Name: In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Impara a caratterizzare colonie di cellule progenitrici pancreatiche isolate da pancreas murino adulto utilizzando saggi in vitro con metilcellulosa. Questo metodo permette di studiare l'autorinnovamento e il potenziale differenziativo tri-potente.

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Ringraziamo Lucy Brown e Alexander Spalla dalla Analytical Citometria core a Città della Speranza per l&#39;assistenza nella selezione. Questo lavoro è supportato in parte dal National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R01DK081587 e R01DK099734 per HTK e U01DK089533 di ADR, e dalla National Science Foundation concessione NSF-DMR-1.206.121 e California Institute for Regenerative Medicine concessione RB5-07398 a DAT Supporti dal Joseph J. Jacobs Istituto di Ingegneria molecolare per la Medicina al Caltech di DAT, e quelli da Oxnard Foundation e Ella Fitzgerald Foundation per HTK sono anche riconosciuto con gratitudine. Finanziamento: Questo lavoro è supportato in parte dal National Institutes of Health (NIH) concede R01DK081587 e R01DK099734 per HTK e U01DK089533 di ADR, e dalla National Science Foundation concessione NSF-DMR-1.206.121 e California Institute for Regenerative Medicine concessione RB5-07398 a DAT supporta da Joseph J. JacobsIstituto di Ingegneria Molecolare per la Medicina al Caltech di DAT, e quelli da Oxnard Foundation e Ella Fitzgerald Foundation per HTK sono anche ringraziano. La ricerca riportato nella presente pubblicazione incluso lavoro svolto nel Analitica citometria Core e microscopia ottica Digital Imaging Nucleo sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health con il numero premio P30CA33572. Sponsor dello studio: Lo sponsor non ha partecipato allo studio di progettazione, la raccolta, l&#39;analisi, o l&#39;interpretazione dei dati.

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<li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I saggi colonia pancreatiche e singola colonia analisi qui descritti sono stati ispirati dai saggi delle colonie ematopoietiche metilcellulosa contenenti che hanno giocato un ruolo importante nel decifrare la biologia delle cellule progenitrici ematopoietiche nei decenni passati 23. In questi test (Figura 5), dissociate cellule del pancreas sono placcati in metilcellulosa contenenti supporti semi-solido con fattori di crescita appropriati e proteine ​​ECM che sostengono la formazione di anell...

Il pancreas è composto da tre principali linee cellulari; cellule acinose secernono enzimi digestivi, condotti secernere mucina per respingere gli agenti patogeni e il trasporto di enzimi digestivi per l&#39;intestino e le cellule endocrine secernono ormoni, tra cui l&#39;insulina e il glucagone, che mantengono l&#39;omeostasi del glucosio. Durante lo sviluppo embrionale del pancreas, i primi cellule duttali sono la fonte delle cellule progenitrici tri-potenti in grado di dare origine a tre linee nel pancreas di animali adulti 1,2. Poiché le cellule staminali e progenitrici adulte, come le cellule staminali del midollo osseo, sono già utilizzati con successo per il trattamento di varie malattie 3, vi è intenso interesse nel trovare le cellule staminali e progenitrici nel pancreas adulto. Se l&#39;isolamento e la manipolazione delle cellule staminali e progenitrici pancreatiche adulte erano possibili, queste cellule potrebbero essere utilizzate per il trattamento di malattie come il diabete di tipo 1, in cui le cellule che secernono insulina vengono distrutte da autoimmunità. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Sia che ancora esistono cellule progenitrici tri-potenti in dotti pancreatici adulti dopo il completamento dello sviluppo embrionale è una domanda che è fortemente dibattuto nella comunità scientifica. In questo dibattito, e l&#39;utilizzo in vivo cre-lox lineage tracing tecniche, Inada e colleghi hanno dimostrato che le cellule adulte duttale murine etichettati con un pennarello, carbonica II, potrebbero dare origine a tutte e tre le linee del pancreas 4. Tuttavia, utilizzando altri marcatori duttali, come HNF1B era 5 e Sox9 2, si è concluso che le cellule duttali non sono la principale fonte di cellule beta topi adulti. Molti anni fa, abbiamo proposto che la causa della discussione suddetto può essere dovuto alla mancanza, nel campo 6,7, di strumenti analitici adeguati che possono essere utilizzati per misurare auto-rinnovamento e multi-lineage differenziazione-due criteri necessario definire una cellula staminale. L&#39;in vivo cre-lox tecnica lineage tracing menzionatosopra può fornire prove per la relazione progenitore-progenie a livello di popolazione. Tuttavia, questa tecnica tracciando lignaggio è limitata nel suo potere di discernere se le cellule progenitrici singoli possono auto-rinnovarsi e di differenziarsi in molteplici linee. analisi