Name: Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Impara la tecnica di registrazione whole-cell patch-clamp su fette di cervello fresche per studiare l'attività elettrica dei neuroni. Questo metodo consente di analizzare le funzioni neuronali nei circuiti cerebrali intatti.

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Questa ricerca è stata sostenuta da UT Southwestern fondi di avvio (SK).

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Nessuno degli autori hanno interessi concorrenti o interessi in conflitto.

Questo protocollo descrive la procedura di base per l&#39;esecuzione di cellule intere esperimenti di patch-clamp su neuroni in fettine di cervello. Tuttavia, la complessità, il potenziale e la sensibilità di questa tecnica non possono essere completamente descritti in questo articolo. Qui, abbiamo cercato di delineare i passaggi più elementari e sottolineare parametri importanti che devono essere controllati per ottenere registrazioni cellule intere di successo e rigorose. Per ulteriori apprendimento teorico, molti lib...

La tecnica del patch-clamp, una tecnica elettrofisiologica che è stato sviluppato alla fine del 1970 1,2, è uno strumento primario per studiare le funzioni di uno o più canali ionici nel tessuto vivo. Tra le diverse configurazioni di patch che si possono ottenere, registrazioni whole-cell patch-clamp permettono lo studio del comportamento elettrico di una parte sostanziale del neurone. Classicamente, questa tecnica viene eseguita in vitro sia su fettine cerebrali, neuroni appena dissociate, o su modelli di coltura cellulare 3. Quando eseguito sui neuroni in fettine cerebrali, questa tecnica presenta diversi vantaggi. In particolare: (i) i neuroni sono registrati nei circuiti cerebrali relativamente conservate che in qualche misura, e rispetto alle preparazioni di coltura cellulare, forniscono un ambiente che è fisiologicamente rilevanti 3. Questo permette di catturare in anticipo, o anche il monitoraggio in tempo reale, gli eventi cellulari e molecolari che sono attivati ​​da qualsiasi tipo di pharmacolog acutamanipolazioni iCal - una risoluzione temporale che non può essere raggiunto utilizzando classica in condizioni in vivo; (ii) capacità di identificare visivamente le regioni del cervello in fettine di cervello permette un&#39;elevata specificità regionale 3 sia per la regione del cervello studiato e per i neuroni specifici quando esprimono marcatori fluorescenti; (iii) l&#39;accesso allo spazio intracellulare della cellula aprendo una porzione significativa della membrana plasmatica (in contrasto pungere la membrana con una micropipetta tagliente per le registrazioni intracellulari) 4. A sua volta, questo consente al contenuto o la concentrazione di ioni specifici che compongono la soluzione interna da modificare bersagli molecolari modo o meccanismi cellulari possono essere studiati in condizioni diverse. Ad esempio, su di stabilire cellula intera configurazione, qualsiasi agente farmacologico specifico (ad esempio, gli antagonisti) che si può aggiungere alla micropipetta di registrazione (patch pipetta) soluzione sarà direttamente diffondersi nel citoplasma e di agire sul suo putative bersagli intracellulari senza alterare la funzione obiettivo in cellule vicine. Inoltre, rispetto alla registrazione micropipetta tagliente, la grande apertura sulla punta dell&#39;elettrodo patch clamp offre minore resistenza, meno rumore CONCORRENTI, e quindi un migliore accesso elettrico all&#39;interno della cella 4. Si noti tuttavia che l&#39;ampia apertura sulla punta della pipetta può portare alla dialisi cellule, e quindi la perdita di macchinario molecolare intracellulare che può essere critico per l&#39;espressione dei fenomeni biologici che sono in fase di studio 5,6. In questo caso, le registrazioni elettrodo taglienti può essere più adatto. Questo tipo di registrazioni richiede micropipette con un poro che è molto più piccolo di quelli usati per le registrazioni cellule intere, impedendo così la maggior parte lo scambio ionico tra lo spazio intracellulare e la soluzione pipetta interna. Ogni forma di esperienza (acuta o cronica), compreso l&#39;apprendimento 7-10, l&#39;esposizione a sostanze