Name: Il Ex Vivo Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Impara a coltivare organoidi intestinali di topo ex vivo e stimolarli con PAMPs e Listeria monocytogenes. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica e le interazioni ospite-patogeno nell'epitelio intestinale.

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Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel e Bettina Heid per le discussioni tecniche. Gli autori ringraziano la dottoressa Nanda Nanthakumar per aver fornito le cellule Caco-2. Gli autori ringraziano anche il Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) della Virginia Tech. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (all'I.C.A.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La cultura e la manutenzione di organoidi intestinali è una procedura che può essere masterizzato da qualsiasi persona con la tecnica di coltura tissutale adeguata. Ci sono sottigliezze in passaging rispetto a crescere le cellule in un monostrato più convenzionale, ma queste sottigliezze non sono difficili da superare. I passaggi critici di questo metodo comporta poter far crescere le organoidi ad una densità sufficientemente elevata per la semina ottimale. Gli esperimenti devono essere ridimensionati con organoidi come...

La capacità di raccogliere e organoidi coltura primaria sono stati descritti per intestino tenue, colon, pancreas, fegato e cervello e sono progressi entusiasmanti germano per comprendere un fenomeno fisiologicamente più rappresentativo per la biologia dei tessuti 1-5. I primi metodi che descrivono la cultura e la manutenzione di piccoli organoidi intestinale è stata riportata da Sato et al. Fuori dal laboratorio di Hans Clevers 1. Prima di questo metodo, la raccolta e la coltura di cellule epiteliali intestinali primarie ha dimostrato di essere limitato e inefficace nel sostenere la crescita delle cellule epiteliali. Metodi incluse dissociazione del tessuto tramite incubazione con enzimi, come collagenasi e dispasi, che finirebbe per portare alla conseguenza di fibroblasti primari mescolati 6. Queste condizioni potrebbero anche essere il momento limitati a sostenere la coltura delle cellule epiteliali. Minimo a nessun nicchia delle cellule epiteliali possano costituire, come le cellule epiteliali sarebbero entrati a causa di apoptosila mancanza di fattori di crescita appropriati o perdita di integrità contatto, definito anokis 7. L&#39;avvento del sistema di coltura 3D-organoide ha fornito un metodo per cellule intestinali primarie coltura contenenti una gamma di tipi di cellule intestinali in coltura sostenuta 1. Questi organoidi epiteliali presentano vantaggi rispetto alle linee cellulari è che essi sono composti da diverse cellule differenziate, e meglio imitano l&#39;organo che sono derivati ​​da 8 in vivo. Il processo di definitiva &quot;crescere un mini budello in un piatto&quot; ha dimostrato di essere un valido strumento per valutare la risposta di epitelio intestinale sotto diversi stimoli. Indagare l&#39;interazione delle cellule intestinali primarie con modelli patogeni microbici associati molecolari (PAMPs) è rilevante per il campo dell&#39;immunologia come questi modelli molecolari in grado di regolare diverse risposte sia da host e microbo 9. Non solo è possibile investigatori ora esplorare queste interazioni con organoidi del mouse, ma hannopuò essere colta da esseri umani come ben 2. Questa tecnologia ha il potenziale per alterare radicalmente la medicina personalizzata e si è tentati di speculare sui progressi che questa tecnica renderà possibile in un prossimo futuro. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un protocollo per la coltura, l&#39;espansione e il trattamento di organoidi intestinali con una varietà di stimoli. Tali stimoli possono infine variare da vaccini, PAMPs batteriche, agenti patogeni dal vivo, gastrointestinale (GI) e cancro terapeutica. L&#39;isolamento e la coltura di topo organoidi intestinali è stato adattato da Sato et al. Anche se ci sono lievi deviazioni dal metodo originale, il prodotto finale è organoide cultura è ancora raggiunto quando si segue questo protocollo. Questo metodo è focalizzato sulla descrizione una tecnica adeguata per una corretta normalizzazione quando si lavora con strutture cellulari non omogenei, che devono essere presi in considerazione quando condurre un saggio basato su cellule nterra d&#39;ombra.