singola cella è importante perché se diversi progenitori mono-potente, ognuno con un diverso potenziale stirpe, sono stati analizzati insieme, possono apparire collettivamente avere multi-lignaggio capacità di differenziazione. Inoltre, le cellule staminali sono di solito una frazione minore di un organo adulto. Le attività di una popolazione di cellule minore potrebbe essere mascherati dalla popolazione principale. Pertanto, un risultato negativo da uno studio di popolazione non indica necessariamente l&#39;assenza di cellule staminali. Infine, cre-lox lignaggio tracciamento attualmente non consentono di misurare la auto-rinnovamento. Per iniziare affrontando il divario tecnico nel campo della biologia delle cellule progenitrici del pancreas, colonia 7-11 o 12-15 organoide </sup&gt; saggi che utilizzano sistemi di coltura 3D sono state elaborate. Due saggi di colonia per progenitori pancreatici sono stati sviluppati nel nostro laboratorio: uno contiene una preparazione commerciale di proteine ​​murine matrice extracellulare (ECM) (vedere Metodi e Impianti Table), e l&#39;altra contiene idrogel laminina, un definito ECM proteina artificiale 7-11. cellule progenitrici sono mescolati in mezzo semisolido contenente metilcellulosa. Metilcellulosa è un materiale biologicamente inerte e viscosa preparato da fibre di legno, ed è stato utilizzato di routine in saggi colonie ematopoietiche 16. La metilcellulosa contenente mezzo semisolido limita il movimento delle cellule progenitrici singoli in modo che non può ri-aggregate. Tuttavia, il mezzo è abbastanza morbida da consentire una cellula progenitrice di crescere e differenziarsi in una colonia di cellule nello spazio 3D. Seguendo la tradizione degli ematologi, una cellula progenitrice del pancreas che è stato in grado di dare origine a una colonia di cellule era named una unità formanti colonie pancreatica (PCFU). PCFUs, quando coltivate nel saggio colonia ECM contenenti murino, danno origine a colonie cistica che sono denominati &quot;Ring&quot; colonie 7. L &#39;aggiunta di un agonista Wnt, R-spondin1, nella cultura murino ECM-contenente, alcune colonie Anello trasformano in colonie &quot;dense&quot; 7. In questo articolo, questi due tipi di colonie cresciute in coltura ECM murino sono indicate collettivamente come colonie &quot;Ring / dense&quot;. Quando anello colonie / dense sono dissociate in sospensione di cellule singole e ri-placcato in culture che contengono laminina idrogel, colonie &quot;Endocrine / acinari&quot; si formano 7. Utilizzando singola colonia analisi, si è constatato che la maggior parte delle colonie Ring / densi e Endocrino / acinari, sia da adulto (2-4 mesi) 7,11 o giovani (1 settimane di età) 9 pancreas di topo, esprimono tutti e tre marcatori lignaggio. Questo suggerisce che la maggior parte delle PCFUs originari sono tri-potenti. Nel saggio colonia ECM contenenti murino, adulto PCFUs murino robusta auto-rinnovarsi e di espandere di circa 500.000 volte più di 11 settimane nella cultura 7. ECM murino supporta preferenzialmente la differenziazione delle cellule duttali oltre endocrine e acinose lignaggi, mentre in presenza di laminina idrogel, PCFUs murini sono incoraggiati a differenziarsi preferenzialmente in cellule endocrine e acinose e meno al duttale stirpe 7,9,11. È importante sottolineare che, insulina + glucagone - celle mono-ormonale sono generati nella cultura idrogel laminina e secernere insulina in risposta al glucosio stimolazione in vitro 7,9, suggerendo la maturità funzionale. La differenziazione tri-lignaggio potenziale 7,9 e di auto-rinnovamento 11 dei singoli PCFUs sono confermate da micromanipolazione cella singola, vale a dire, la coltura di una cella per bene per la formazione di colonie. Insieme, questi risultati forniscono la prova che ci sono auto-rinnovamento, tri-potent, cellule progenitrici simili nel pancreas murino postnatale che mostrano le attività in coltura 3D. I saggi PCFU murini descritti in questo articolo sono derivati ​​da un test colonia prima progettata per le cellule progenitrici differenziate da cellule murine embrionali staminali (mESCs) 17. Questo protocollo è documentato in dettaglio in un&#39;altra pubblicazione JoVE 18. I componenti e le tecniche necessarie per eseguire il test colonia ECM contenenti murino per PCFUs adulti cultura sono gli stessi di progenitori Mesc-derivati ​​17,18. Pertanto, questi aspetti del test non saranno ripetute qui; invece saranno affrontate le seguenti procedure: 1) la dissociazione del pancreas adulti e ordinamento / EGFP + cellule duttali CD133 + SOX9, che arricchiscono PCFUs da topi adulti 7, 2) la manipolazione cella singola delle cellule ordinati, 3) single-colonia analisi usando microfluidica qRT-PCR e tutto il montaggio immunostaining, e 4) la dissociazione di Colonies in cella singola sospensione e ri-placcatura in ECM murino o laminina saggi di idrogel colonia.

