizzando una spatola o una pinzetta, trasferire il tessuto nel supporto del campione del CPD, mantenendo il tessuto immerso in etanolo al 100%. Il tessuto non può essere esposto all'aria per più di pochi secondi. Utilizzare il CPD per sostituire l'etanolo con anidride carbonica liquida ed eseguire il ciclo di essiccazione come indicato dal produttore.

Quindi, preparare un campione SEM per ogni campione. Far aderire una linguetta adesiva in carbonio alla superficie superiore del tronchetto in alluminio. Sotto uno stereoscopio, far aderire con cura il campione alla linguetta adesiva con la superficie della sezione trasversale di interesse rivolta verso l'alto, lontano dalla linguetta e massimamente planare con la superficie del tronchetto.

Non sondare o toccare la superficie di interesse. Per gli esemplari più piccoli e difficili, rompi il bastoncino applicatore di legno per usarlo come spatola. Inoltre, lavora su un grande pezzo di carta da filtro per evitare di perdere un campione caduto.

Per una migliore aderenza, utilizzare un bastoncino applicatore rotto per realizzare un pennello affusolato e applicare vernice argento o carbone alla base e ai lati del campione. Stendi una linea molto sottile di vernice fino a un bordo della superficie di interesse. Questo creerà un percorso di carica dalla superficie di interesse al suolo.

Quindi, applica due o tre piccoli tocchi di vernice attorno al perimetro della linguetta in carbonio per fornire un percorso conduttivo dalla superficie della linguetta al tronchetto di metallo. Questo funziona come il terreno. Mettere da parte il campione e lasciare asciugare la vernice conduttiva per due ore.

Una volta asciugato, azionare un rivestimento sputter per applicare uno strato relativamente pesante di oro, lega di palladio o oro sul campione. Si desidera un rivestimento di spessore da 30 a 40 nanometri. Eseguire la microscopia elettronica a scansione a una tensione di accelerazione relativamente bassa per ridurre al minimo i problemi associati a una scarsa dissipazione di carica nel campione.

Utilizzare la modalità a pressione variabile, se disponibile. Innanzitutto, migliora la distanza di lavoro per fornire una profondità di campo sufficiente per concentrarti sulle fibre nella dimensione Z. Per fare ciò, apri la scheda Navigazione in alto a destra.

Quindi, accedi alla scheda Coordinate dal menu del palco. In questo caso, immettere un valore maggiore per la coordinata Z, ad esempio 20 millimetri. Infine, premere la scheda Vai a per eseguire la modifica.

Quindi, posizionare la superficie di interesse ortogonalmente al fascio di elettroni. Fare clic e tenere premuto il pulsante destro del mouse, quindi farlo scorrere verso sinistra o verso destra per mettere a fuoco il campione vicino alla periferia del piano di superficie preparato di interesse. Prendere nota della distanza di lavoro focalizzata.

Quindi, utilizzando il joystick dell'interfaccia utente manuale, spostare la vista sul bordo opposto e ripetere il metodo di messa a fuoco. Se la distanza di lavoro è cambiata, inclinare il campione per ottenere un accordo approssimativo in entrambe le posizioni. Utilizzare la scheda Coordinate del menu Stage e immettere un valore di inclinazione nella coordinata T.

Ora, ruotare il campione di 90 gradi inserendo questo valore nel campo delle coordinate R. Quindi, ripetere il processo di inclinazione fino a quando tutte le posizioni non sono messe a fuoco all'incirca alla stessa distanza di lavoro. La tecnica descritta è stata applicata a tessuti cardiaci provenienti da un donatore di trapianto di cuore umano inutilizzato.

La matrice cardiaca umana è un intricato intreccio di proteine reticolate che ha un modello a nido d'ape in una sezione trasversale. Ogni struttura a nido d'ape è larga circa 40 micron, normalmente eludendo un singolo miocita. Quando sono collegati da dischi intercalati, diversi miociti cardio possono essere immaginati come un'asta che corre longitudinalmente attraverso una forma simile a un tunnel.

Oltre a fornire informazioni strutturali, un SEM di tessuti decellularizzati può consentire una valutazione qualitativa significativa in risposta a lesioni o forme non dannose di cardiomiopatia, come i tessuti cardiaci infartuati di un suino. In uno studio separato, l'isoforma GGF2 di NRG-1 beta ha dimostrato di essere un potenziale trattamento terapeutico per l'insufficienza cardiaca. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come elaborare il tessuto, il tessuto cardiaco, per il microscopio elettronico a scansione, compresa la tecnica per esporre la superficie di interesse e per montare il campione.

Seguendo questa procedura, altre tecniche come la spettrometria di massa, il sequenziamento dell'RNA e vari altri saggi possono essere utilizzati per misurare le proteine della matrice extracellulare e altre responsabili della segnalazione e di altri fenomeni osservativi organizzativi. Inoltre, non dimenticare che il tetrossido di osmio è una sostanza chimica pericolosa, a causa del potenziale di fissazione del vapore delle mucose. Ricordarsi sempre di lavorare in una cappa aspirante con guanti in nitrile, utilizzando un paraspruzzi o una fascia del cofano.