Generazione di cellule di topo Airway epiteliali ESC-derivati ​​dall'uso di decellularized Lung Ponteggi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dirigere la differenziazione di cellule staminali embrionali di topo in cellule epiteliali mature delle vie aeree, utilizzando una coltura 3D allestita con scaffold polmonari decellularizzati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'area dello sviluppo polmonare, come il ruolo delle contrazioni della matrice cellulare e la segnalazione del fattore di crescita durante la differenziazione della linea polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un sistema di coltura 3D in un ambiente definito privo di siero e raggiunge una robusta differenziazione epiteliale delle vie aeree con una contaminazione limitata da altre linee endodermiche. Dopo l'eutanasia di un ratto wistar adulto, secondo il protocollo di testo, fissare l'animale a una superficie di dissezione fissando le zampe anteriori e le zampe posteriori e utilizzare il 70% di etanolo per spruzzare il torace e l'addome. Crea un'incisione appena sotto la gabbia toracica. Tagliare la pelle ed esporre il diaframma. Quindi, praticare piccole incisioni attraverso il diaframma, per far ritrarre i polmoni, riducendo la possibilità di perforare i polmoni. Quindi, crea un'incisione verticale lungo lo sterno e apri la cavità toracica per accedere al cuore e ai polmoni. Quindi, con una sutura, legare la vena cava inferiore e utilizzare piccole forbici da dissezione per posizionare una piccola incisione nell'atrio sinistro. Utilizzando una siringa preparata da 10 ml con un ago calibro 25 riempito con soluzione salina eparinizzata di Hank's Balance, avviare la perfusione polmonare inserendo l'ago nel ventricolo destro e spingere il tampone attraverso la circolazione polmonare. Continua la perfusione fino a quando i polmoni diventano bianchi e il fluido che scorre dall'atrio sinistro scorre limpido. Dopo la perfusione, esporre la trachea e praticare una piccola incisione vicino alla cartilagine tiroidea per la canulazione. Quindi, con un catetere di plastica, canulare la trachea e utilizzare una sutura per fissarla in posizione. Ora, imposta un sistema di perfusione per gravità fissando una siringa da 10 ml a un supporto e un morsetto per storta. Quindi, rimuovere ed eliminare lo stantuffo della siringa. Fissare il punto di riempimento massimo sul cilindro della siringa a 20 cm sopra i polmoni, quindi collegare un rubinetto a due vie all'estremità della siringa e un lungo tubo di plastica all'altra estremità del rubinetto. Estrarre delicatamente il catetere dalla trachea e fissarlo all'estremità del tubo di plastica. Quindi, versare la soluzione di decellularizzazione nella siringa e lasciare che la soluzione riempia completamente il tubo di plastica e il catetere collegati. Riposizionare il catetere riempito di soluzione nella trachea e lavare i polmoni riempiendo la capacità polmonare totale per un minuto. Quindi rimuovere il catetere dalla trachea per consentire al fluido di defluire dai polmoni. Ripetere il lavaggio dei polmoni otto volte con la soluzione di decellularizzazione, seguito da dieci risciacqui con PBS. I polmoni appariranno bianchi al completamento delle fasi di lavaggio. Quindi sezionare la trachea e i polmoni dal collo e dalla cavità toracica. Rimuovere il tessuto in eccesso dai polmoni sezionati, compresi l'esofago e il cuore, quindi trasferire i polmoni in PBS freddo fino alla preparazione per la sezione del vibratomo. Per preparare sezioni spesse, preparare circa 15 ml di agarosio a basso punto di fusione al 2% e al 4% in PBS e abbastanza 6% di agarosio per incorporare tutti i lobi in piccoli blocchi rettangolari. Dopo aver trasferito l'agarosio in provette da 15 ml, posizionare le provette su un blocco termico e mantenere la temperatura sopra i 40 gradi Celsius per evitare la gelificazione. Usando piccole