<table><tbody><tr><td>Proteine della MEC murina (Matrigel)</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>354230</td><td>Stock mantenuto a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Laminin Hydrogel</td><td>Fornito da David Tirrell (Pasadena, CA USA)</td><td></td><td>Stock mantenuto a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Shinetsu Chemical (Tokyo, Giappone)</td><td></td><td>1.500 centipoise (unità di viscosità dinamica pari a 15 g/cm/sec) (alta viscosità)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Gibco salino tamponato con fosfato</td><td>(Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Flacon Conical fiaal</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Piatto di coltura in sospensione</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>DNase1</td><td>Calbiochem (Darmstadt, Germania)</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi B</td><td>Roche (CH-4070, Basilea, Svizzera, Svizzera)</td><td>11088831001</td><td>Stock mantenuto a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Anti-topo CD16/32</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>101310</td><td>basso endotossina, privo di azide</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Rat IgG2a &kappa; Biolegend per il controllo degli isotipi</td><td>(San Diego, CA, USA)</td><td>400522</td><td></td></tr><tr><td>IgG1 di ratto &kappa; Controllo dell'isotipo</td><td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td><td>13-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD133-Biotina</td><td>eBioscience (San Diego, CA, USA)</td><td>13-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD71-PE-Cy7</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina-Alloficocianina</td><td>Biolegend (San Diego, CA, USA)</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindolo</td><td>Invitrogen ( Waltham, MA,&nbsp; USA)</td><td>3571</td><td>Stock mantenuto a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Anti-mucina 1</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)</td><td>HM-1630-P1</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649 Capra criceto anti-armeno</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>127-495-160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12</td><td>Mediatech (Manassas, VA, USA)</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale</td><td>bovino Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)</td><td>101</td><td>Stock mantenuto a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Tris Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>TEKnova (Hollister, CA, USA)</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Micro Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Paesi Bassi)</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa QuantiTec</td><td>Qiagen (Venlo, Paesi Bassi)</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>005-000-121</td><td>Stock mantenuto a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)</td><td>0017-000-121</td><td>Stock mantenuto a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>T-4799</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; USA)</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies (Waltham, MA, USA)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Acqua sterile</td><td>Gibco (Grand Island, NY, USA)</td><td>15230-147</td><td>Pipetta Pasteur di grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro a rete</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m rete filtrante</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>TC Piastra 96 pozzetti Sospensione</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924 (precedentemente 83.1835)</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 cc</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 cc</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>48.48 Dyanmic Array Chip</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td>BMK-M-48.48</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm GE 48.48 Campione dinamico dell'array & Kit di reagenti per il caricamento del saggio</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td>85000800</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Monolaurato di polietilenglicole sorbitano</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro</td><td>MatTek (Ashland, MA, USA)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Piastra Petri da 35 mm con fondo</td></tr> <tr><td>in vetroBoccaglio/Tubo di gomma</td><td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td><td>MP-SET</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>N0636</td><td>Stock mantenuto a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Fattore di crescita endoteliale vascolare</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>293-VE</td><td>Stock mantenuto a -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Activina B</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>659-AB</td><td>Stock mantenuto a -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Extendin 