d&#39;abuso 11,12, lo stress 13,14, ecc, possono alterare i vari aspetti della funzione neuronale in regioni specifiche del cervello. Poiché queste alterazioni spesso richiedono tempo per svilupparsi (ore o giorni), le registrazioni integrali delle cellule in fettine di cervello da animali che sono stati sottoposti a una specifica esperienza permettono ai ricercatori di identificare questi cambiamenti. In sostanza, molti (se non tutti) i componenti che partecipano nelle funzioni neuronali (per esempio, ligando-attivato canali ionici, canali ionici voltaggio-dipendenti, trasportatori neurotrasmettitori), e in tal modo l&#39;attività del circuito del cervello e del comportamento, può essere alterato da esperienza (l&#39;esperienza-dipendente plasticità) 10,15-17. A livello neuronale, l&#39;attività circuito cerebrale emerge dalle interazioni costanti tra sinaptica (ad esempio, trasmissione glutammato) e fattori intrinseci eccitabilità cellulare (per esempio, canali ionici axosomato-dendritica: sodio, Na +, potassio, K +, e di calcio, Ca 2+ ). In condizioni specifiche che utilizzano da tE-CELL patch-clamp tecniche elettrofisiologiche, alterazioni di segnale provenienti in particolare da variazioni sinaptica vs. eccitabilità intrinseca può essere isolato. Nella maggior parte dei casi, l&#39;eccitabilità sinaptica è valutato utilizzando la tecnica voltage-clamp whole-cell. Questa modalità di registrazione permette la misura di correnti ioniche [ad esempio, mediati dai recettori di acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic ( recettori AMPA) e recettori N-metil-D-aspartico (NMDA)] attraverso la membrana plasmatica neuronale, mentre tengono il potenziale di membrana ad una tensione impostata. Qui, sperimentatori utilizzano le soluzioni interne micropipetta contenenti cesio (Cs +), una vasta bloccanti di canali K + (chiave fattori intrinseci eccitabilità). Su creazione di cellula intera configurazione, la diffusione di Cs + nello spazio intracellulare bloccherà canali K +, e quindi permetterà sia relativamente efficiente spazio-clamp e presfogare influenza dei fattori intrinseci eccitabilità su altre misure. Problemi di spazio-clamp, cioè, la difficoltà di tensione-clamp tutta la cella, sorgono quando si registra cellule di forma irregolare (ad esempio, neuroni), e in particolare neuroni con un vasto e complesso dendritic arbor 18,19. Poiché morsetto tensione somatica controlli scarsamente voltaggio nella struttura dendritica dei neuroni, vari aspetti dei segnali elettrici dendritiche in esame sono distorti in maniera dendritica distanza-dipendente. Combinato con strumenti farmacologici come picrotoxin (acido gamma-aminobutirrico, GABA A antagonista del recettore) o acido kinurenico (ampio bloccante dei recettori del glutammato) disciolti nella soluzione extracellulare (fluido cerebro-spinale artificiale, ACSF), questa tecnica permette di misurare glutammato recettore e le correnti GABA A R-mediata, rispettivamente. Al contrario, l&#39;eccitabilità intrinseca viene generalmente valutato in modalità di registrazione corrente-clamp.Al contrario di registrazione voltage-clamp, questa modalità di registrazione permette la misura delle variazioni potenziali di membrana indotte da correnti ioniche che fluisce attraverso la membrana plasmatica neuronale. Tipicamente, alterazione dell&#39;eccitabilità intrinseca è valutata attraverso cambiamenti nella capacità di neuroni di generare potenziali d&#39;azione, che richiede sia Na + e canali del K +. Pertanto, quando si eseguono registrazioni corrente-clamp, micropipette sono riempiti con una soluzione interna che contiene K + anziché Cs +. In combinazione con agenti farmacologici che bloccano glutammato e GABA A correnti recettoriali disciolti nel ACSF, questo disegno sperimentale permette la misura del contributo di fattori intrinseci (ad esempio, K + canali) a neuronale senza essere contaminati da potenziali variazioni dell&#39;eccitabilità sinaptica fattori. Questo articolo descrive i passi procedurali necessari di base to (i) prepara fette di cervello sane; (Ii) ottenere cellula intera configurazione, e (iii) monitorare i parametri fondamentali per valutare sinaptica e l&#39;eccitabilità intrinseca.

