Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere come eseguire registrazioni di patch-clamp su cellule intere in fette di cervello appena sezionate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come il modo in cui le manipolazioni di controllo sperimentali alterano l'attività di neuroni specifici in specifiche regioni del cervello. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce il mezzo per identificare un preparato X vivo cambiamenti di lunga durata nelle funzioni neuronali che si sono sviluppati in animali svegli intatti.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle funzioni neuronali nelle fette di cervello, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le cellule in coltura e i neuroni in vivo. A dimostrare la procedura sarà Francisco Garcia-Oscos, uno studente del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, prelevare delicatamente una fetta di cervello dalla camera di recupero.

Posizionare la pipetta di trasferimento nella camera di registrazione e spremere delicatamente la fetta dalla pipetta sul rivestimento del vetrino coprioggetto sul fondo della camera. Quindi, utilizzando l'obiettivo 4x del microscopio, posizionare la fetta in modo che l'area desiderata sia posizionata esattamente al centro della camera di registrazione. Dopo aver raggiunto la posizione desiderata, fissare la posizione della fetta cerebrale con la presa della fetta, nota anche come arpa.

Successivamente, passa all'obiettivo 40x e abbassa delicatamente l'obiettivo finché non tocca l'ACSF nella camera. Quindi, utilizzare la rotella di regolazione fine per mettere a fuoco il tessuto. Quando l'attenzione è a livello tissutale, osservare le cellule nella regione bersaglio.

Ora cerca una cella di destinazione. Contrassegnarlo sullo schermo del computer per facilitare la guida della micropipetta di registrazione. Sollevare la lente dell'obiettivo per lasciare spazio sufficiente per il posizionamento della micropipetta di registrazione.

In questa fase utilizzando una siringa da un millilitro, un ago per microsiringa non metallico e un filtro dedicato, riempire una micropipetta con la soluzione interna preparata in precedenza. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella micropipetta. Quindi posizionare la micropipetta in un portaelettrodo, in modo che la soluzione entri in contatto con l'elettrodo a filo rivestito di cloruro d'argento.

Serrare il tappo della pipetta, in modo che la rondella a cono formi una tenuta attorno alla micropipetta. Quindi, applicare una pressione positiva con la siringa riempita d'aria collegata al portapipetta prima di immergere la micropipetta nell'ACSF per evitare che i detriti vi entrino. Utilizzando il micromanipolatore, guidare la pipetta verso il basso verso la camera in modo che si trovi all'incirca sotto il centro dell'obiettivo immerso.

Mentre si sposta la micropipetta con il micromanipolatore a velocità medio-alta, individuare la micropipetta sullo schermo del computer e guidare la micropipetta verso la posizione della cellula sull'asse XY. Nel frattempo, misurare la resistenza della micropipetta applicando un passo di tensione. Applicare una pressione positiva per rimuovere eventuali bolle d'aria o altri corpi estranei che bloccano la micropipetta.

Dopo aver pulito la micropipetta, eseguire un offset di tensione per ridurre a zero la corrente della pipetta. Utilizzando la rotella di messa a fuoco fine del microscopio, iniziare a mettere a fuoco verso il basso mentre si abbassa gradualmente la micropipetta. Mettere sempre a fuoco prima verso il basso, quindi abbassare la micropipetta sul piano di messa a fuoco per assicurarsi che la punta della micropipetta non penetri bruscamente nella fetta.

Quando la micropipetta viene a contatto con la superficie della fetta, rallentare la velocità del micromanipolatore in modalità medio-bassa. Applicare delicatamente una leggera pressione positiva per rimuovere eventuali detriti sul percorso. Quindi avvicinarsi alla cella, alternandolo con le manopole di controllo XYZ o avvicinandosi diagonalmente dove entrambi gli assi XZ vengono modificati con la rotazione della manopola dell'asse Z.

Quando la micropipetta è abbastanza vicina alla cellula, sulla superficie cellulare apparirà una fossetta. A questo punto, applicare un'aspirazione debole e breve attraverso il tubo collegato al tubo di aspirazione del portapipetta per creare una guarnizione. Mentre si sta formando un giga-seal, utilizzare il comandante dell'amplificatore controllato dal computer per portare le cellule che contengono il potenziale al potenziale di riposo fisiologico al fine di prevenire cambiamenti improvvisi, una volta che la membrana è rotta.

Dopo che la giga-seal si è formata, compensare i capatini veloci o lenti. Qui è molto importante che l'aspirazione applicata non sia troppo forte. In caso contrario, la membrana potrebbe rompersi prima di stabilire la tenuta.

Se la guarnizione rimane stabile e al di sopra di un gigaom, applicare un'aspirazione breve e forte per rompere la membrana plasmatica. L'aspirazione deve essere breve e più forte della pressione applicata quando si stabilisce una tenuta. Al fine di rompere correttamente la membrana e ottenere una configurazione stabile dell'intera cellula.

Passando alla modalità cella nel test della membrana, è possibile visualizzare diversi parametri della cella, come la resistenza di ingresso, la resistenza in serie e le capacità della membrana. Dopo aver ottenuto la configurazione dell'intera cella, continuare a monitorare questi parametri durante la registrazione. Qui è mostrato un esempio della pendenza delle EPSC evocate da un singolo guscio di nucleus accumbens MSN.

Aumentando la temperatura da 24 a 28 e a 32 gradi Celsius, aumenta la pendenza delle EPSC evocate. Qui l'ampiezza delle EPSC evocate viene valutata in modalità voltage clamp a meno 80 millivolt. Quando la resistenza in serie aumenta, l'ampiezza dell'EPSCS evocato diminuisce.

E qui, c'è un esempio delle tracce di due neuroni che mostrano l'effetto della resistenza all'input sulla capacità del neurone di generare picchi. I neuroni sono bloccati in corrente e mantenuti a meno 80 millivolt. Quando la resistenza in ingresso aumenta, aumenta anche il numero di potenziali d'azione.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la generazione di fette di cervello sane è fondamentale. È anche importante monitorare i parametri che possono influenzare la forma d'onda del segnale elettrico, come la resistenza in serie, la resistenza di ingresso e la temperatura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dell'aspetto di base della tecnica di registrazione di intere cellule in fette di cervello.