4</td><td>Sigma (St. Louis, MO, USA)</td><td>E7144</td><td>Stock mantenuto a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Rspondin-1</td><td>R& D Systems (Minneapolis, MN, USA)</td><td>3474-RS</td><td>Stock mantenuto a -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Polistirene Tubo a fondo tondo</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Ago PrecisionGlide 18 G x1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Ago PrecisionGlide 16 G x 1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Costar Superficie di attacco ultra-bassa Piastra a fondo piatto a 24 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 Black Well Plate</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, USA)</td><td>3603</td><td>Fondo piatto e trasparente con coperchio. Micropiastre in polistirene nero trattato TC</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Microscopio invertito</td><td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD&nbsp;</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selezionatrice di celle per prodotti Aria Special Order Research</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/BSA</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0,1% (peso/vol) BSA 
PenStrep (49 unità/ml Penicillina, 49 &mu; g/ml Streptomicina)</td></tr><tr><td>PBS/BSA/Dnase1</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
0,1% (peso/vol) BSA 
PenStrep (49 unità/ml Penicillina, 49 &mu; g/ml di streptomicina) 
Dnase 1 (2.400 unità/ml per pancreas)</td></tr></tbody></table>

in vitro colony saggi per caratterizzazione tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Staminali e cellule progenitrici da parte del pancreas adulti potrebbero essere una potenziale fonte di cellule beta-come terapeutici per il trattamento di pazienti affetti da diabete di tipo 1. Tuttavia, non è ancora noto se le cellule staminali e progenitrici esistono nel pancreas adulto. strategie di ricerca utilizzando cre-lox lineage tracing in topi adulti hanno dato risultati che sostenere o confutare l&#39;idea che le cellule beta possono essere generati dai condotti, il luogo in cui si presume adulte progenitrici del pancreas possono risiedere. Questi metodi lineage tracing in vivo cre-LOX, tuttavia, non possono rispondere alle domande di auto-rinnovamento e multi-lignaggio differenziazione-due criteri necessari per definire una cellula staminale. Per iniziare affrontare questa lacuna tecnica, abbiamo ideato saggi di colonia 3-dimensionali per progenitori pancreatici. Poco dopo la nostra pubblicazione iniziale, altri laboratori hanno sviluppato in modo indipendente una simile, ma non identica, metodo chiamato il test organoide. Rispetto al dosaggio organoide, il nostro metodo impiegametilcellulosa, che forma soluzioni viscose che consentono l&#39;inserimento di proteine ​​della matrice extracellulare a basse concentrazioni. I saggi metilcellulosa contenenti consentono una facile individuazione e analisi di cellule progenitrici a livello di singola cellula, che sono fondamentali quando progenitori costituiscono una piccola sotto-popolazione, come è il caso per molti cellule staminali adulte di organi. Insieme, i risultati di diversi laboratori dimostrano in vitro auto-rinnovamento e multi-lignaggio differenziazione delle cellule progenitrici simili pancreatiche da topi. I protocolli attuali descrivono due saggi di colonia metilcellulosa-based per caratterizzare i progenitori del mouse del pancreas; uno contiene una preparazione commerciale di proteine ​​della matrice extracellulare murine e l&#39;altra una proteina della matrice extracellulare artificiale conosciuto come un idrogel laminina. Le tecniche qui riportate sono 1) la dissociazione del pancreas e smistamento di CD133 + Sox9 / EGFP + cellule duttali da topi adulti, 2) la manipolazione singola cellula dei scellule orted, 3) singola colonia analisi utilizzando microfluidica qRT-PCR e tutto il montaggio immunostaining, e 4) la dissociazione di colonie primarie in cella singola sospensioni e ri-placcatura in saggi di colonia secondari per valutare il self-renewal o differenziazione.

Adulti cellule progenitrici del pancreas possono essere arricchiti mediante fluorescenza-attivato cell sorting (Figura 1). La linea di topi transgenici Sox9 / EGFP usato qui è stato generato a seguito del GENSAT Cervello Atlas Progetto 19, e il reporter EGFP è sotto il controllo di un cromosoma artificiale batterico contenente ~ 75 kb a monte e ~ 150 KB sequenze a valle di Sox9 20 . In questi topi, EGFP etichette dotti pancreatici in modo efficiente...

Nei saggi di colonie in vitro per rilevare auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule progenitrici isolate dal pancreas di topo adulti sono messo a punto. In questi saggi, progenitori pancreatici danno origine a colonie di cellule nello spazio 3-dimensionale in terreno semisolido contenente metilcellulosa. I protocolli per la gestione di singole cellule e caratterizzazione delle singole colonie sono descritti.