<table><tbody><tr><td>Generatore di impulsi di stimolo isolato</td><td>A.M.P.I</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Unità di isolamento (ISO-Flex)</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore controllato da computer&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione digitale</td><td>Molecular Devices</td><td>Microscopio Digidata 1500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Micromanipolatore Olympus</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Camera e riscaldatore in linea</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice a vibratomo</td><td>Leica&nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td>Q Imaging</td><td>QIClick-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per pipette Narishige PC-10</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro</td><td>WPI</td><td>TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>Fissaggio per fetta (arpa)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0255</td><td></td></tr><tr><td>Fetta Camera</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa non metallico</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per siringa</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>Pistola per colla</td><td>Home Depot</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di dispersione di gas</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>varie</td><td></td></tr><tr><td>forbici per decapitazione</td><td>Home Depot</td><td>100649198</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Manico #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Piccole forbici con punte affilate dritte</td><td>World Precision Instruments</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per canulazione del vaso&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500453</td><td></td></tr><tr><td>Pinze emostatiche curve</td><td>World Precision Instruments</td><td>501288</td><td></td></tr><tr><td>Economy Pinzette #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>501976-6</td><td></td></tr><tr><td>Spatola</td><td>Fisher Scientific</td><td>14357Q</td><td></td></tr><tr><td>Spatola</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Lab Depot</td><td>CFP1-110</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solutions</td></tr><tr><td colspan="4">Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2&ndash; 7,3, 280&ndash; 290 mOsm)</></td></tr><tr><td>acido D-gluconico forte 50%&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cesio-OH (CsOH) 50%&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 2,8 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0,4 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>tetraetilammonio-Cl, 5 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0,3 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">K-Gluconate soluzione interna (pH 7.2&ndash; 7,3, 280&ndash; 290 mOsm)</forte></td></tr><tr><td>K D-gluconato, 120 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0,2 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Liquido cerebrospinale artificiale standard (ACSF, osmolarità &asinto; 300-310 mOsm)</td></tr><tr><td>KCl, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 119 mM</td><td>Sigma Aldrich/ vari</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#8226; H2O, 1 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, 26,2 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio, 11 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O, 1,3 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2- 2H2O, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Composti aggiuntivi utilizzati per la preparazione delle soluzioni</td></tr><tr><td>KOH</td><td>vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acido Kynurenic</td><td>Sigma Aldrich/vari</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

registrazioni whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp registrazione è una tecnica elettrofisiologica che permette lo studio delle proprietà elettriche di una parte sostanziale del neurone. In questa configurazione, la micropipetta è a stretto contatto con la membrana cellulare, che impedisce la dispersione di corrente e quindi fornisce misure di corrente ionica più preciso del metodo di registrazione elettrodo affilato intracellulare precedentemente utilizzato. Classicamente, la registrazione a cellula intera può essere eseguita su neuroni in vari tipi di preparati, compresi i modelli di colture cellulari, i neuroni dissociate, i neuroni in fettine di cervello, e in animali anestetizzati o sveglio intatte. In sintesi, questa tecnica ha enormemente contribuito alla comprensione della passivi e attivi proprietà biofisiche di cellule eccitabili. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che fornisce informazioni sulle modalità specifiche manipolazioni (ad esempio, farmacologico, sperimentatore indotta plasticità) possono alterare le funzioni neuronali specifici ochannels in tempo reale. Inoltre, significativa apertura della membrana plasmatica permette alla soluzione pipetta interna di diffondersi liberamente nel citoplasma, predisporre mezzi per farmaci introduzione, ad esempio, agonisti o antagonisti di specifiche proteine ​​intracellulari, e manipolare tali obiettivi senza alterare le loro funzioni in cellule vicine. Questo articolo si concentrerà sulla registrazione a cellula intera eseguita su neuroni in fettine cerebrali, una preparazione che ha il vantaggio di registrazione neuroni relativamente ben conservati circuiti cerebrali, cioè in un contesto fisiologicamente rilevanti. In particolare, quando combinato con adeguate farmacologia, questa tecnica è uno strumento potente che consente di identificare neuroadaptations specifici che si sono verificati in seguito a qualsiasi tipo di esperienze, quali l&#39;apprendimento, l&#39;esposizione a sostanze d&#39;abuso, e lo stress. In sintesi, le registrazioni a cellula intera patch-clamp in fettine di cervello forniscono i mezzi per misurare in ex vivo preparazione cambiamenti duraturinelle funzioni neuronali che si sono sviluppate negli animali svegli intatti.

Temperatura, un fattore che è facilmente controllato dallo sperimentatore, influenza le proprietà biofisiche di canali ionici e recettori, e quindi la forma d&#39;onda delle correnti post-sinaptiche (PSC) (EPSC e iPSCs) e la capacità dei neuroni di suscitare picchi. Figura 3 la figura 4 mostra l&#39;effetto della temperatura sulla neuronale e la pendenza della EPSCs evocati (eEPSCs) rispettivamente. Il pattern di cottura (Figura 3) (...

