Generazione di cellule di topo Airway epiteliali ESC-derivati ​​dall'uso di decellularized Lung Ponteggi

L'obiettivo generale di questa procedura è indirizzare la differenziazione di cellule staminali embrionali di topo verso cellule epiteliali delle vie aeree mature, utilizzando un sistema di coltura 3D con impalcature polmonari descellularizzate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo polmonare, come il ruolo delle contrazioni tra cellula e matrice e il segnale dei fattori di crescita durante la differenziazione della linea polmonare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che utilizza un sistema di coltura 3D in un ambiente definito e privo di siero, ottenendo una differenziazione epiteliale delle vie aeree robusta con limitata contaminazione da altre linee endodermiche. Dopo l'eutanasia di un ratto adulto Wistar, secondo il protocollo descritto, fissare l'animale su una superficie da dissezione bloccando zampe anteriori e posteriori ed usare etanolo al 70% per spruzzare torace e addome. Creare un'incisione appena sotto la gabbia toracica. Tagliare la cute ed esporre il diaframma. Successivamente, praticare piccole incisioni nel diaframma per far ritirare i polmoni, riducendo così il rischio di perforarli. Poi, praticare un'incisione verticale lungo lo sterno ed aprire la cavità toracica per accedere al cuore e ai polmoni. Quindi, con un filo di sutura, legare la vena cava inferiore ed usare piccole forbici da dissezione per praticare una piccola incisione nell'atrio sinistro. Utilizzando una siringa da 10 ml preparata con ago da 25 gauge riempita con soluzione salina equilibrata di Hank contenente eparina (Hank's Balanced Salt Solution), iniziare la perfusione polmonare inserendo l'ago nel ventricolo destro e spingere il tampone attraverso la circolazione polmonare. Continuare la perfusione finché i polmoni non diventano bianchi e il liquido che fuoriesce dall'atrio sinistro risulti limpido. Dopo la perfusione, esporre la trachea e praticare una piccola incisione vicino alla cartilagine tiroidea per la canulazione. Quindi, canulare la trachea con un catetere di plastica e fissarlo con un punto di sutura. Impostare ora un sistema di perfusione a gravità fissando una siringa da 10 ml a un supporto con morsetto. Rimuovere e scartare lo stantuffo della siringa. Fissare il punto massimo di riempimento del corpo della siringa a 20 cm sopra i polmoni, quindi collegare un rubinetto a due vie all'estremità della siringa ed un lungo tubo di plastica all'altra estremità del rubinetto. Estrarre delicatamente il catetere dalla trachea e collegarlo all'estremità del tubo di plastica. Versare quindi la soluzione di descellularizzazione nella siringa e lasciare che riempia completamente il tubo di plastica e il catetere collegati. Riinserire il catetere riempito di soluzione nella trachea e lavare i polmoni riempiendoli fino alla capacità polmonare totale per un minuto. Successivamente, rimuovere il catetere dalla trachea per permettere al liquido di defluire dai polmoni. Ripetere il lavaggio dei polmoni otto volte con la soluzione di descellularizzazione, seguito da dieci risciacqui con PBS. Al termine delle fasi di lavaggio, i polmoni appariranno bianchi. Quindi dissezionare trachea e polmoni dal collo e dalla cavità toracica. Rimuovere i tessuti in eccesso dai polmoni isolati, inclusi esofago e cuore, quindi trasferire i polmoni in PBS freddo fino alla preparazione per il sezionamento al vibratomo. Per preparare sezioni spesse, preparare circa 15 ml di agarosio al 2% e al 4% a basso punto di fusione in PBS, e una quantità sufficiente di agarosio al 6% per incorporare tutti i lobi in piccoli blocchi rettangolari. Dopo aver trasferito l'agarosio in provette da 15 ml, porre le provette su un blocco riscaldante e mantenere la temperatura superiore ai 40 gradi Celsius per evitare la gelificazione. Utilizzando piccole