forbici, sezionare il polmone decellularizzato all'estremità di ciascun bronco lobare e staccare ciascun lobo. Quindi utilizzare fogli assorbenti per rimuovere il PBS in eccesso e trasferire i lobi al 2% di agarosio sul blocco riscaldante per cinque minuti per rivestire il tessuto. Dopo aver trasferito ogni lobo in una capsula di Petri, posizionare la capsula su un piatto freddo e lasciare gelificare la superficie per un minuto. Posizionare delicatamente i lobi nell'agarosio al 4% e, dopo l'incubazione per cinque minuti e il raffreddamento, ripetere il rivestimento con il 6% di agarosio. Dopo il rivestimento, utilizzare stampi a base metallica per incorporare ciascun lobo separatamente nel 6% di agarosio, con almeno 3 ml di agarosio che circondano il tessuto dai bordi. Successivamente, con una pinza, orientare ciascun lobo posizionando il bordo piatto più grande del tessuto sulla superficie dello stampo metallico rivolto verso lo sperimentatore e completare l'inclusione utilizzando cassette di plastica. Lasciare gelificare i blocchi su una piastra fredda per almeno 30 minuti prima della sezione del vibratomo. In alternativa, conservare i blocchi in una camera umidificata per un massimo di 12 ore a quattro gradi Celsius prima del sezionamento del vibratomo. Per preparare le sezioni, impostare il vibratomo riempiendo la camera di sezionamento con PBS freddo. Impostare un bagno di ghiaccio circostante per mantenere una temperatura fredda durante il sezionamento. A questo punto, rimuovere i blocchi dagli stampi metallici e utilizzare una lametta per tagliare l'eccesso di agarosio che circonda i lobi, mantenendo circa tre millimetri dal bordo del tessuto. Utilizzando l'adesivo, fissare il tessuto al centro della piastra del campione e immergere la piastra nella camera di sezionamento riempita di PBS. Caricare la lama di sezionamento sul vibratomo. Imposta i limiti di sezionamento sul vibratomo, selezionando rispettivamente i seguenti valori di velocità, ampiezza e spessore. Sezionare completamente ogni lobo e, se le sezioni non si separano completamente l'una dall'altra, utilizzare piccole forbici per tagliare manualmente le sezioni libere. Quindi, raccogliere delicatamente le sezioni dell'impalcatura e trasferirle in PBS freddo. Usando una pinza, libera delicatamente ogni sezione dall'agarosio circostante. Per decontaminare le sezioni dell'impalcatura, dopo averle trasferite dal PBS alle provette per microcentrifuga, aggiungere 90 unità per millilitro di nucleasi in PBS e incubare su un rotatore a temperatura ambiente per 12-24 ore. Dopo aver trasferito le sezioni in nuove provette per microcentrifuga, secondo il protocollo di testo, in condizioni sterili aggiungere una soluzione antimicrobica e incubare su un rotatore a temperatura ambiente per sei ore. Quindi, in condizioni sterili, utilizzare il PBS per sciacquare due volte gli scaffold e trasferirli in terreno privo di siero, o SFDM, prima della semina con le cellule. Per impostare una coltura di interfaccia aria-liquido, utilizzare una pinza sterile per posizionare le membrane idrofobiche su una capsula di Petri. Quindi, trasferire ogni sezione di scaffold decellularizzata da SFDM su una membrana, assicurandosi che le sezioni siano distribuite uniformemente sulla membrana. Preparare piastre a sei o dodici pozzetti riempiendo i pozzetti rispettivamente con 1 ml o 0,5 ml di SFDM. Quindi, posizionare delicatamente le membrane nei pozzetti, lasciando che la membrana galleggi sopra il terreno creando una coltura di liquidi ad aria. Per seminare scaffold 3D, dopo la preparazione di cellule endodermiche e la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, per arricchirla per un endoderma definitivo, utilizzare un emocitometro per contare le cellule selezionate. Quindi centrifugare le celle a 400 Gs per cinque minuti. Utilizzando l'SFDM, risospendere le celle pellettate a circa 100.000 celle in 10