Questo protocollo descrive passaggi procedurali di base per l&#39;esecuzione di cellule intere registrazioni patch-clamp. Questa tecnica consente di studiare il comportamento elettrico dei neuroni, e quando eseguito in sezioni di cervello, permette di valutare diverse funzioni neuronali da neuroni che sono ancora integrati in circuiti cerebrali relativamente ben conservati.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere come eseguire registrazioni con tecnica del patch-clamp su cellule intere in sezioni cerebrali appena dissezionate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come ad esempio in che modo manipolazioni sperimentali controllate alterano l'attività di specifici neuroni in determinate aree cerebrali. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fornire un mezzo per identificare modifiche persistenti nelle funzioni neuronali in preparazioni ex vivo, sviluppatesi in animali integri e vigili.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle funzioni neuronali in sezioni cerebrali, può essere applicato anche ad altri sistemi, come cellule in coltura e neuroni in vivo. A dimostrare la procedura sarà Francisco Garcia-Oscos, uno studente del mio laboratorio. Per iniziare la procedura, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica con punta sagomata, aspirare delicatamente una sezione cerebrale dalla camera di recupero.Posizionare la pipetta di trasferimento nella camera di registrazione e, delicatamente, spingere la sezione fuori dalla pipetta facendola adagiare sul

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Questo video mostra la tecnica del patch clamp a cellula intera in una fetta di cervello di topo. Questa tecnica stabilisce una connessione stabile tra la micropipetta e la membrana del neurone, che viene ulteriormente interrotta per stabilire una configurazione dell'intera cellula per studiare la salute del neurone e le risposte fisiologiche.

Definizione di una configurazione a cella intera tramite il metodo Patch Clamp

Questo video mostra una tecnica per la registrazione patch-clamp dalla superficie della membrana dendritica. Questo aiuta a esaminare direttamente le proprietà elettriche dei dendriti e dei canali ionici voltaggio-dipendenti sottostanti nei neuroni dopaminergici.

Registrazioni Patch-Clamp dal dendrite di un neurone dopaminergico in una fetta di cervello

Questo video mostra il posizionamento di una pipetta a punta fine vicino a fette di cervello, formando un sigillo con una cellula neuronale. L'aspirazione rompe la membrana cellulare, creando così un patch clamp a cellula intera che consente misurazioni di corrente per esperimenti di elettrofisiologia.

Stabilire una configurazione di voltage-clamp a cellula intera per registrazioni elettrofisiologiche in fette di cervello

Questo video mostra la procedura per eseguire registrazioni elettrofisiologiche nei neuroni della substantia gelatinosa (SG) di fette di midollo spinale, utilizzando tecniche di patch-clamp a cellula intera per analizzare i modelli di attivazione dei neuroni. Questo metodo consente lo studio delle risposte neurali agli stimoli nei neuroni SG del midollo spinale.

Registrazione del patch clamp a cellula intera in un neurone di substantia gelatinosa di una fetta di midollo spinale

Questo video mostra la procedura per mappare le connessioni sinaptiche fissando una fetta di cervello, posizionando pipette per ottenere configurazioni di cellule intere e stimolando i neuroni presinaptici a registrare le risposte postsinaptiche, chiarendo così la connettività neuronale.

Registrazione accoppiata con patch clamp delle connessioni neuronali in fette cerebrali acute

Le registrazioni di patch-clamp e il riempimento simultaneo di biocitina intracellulare di neuroni accoppiati sinapticamente in fette cerebrali acute consentono un'analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere le fasi tecniche essenziali della registrazione elettrofisiologica da microcircuiti neuronali e la loro successiva analisi morfologica.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

Questo protocollo viene illustrata l'implementazione di un ottimizzato N-metilico-D-glucamine (NMDG) protezione recupero metodo di preparazione di fetta di cervello. Una formulazione di singolo supporto viene utilizzata per ottenere in modo affidabile fette di cervello sano da animali di tutte le età e per diverse applicazioni sperimentali.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

Le registrazioni subcellulari di patch-clamp offrono la possibilità di studiare le proprietà funzionali dei dendriti. Tuttavia, queste strutture fini non sono facilmente accessibili a causa del loro piccolo diametro. Il protocollo qui descritto mira a facilitare la raccolta di registrazioni stabili e affidabili dai dendriti dei neuroni dopaminergici in fette in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

La tecnica del patch clamp fetta è un metodo efficace per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nella proprietà intrinseche e plasticità delle sinapsi eccitatorie o inibitorie.

Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto.

Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un patch-clamp a cellule intere su fette di cervello contenenti neuroni kisspeptina, il modulatore primario delle cellule dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH). Aggiungendo conoscenze sull'attività dei neuroni kisspeptina, questo strumento elettrofisiologico è servito come base per progressi significativi nel campo della neuroendocrinologia negli ultimi 20 anni.

Neuroni ipotalamici di kisspeptina come bersaglio per le registrazioni di patch-clamp a cellule intere

Impara la tecnica di registrazione whole-cell patch-clamp su fette di cervello fresche per studiare l'attività elettrica dei neuroni. Questo metodo consente di analizzare le funzioni neuronali nei circuiti cerebrali intatti.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

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