<table><tbody><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td> <td>(Sezione 1,3,6) O marca equivalente</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>Thermo</td><td></td> <td>(Sezione 1,3)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td> <td>(Sezione 1,6) Per le cellule Caco-2 e HEK293 Rspondin1</td></tr><tr><td>Linea cellulare</td><td></td><td></td> <td>secernente HEK293T-Rspondin1(Sezione 1) Descritto e modificato da Kim, K.A. et al. Le particelle lentivirali contenevano cDNA RSPO1(NM_138683) ORF clonato in una dorsale pReceiver-Lv105 ordinata e acquistata su misura da GeneCopoeia.</td></tr><tr><td>Tubo conico da 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td> <td>(Sezione 1) O borraccia</td></tr><tr><td>T-175 di</td> marca equivalente <td>Corning</td><td>431079</td> <td>(Sezione 1) O marca equivalente.</td></tr><tr><td>Matrice proteica</td><td>Corning</td><td>356231</td> <td>(Sezione 2,3,4,5,6) Matrigel Fattore di crescita ridotto</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's (DPBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td><td>(Sezione 2,3)</td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td> <td>(Sezione 2,3) Advanced DMEM/F12</td></tr><tr><td>Corning 24 pozzetti TC Piastre</td><td>Corning</td><td>3524</td> <td>(Sezione 2)</td></tr> <tr><td>Supplemento N2 100x&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td> <td>(Sezione 2)</td></tr> <tr><td>B27 senza vitamina A 50 volte</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>12587-010&nbsp;</td><td>(Sezione 2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td> <td>(Sezione 2)</td></tr> <tr><td>Integratore di glutammina (Glutamax)</td> <td>Life Technologies</td><td>35050-061</td> <td>(Sezione 2) Può combinarsi con Advanced DMEM / F12</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td> <td>(Sezione 2) Può combinarsi con Advanced DMEM / F12</td></tr><tr><td>10 ml di pipetta sierologica</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>(Sezione 2) O marca equivalente</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td> <td>(Sezione 2) Stock = 100 mg/ml</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td> <td>(Sezione 2) Stock = 1 M</td></tr> di <tr><td>topo ricombinante EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td><td>(Sezione 2) Stock = 500 mg/ml</td></tr><tr><td>Rocker Variable</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>(Sezione 3)</td></tr><tr>forbici <td></td><td></td><td>da dissezione</td><td>(Sezione 3)</td></tr><tr><td>pinze</td><td></td><td></td><td>(Sezione 3)</td></tr><tr><td>vetrini</td><td></td><td></td><td>(Sezione 3)</td></tr><tr><td>pinzette</td><td></td><td></td> da dissezione<td>(Sezione 3)</td></tr><tr><td>25 ml Sierologico Pipet</td><td>Falcon</td><td></td><td>(Sezione 3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td> <td>(Sezione 3) 0,5 M o alternativa Piastra</td></tr> di Petri sterile EDTA di grado TC <tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td> <td>(Sezione 3) O piastra TC di dimensioni uguali</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td> <td>(Sezione 4)</td></tr><tr><td>Ago di scorrimento di precisione</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td> <td>(Sezione 4) 23G x 1 1/4 (0,6 mm x 30 mm)</td></tr><tr><td>Flagellina da Bacillus subtilis</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&nbsp;</td><td>(Sezione 5,6)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(Sezione 5,6)&nbsp;( Murray&nbsp; et&nbsp;al.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td> <td>(Sezione 5,6) O marca equivalente</td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>211065</td> <td>(Sezione 5)</td></tr> <tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td> <td>(Sezione 5)</td></tr> <tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td> <td>(Sezione 6)</td></tr> <tr><td>Tripsina</td><td>gibco</td><td>25200056</td> <td>(sezione 6)</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td> <td>(Sezione 6)</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecuar Devices</td><td></td> <td>(Sezione 6)</td></tr><tr><td>96 Piastra per saggi</td><td>a pozzetti Corning</td><td>3603</td> <td>(Sezione 6) Piastra nera, fondo trasparente Trattato TC</td></tr><tr><td>Colorante</td> nucleare <td>Tecnologie per la vita</td><td>H1399</td> <td>(sezione 6) Pallone Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>(Sezione 6) O marca equivalente</td></tr><tr><td>Tubo conico da 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>(Sezione 1,3) O marca equivalente</td></tr><tr><td>Tubo in polipropilene da 1,7 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>O marca equivalente</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>O marca equivalente</td></tr><tr><td>TNF-alpha&nbsp;</td>Kit per <td>il test di espressione genica</td><td>Mm 00443260_g1</td> <td>Taqman Applied Biosystems</td></tr><tr><td>IL-6&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td> <td>(Mm 00446190_m1 Kit per</td><td>il test di espressione genica Taqman</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td> Kit per <td>il test di espressione genica Mm 00434228_m1 Taqman</td><td></td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td> Kit per <td>il test di espressione genica Mm 00434225_m1 Taqman</td><td></td></tr><tr><td>18s</td> Kit per il test di espressione genica <td>Applied Biosystems</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>Taqman</td></tr><tr><td>7500 Sistema PCR veloce in tempo reale</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler a gradiente Nexus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di reazione ottica veloce a 96 pozzetti, 0,1 mL</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>Proteina R-spondina 1 ricombinante di topo</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/ml</td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