In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

L'obiettivo generale di questi protocolli è caratterizzare le colonie cellulari sviluppate da cellule progenitrici pancreatiche isolate da topi adulti, utilizzando saggi colturali che impiegano un mezzo semisolido contenente metilcellulosa. I nostri metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia delle cellule progenitrici pancreatiche, ad esempio: quali sono le capacità di autorenovamento e di differenziazione delle cellule progenitrici nel pancreas adulto? Il principale vantaggio di queste tecniche consiste nella possibilità di studiare singole cellule progenitrici, elemento cruciale per determinarne il reale potenziale biologico.Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questi metodi quando abbiamo capito che i saggi di colonie utilizzati per studiare le cellule staminali ematopoietiche potevano essere applicati anche alle popolazioni cellulari pancreatiche. Le procedure saranno dimostrate da Jacob Tremblay, uno studente laureato, la dottoressa Janine Quijano, una ricercatrice post dottorato, e la signorina Angela Luo, un'assistente tecnica, tutti del mio laboratorio. Non appena possibile dopo il sacrificio, utilizzare le forbici per praticare un'incisione verticale lungo la linea mediana della parete addominale ed aprire la cavità addominale.Utilizzando una pinzetta, sollevare delicatamente la milza, recidendo con le forbici il tessuto connettivo tra la milza e il lobo splenico del pancreas. Recidere allo stesso modo i tessuti connettivi dei lobi duodenale e gastrico, quindi posizionare i tessuti pancreatici in una piastra di Petri contenente DPBS integrato con BSA 0,1% e antibiotici, posta sul ghiaccio. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare una pinzetta a punta fine per rimuovere il tessuto adiposo.Ora trasferire i pancreas in una cappa a flusso laminare e risciacquare il tessuto in tre piastre di Petri da 100 millimetri contenenti ciascuna 10 millilitri di PBS freddo più BSA. Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare i pancreas in una piastra di Petri sterile e asciutta per rimuovere la maggior quantità possibile di PBS più BSA, quindi trasferire i tessuti in un'altra piastra di Petri asciutta posta sul ghiaccio. Successivamente, utilizzare forbici a molla per tritare i pancreas per due o tre minuti, fino a ottenere frammenti fini di tessuto, e sospendere i frammenti di tessuto in due o tre millilitri di soluzione fredda appena preparata di PBS BSA DNasi I.Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, trasferire i pezzi in un tubo conico da 50 millilitri e aggiungere PBS BSA DNase I in quantità sufficiente a portare il volume totale a 10 millilitri. Successivamente, aggiungere dai 350 ai 450 microlitri di collagenasi B ai tessuti. Posizionare il tubo in un bagno termico a 37 gradi Celsius per otto minuti, agitando ogni tre o quattro minuti.Al termine dell'incubazione, utilizzare una siringa da 10 millilitri con un ago da 16 e mezzo per aspirare e quindi spruzzare la soluzione dei tessuti lungo la parete del tubo da 50 millilitri a temperatura ambiente per sette volte. Successivamente, rimettere i tessuti nel bagnomaria per altri otto minuti, mescolando occasionalmente, seguiti da sette passaggi attraverso la siringa come appena dimostrato. Dopo l'ultima perturbazione meccanica, trasferire un'aliquota di 10 microlitri della sospensione cellulare in una piastra di Petri asciutta e confermare la presenza di cellule singole e piccoli aggregati cellulari mediante microscopio ottico a contrasto di fase invertito con obiettivo 10x.Successivamente, mettere il tubo sul ghiaccio e portare il volume totale a 50 millilitri con PBS BSA DNase I. Centrifugare le cellule e utilizzare una pipetta P1000 per risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS BSA DNase I freddo. Filtrare quindi le cellule attraverso un filtro in rete di nylon da 70 micron, seguito da un filtro in rete di nylon da 40 micron, in un nuovo tubo conico in polipropilene da 50 millilitri. Regolare il volume a 5 millilitri di PBS BSA DNase I e contare le cellule. Successivamente, diluire la sospensione monocellulare a una concentrazione finale di due volte 10 alla settima cellule per millilitro in PBS BSA DNase I freddo, mantenendo sul ghiaccio.Per eseguire l'immunomarcatura su vetrino di colonie pancreatiche coltivate in un mezzo semisolido contenente metilcellulosa, preparare innanzitutto una pipetta di vetro di Pasteur con un'apertura fine utilizzando un becco di