forbici, dissezionare il polmone descellularizzato all'estremità di ciascun bronco lobare e staccare ogni lobo. Quindi usare fogli assorbenti per rimuovere l'eccesso di PBS e trasferire i lobi in agarosio al 2% sul blocco riscaldante per cinque minuti, per ricoprire il tessuto. Dopo aver trasferito ogni lobo in una piastra di Petri, posizionare la piastra su una piastra fredda e lasciare gelificare la superficie per un minuto. Posizionare delicatamente i lobi in agarosio al 4%, e dopo un'incubazione di cinque minuti e raffreddamento, ripetere il rivestimento con agarosio al 6%. Dopo il rivestimento, utilizzare stampi metallici per incorporare ciascun lobo separatamente in agarosio al 6%, con almeno 3 ml di agarosio che circondano il tessuto dai bordi. Successivamente, con pinzette, orientare ogni lobo posizionando il bordo più ampio e piatto del tessuto sulla superficie dello stampo metallico rivolto verso l'operatore, e completare l'incapsulamento utilizzando cassette di plastica. Lasciare solidificare i blocchi su una piastra fredda per almeno 30 minuti prima del sezionamento al vibratomo. In alternativa, conservare i blocchi in una camera umidificata fino a 12 ore a quattro gradi Celsius prima del sezionamento al vibratomo. Per preparare le sezioni, impostare il vibratomo riempiendo la camera di sezionamento con PBS freddo. Preparare un bagno di ghiaccio circostante per mantenere una temperatura fredda durante l'intero processo di sezionamento. Ora rimuovere i blocchi dagli stampi metallici ed usare una lametta per tagliare l'agarosio in eccesso intorno ai lobi, mantenendo circa tre millimetri di distanza dal bordo del tessuto. Utilizzando un adesivo, fissare il tessuto al centro della piastra del campione ed immergere la piastra nella camera di sezionamento riempita di PBS. Montare la lama di sezionamento sul vibratomo. Impostare i limiti di sezionamento sul vibratomo selezionando rispettivamente i seguenti valori di velocità, ampiezza e spessore. Sezionare completamente ogni lobo e, se le sezioni non si separano completamente tra loro, utilizzare piccole forbici per tagliarle manualmente. Raccogliere delicatamente le sezioni di impalcatura e trasferirle in PBS freddo. Con pinzette, liberare delicatamente ogni sezione dall'agarosio circostante. Per decontaminare le sezioni di impalcatura, dopo averle trasferite da PBS in provette microcentrifuga, aggiungere 90 unità per millilitro di nucleasi in PBS e incubare su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 12-24 ore. Dopo aver trasferito le sezioni in nuove provette microcentrifuga, secondo il protocollo descritto, in condizioni sterili aggiungere una soluzione antimicrobica e incubare su un agitatore rotante a temperatura ambiente per sei ore. Quindi, in condizioni sterili, risciacquare le impalcature con PBS due volte e trasferirle in un mezzo privo di siero (SFDM) prima della semina con le cellule. Per impostare una coltura all'interfaccia aria-liquido, utilizzare pinzette sterili per posizionare membrane idrofobiche su una piastra di Petri. Successivamente, trasferire ogni sezione di impalcatura descellularizzata dal mezzo SFDM su una membrana, assicurandosi che le sezioni siano distribuite uniformemente sulla membrana. Preparare piastre a sei o dodici pozzetti riempiendo i pozzetti rispettivamente con 1 ml o 0,5 ml di SFDM. Quindi, posizionare delicatamente le membrane nei pozzetti, permettendo loro di galleggiare sulla superficie del mezzo, creando così un sistema di coltura all'interfaccia aria-liquido. Per seminare le impalcature 3D, dopo la preparazione delle cellule endodermiche e il sorting cellulare attivato da fluorescenza (FACS) per arricchire l'endoderma definitivo, utilizzare un emocitometro per contare le cellule ordinate. Centrifugare le cellule a 400 G per cinque minuti. Ri-sospendere le cellule pellettizzate in SFDM a circa 100.000 cellule in 10