il<em&gt; ex vivo</em&gt; cultura e pattern recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

organoidi intestinali primarie sono un modello di sistema di valore che ha il potenziale per avere un impatto significativo nel campo delle mucose immunologia. Tuttavia, la complessità delle caratteristiche di crescita organoide portano avvertimenti significativi per l&#39;investigatore. In particolare, i modelli di crescita di ogni singolo organoide sono molto variabili e creano una popolazione eterogenea di cellule epiteliali in coltura. Con tali limitazioni pratiche coltura tissutale comune non possono essere semplicemente applicate al sistema organoide a causa della complessità della struttura cellulare. Conteggio e placcatura basato esclusivamente sul numero di cellule, che è comune a cellule separate individualmente, quali le linee cellulari, non è un metodo affidabile per organoidi se viene applicata una tecnica di normalizzazione. Normalizzazione al contenuto totale di proteine ​​è fatta complessa a causa della matrice proteica residente. Queste caratteristiche in termini di numero di cellule, forma e tipo di cellula dovrebbero essere presi in considerazione quando si valuta con secretotende dalla massa organoide. Questo protocollo è stato generato per delineare una procedura semplice per la cultura e il trattamento di piccoli organoidi intestinale con agenti patogeni microbici e pamp (PAMPs). Si sottolinea, inoltre, le tecniche di normalizzazione che dovrebbero essere applicate quando l&#39;analisi delle proteine ​​sono condotte dopo una tale sfida.

Quando si segue questo protocollo per coltivare organoidi intestinali, caratteristica a forma di sfera organoidi saranno presenti dopo la raccolta. L&#39;aggiunta di R-spondin1 mezzi condizionati ogni giorno avvierà la crescita e la gemmazione delle organoidi. La crescita di organoidi è mostrato in Figura 1A - F e rappresentativa organoidi intestinali nei giorni 1, 2, 4, 5, 6 e il giorno 14. Figura 1F rappresenta le cara...

Qui, un protocollo per raccogliere, gestire e trattare il mouse piccoli organoidi intestinale con modelli patogeni associati molecolari (PAMPs) e Listeria monocytogenes è descritto, così come l&#39;accento sulla espressione genica e corrette tecniche di normalizzazione per le proteine.