Bunsen. Successivamente, collegare l'estremità più piccola di una punta da un millilitro a un'estremità di un tubo di gomma sottile e un boccaglio all'altra estremità. Collegare la pipetta di vetro di Pasteur all'estremità più grande della punta di pipetta.Quindi aspirare da 10 a 50 microlitri di mezzo DMEM/F12 con metilcellulosa all'uno percento nella pipetta a bocca. Ora posizionare la piastra con le colonie sul tavolo di un microscopio a contrasto di fase invertito e utilizzare l'obiettivo 10x per individuare le colonie adatte da selezionare. Successivamente, posizionare l'apertura della pipetta accanto alla colonia di interesse e applicare lentamente aspirazione con la bocca per prelevare una singola colonia.Per un prelievo efficace, è importante assicurarsi che la colonia di interesse sia a fuoco prima di posizionare l'apertura della pipetta di vetro accanto all'aggregato cellulare. Una volta raccolta la colonia, posizionare la punta della pipetta in una pozzetta di una piastra a 96 pozzetti contenente paraformaldeide al 4% e depositare la colonia nella pozzetta. Dopo aver raccolto tutte le colonie, fissare le colonie tutta la notte a quattro gradi Celsius con agitazione delicata.La mattina successiva, lavare le colonie due volte in PBS per 10-30 minuti a temperatura ambiente. Da questo momento in poi, prelevare le colonie utilizzando una pipetta plastica P10 con punta piegata. Dopo il secondo lavaggio, conservare le colonie fissate durante la notte in provette da 1,5 millilitri riempite con paraffina a quattro gradi Celsius.Trasferire quindi le colonie in pozzetti individuali di una piastra nera da 96 pozzetti con fondo trasparente, contenente 200 microlitri di buffer di blocco per pozzetto. Incubare la piastra tutta la notte a quattro gradi Celsius con agitazione delicata. La mattina successiva, trasferire le colonie in nuovi pozzetti contenenti 200 microlitri dell'anticorpo primario di interesse per un'ulteriore coltura notturna a quattro gradi Celsius con agitazione delicata.Il mattino seguente, trasferire le colonie in tre pozzetti consecutivi contenenti 200 microlitri di PBS con 0,1% di Tween 20 per lavaggi di 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo il terzo lavaggio, trasferire le colonie in pozzetti puliti contenenti 200 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato e incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore al buio. Al termine dell'incubazione, lavare le colonie tre volte in PBS con Tween come appena mostrato e trasferirle in nuovi pozzetti contenenti DAPI per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi raccogliere le colonie immunomarcate in una piastra di Petri da 35 millimetri con fondo in vetro e coprirle con un vetrino. Infine, acquisire le immagini delle colonie mediante microscopio confocale. Le cellule progenitrici pancreatiche adulte possono essere arricchite mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza utilizzando parametri di selezione appropriati, poiché la capacità di formare colonie è presente esclusivamente nelle cellule duttali CD133 Sox9/EGFP positive.Le colonie pancreatiche possono quindi essere classificate in base alle loro morfologie mediante microscopia a contrasto di fase invertita. Dopo il prelievo manuale, le colonie possono anche essere analizzate mediante qRT-PCR microfluidica per l'espressione genica, oppure mediante immunomarcatura su preparato intero per l'espressione proteica. In effetti, numerose colonie individuali esprimono marcatori di linea per cellule duttali, endocrine e acinari, ad esempio, indicando che la maggior parte dei progenitori pancreatici iniziali che formano queste colonie è tri-potente.Una volta acquisita padronanza, le procedure di dissezione, dissociazione, colorazione e separazione cellulare, nonché di semina cellulare in un mezzo semisolido contenente metilcellulosa, possono essere completate in sei o sette ore se eseguite correttamente. Dopo la formazione delle colonie, è possibile effettuare ulteriori analisi, come RT-PCR quantitativa, western blot o saggi di secrezione di insulina, per rispondere ad altre domande riguardo l'espressione genica o le capacità funzionali delle colonie. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della tecnica di dissociazione del pancreas di topo adulto e di come caratterizzare le colonie di cellule progenitrici pancreatiche generate in colture semisolide contenenti metilcellulosa.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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