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare gli effetti di una sfida patogena su organoidi dell'intestino tenue, con particolare attenzione alle tecniche di normalizzazione rispetto al numero totale di cellule. Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'immunologia innata e della immunologia mucosale, fornendo un mezzo per studiare in vitro le interazioni tra patogeni e cellule epiteliali intestinali. Fondamentale per questa procedura è il metodo di normalizzazione rispetto al numero totale di cellule, una necessità quando si misurano proteine secrete dagli organoidi mediante tecniche come il saggio ELISA. Per raccogliere cripte dell'intestino tenue di topo per la coltura di organoidi, iniziare utilizzando un vetrino sterile per raschiare delicatamente i villi dalla superficie luminale dell'intestino tenue. Successivamente, utilizzare forbici da dissezione per tagliare il tessuto in strisce lunghe 1-2 centimetri e posizionare le strisce in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di PBS freddo. Mescolare il contenuto mediante inversione delicata e lasciare sedimentare il tessuto sul fondo del tubo. Quindi, aspirare il PBS e lavare le strisce altre tre volte con 10 millilitri di PBS fresco, ogni volta nello stesso modo. Al termine dell'ultimo lavaggio, posizionare il tubo sul ghiaccio per dieci minuti. Sostituire quindi il PBS con 25 millilitri di PBS integrato con EDTA 2 millimolare, in un secchio di ghiaccio su una piattaforma oscillante per 45 minuti. Al termine dell'incubazione, lasciare sedimentare le strisce di tessuto sul fondo del tubo e sostituire il PBS-EDTA con 10 millilitri di PBS integrato con FBS al 10%. Agitare vigorosamente il tubo a mano per dieci volte. Lasciare poi sedimentare il tessuto sul fondo del tubo e trasferire il soprannatante in un tubo conico da 15 millilitri etichettato come Frazione 1. Agitare il tessuto in PBS-FBS altre cinque volte, trasferendo ogni volta il soprannatante in un nuovo tubo di frazione. Dopo l'ultima agitazione, centrifugare tutti i campioni e risospendere i pellet in cinque millilitri di DMEM/F12 preriscaldato senza fattori di crescita aggiunti. Centrifugare nuovamente i campioni e aspirare quattro millilitri di soprannatante da ciascun tubo. Risospendere i pellet nell'ultimo millilitro di mezzo rimanente e utilizzare aliquote da 20 microlitri di ciascuna frazione per visualizzare le cripte e i detriti su vetrini. Dopo aver raggruppato le frazioni appropriate per ottenere la massima percentuale di cripte rispetto ai detriti, centrifugare le frazioni combinate e aspirare tutto il soprannatante tranne gli ultimi 50-100 microlitri. Mantenendo i tubi sul ghiaccio, aggiungere 1 millilitro di matrice proteica alle frazioni combinate, aspirando e dispensando lentamente per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Quindi, aggiungere 50 microlitri della sospensione di matrice proteica/cripte al centro di ogni pozzetto di una piastra da 37

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Un metodo semplice per determinare primario murino organoide tumore colon è descritto. Questo metodo utilizza la funzione che le cellule tumorali del colon sopravvivere e crescere in organoidi in terreni contenenti fattori di crescita limitate, mentre colon normale epiteliale non lo fanno.

In vitro organoide Cultura di primari tumori del colon mouse

La tecnologia di imaging migliorata consente l'imaging tridimensionale degli organi durante lo sviluppo. Qui descriviamo un intero sistema di coltura di organi che consente l'imaging dal vivo dei villi in via di sviluppo nell'intestino fetale del topo.

Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per Ex Vivo La manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale Imaging in diretta di Sviluppo del villo

Piccoli organoidi cripta intestinali in coltura ex vivo fornire un sistema di coltura tessuto che racchiude in sintesi la crescita delle cripte dipendenti sulle cellule staminali e la loro nicchia. Abbiamo stabilito un metodo per dosare il profilo metabolico in tempo reale in organoidi cripta del mouse primario. Abbiamo trovato organoidi mantengono le proprietà fisiologiche definite dalla loro fonte.

Real Time Analisi di profilo metabolico in Ex Vivo Culture del mouse intestinale Cripta organoide

In questo protocollo video diamo una spiegazione passo dopo passo della trasduzione lentivirale negli organoidi dell'epitelio intestinale primario e del processamento e dell'analisi a valle di queste colture mediante RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e immunoistochimica.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

La coltura di organi ex vivo consente lo studio dei processi biologici nel contesto dell'architettura del tessuto intatto. Qui, introduciamo un metodo di coltura ex vivo del colon di topo, che può essere utilizzato per studiare l'immunità innata e la difesa antimicrobica dell'ospite nell'intestino.

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture e il suo uso in Antimicrobial Host Defense Studies

Questo articolo presenta un metodo unico per analizzare le interazioni ospite-microbioma utilizzando un nuovo sistema di coltura di organi intestinali per esperimenti ex vivo.

Un sistema di coltura di organi intestinali intestinali per l'analisi delle interazioni ospite-microbiota

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell'intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Il presente protocollo descrive la creazione di un sistema di organoidi del colon murino per studiare l'attività e il funzionamento delle cellule staminali del colon in un modello knockout di claudina-7.

Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali

Descriviamo un protocollo per isolare le piccole cripte intestinali murine e la coltura di organoidi 3D intestinali dalle cripte. Inoltre, descriviamo un metodo per generare organoidi da una singola cellula staminale intestinale in assenza di una nicchia cellulare sub-epiteliale.

La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi

Impara a coltivare organoidi intestinali di topo ex vivo e stimolarli con PAMPs e Listeria monocytogenes. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica e le interazioni ospite-patogeno nell'epitelio intestinale.

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