Il
18 maggio 2016
Qui, un protocollo per raccogliere, gestire e trattare il mouse piccoli organoidi intestinale con modelli patogeni associati molecolari (PAMPs) e Listeria monocytogenes è descritto, così come l'accento sulla espressione genica e corrette tecniche di normalizzazione per le proteine.
L'obiettivo generale di questa procedura è misurare gli effetti di una sfida patogena su organoidi dell'intestino tenue, con particolare attenzione alle tecniche di normalizzazione rispetto al numero totale di cellule. Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'immunologia innata e della immunologia mucosale, fornendo un mezzo per studiare in vitro le interazioni tra patogeni e cellule epiteliali intestinali. Fondamentale per questa procedura è il metodo di normalizzazione rispetto al numero totale di cellule, una necessità quando si misurano proteine secrete dagli organoidi mediante tecniche come il saggio ELISA. Per raccogliere cripte dell'intestino tenue di topo per la coltura di organoidi, iniziare utilizzando un vetrino sterile per raschiare delicatamente i villi dalla superficie luminale dell'intestino tenue. Successivamente, utilizzare forbici da dissezione per tagliare il tessuto in strisce lunghe 1-2 centimetri e posizionare le strisce in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di PBS freddo. Mescolare il contenuto mediante inversione delicata e lasciare sedimentare il tessuto sul fondo del tubo. Quindi, aspirare il PBS e lavare le strisce altre tre volte con 10 millilitri di PBS fresco, ogni volta nello stesso modo. Al termine dell'ultimo lavaggio, posizionare il tubo sul ghiaccio per dieci minuti. Sostituire quindi il PBS con 25 millilitri di PBS integrato con EDTA 2 millimolare, in un secchio di ghiaccio su una piattaforma oscillante per 45 minuti. Al termine dell'incubazione, lasciare sedimentare le strisce di tessuto sul fondo del tubo e sostituire il PBS-EDTA con 10 millilitri di PBS integrato con FBS al 10%. Agitare vigorosamente il tubo a mano per dieci volte. Lasciare poi sedimentare il tessuto sul fondo del tubo e trasferire il soprannatante in un tubo conico da 15 millilitri etichettato come Frazione 1. Agitare il tessuto in PBS-FBS altre cinque volte, trasferendo ogni volta il soprannatante in un nuovo tubo di frazione. Dopo l'ultima agitazione, centrifugare tutti i campioni e risospendere i pellet in cinque millilitri di DMEM/F12 preriscaldato senza fattori di crescita aggiunti. Centrifugare nuovamente i campioni e aspirare quattro millilitri di soprannatante da ciascun tubo. Risospendere i pellet nell'ultimo millilitro di mezzo rimanente e utilizzare aliquote da 20 microlitri di ciascuna frazione per visualizzare le cripte e i detriti su vetrini. Dopo aver raggruppato le frazioni appropriate per ottenere la massima percentuale di cripte rispetto ai detriti, centrifugare le frazioni combinate e aspirare tutto il soprannatante tranne gli ultimi 50-100 microlitri. Mantenendo i tubi sul ghiaccio, aggiungere 1 millilitro di matrice proteica alle frazioni combinate, aspirando e dispensando lentamente per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Quindi, aggiungere 50 microlitri della sospensione di matrice proteica/cripte al centro di ogni pozzetto di una piastra da 37
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento, il mantenimento e il trattamento di organoidi dell'intestino tenue di topo con pattern molecolari associati ai patogeni (PAMPs) e Listeria monocytogenes. Si concentra sull'espressione genica e sulle corrette tecniche di normalizzazione per l'analisi delle proteine.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Microbiologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- Gli organoidi dell'intestino tenue del topo sono preziosi per lo studio della biologia intestinale.
- I pattern molecolari associati ai patogeni (PAMPs) svolgono un ruolo nelle risposte immunitarie.
- Comprendere l'espressione genica è fondamentale per interpretare i risultati sperimentali.
- Le tecniche di normalizzazione sono essenziali per un'analisi accurata delle proteine.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per lavorare con organoidi dell’intestino tenue di topo.
- Esplorare gli effetti dei PAMP e di Listeria monocytogenes su questi organoidi.
- Evidenziare l’importanza dell’analisi dell’espressione genica e della normalizzazione.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di organoidi dell'intestino tenue di topo.
- Mantenimento delle colture di organoidi in condizioni specifiche.
- Trattamento degli organoidi con PAMP e Listeria monocytogenes.
- Analisi delle tecniche di espressione genica e di normalizzazione delle proteine.
Risultati principali
- È stato raggiunto un mantenimento e un trattamento efficaci degli organoidi.
- Sono state osservate variazioni nell'espressione genica a seguito del trattamento.
- Le tecniche di normalizzazione hanno migliorato l'accuratezza dell'analisi delle proteine.
- Il protocollo può essere applicato a diversi studi che coinvolgono la biologia intestinale.
Conclusioni
- Il protocollo descritto è efficace per lo studio degli organoidi intestinali.
- I PAMP e Listeria monocytogenes influenzano in modo significativo l'espressione genica.
- Le tecniche corrette di normalizzazione sono fondamentali per ottenere risultati affidabili.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Gli organoidi intestinali murini ex vivo forniscono un sistema fisiologicamente rilevante per analizzare le interazioni tra ospite e patogeno e il segnale immunitario innato nei tessuti della mucosa. L'enfasi del protocollo sulla normalizzazione rispetto al numero totale di cellule affronta una sfida fondamentale nella generazione di dati quantitativi riproducibili da colture organoidi eterogenee. Questa capacità sostiene la fiducia predittiva nella scoperta precoce e nella validazione di bersagli per programmi terapeutici mirati all'immunologia e al microbioma.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi meccanicistica delle vie dei recettori di riconoscimento del pattern in contesti epiteliali primari.
- Supporta la riduzione del rischio biologico modellando interazioni complesse tra ospite e patogeno ex vivo.
- Facilita la validazione funzionale degli obiettivi per modulatori dell'immunità innata.
- Migliora la capacità predittiva per lo sviluppo di asset in immunologia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara sistemi di organoidi validati per lo screening successivo di composti immunomodulatori.
- Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio attraverso rigorose tecniche di normalizzazione.
- Consente la misurazione quantitativa di proteine secrete, supportando una valutazione affidabile dei composti.
- Permette la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma in diversi programmi di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla biologia della mucosa rilevante per la malattia, favorendo l'esplorazione di biomarcatori traslazionali.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica negli studi sulla funzione immunitaria e barriera.
- Riduce i rischi nelle decisioni di avanzamento modellando risposte epiteliali fisiologicamente rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso di scoperta, dall'iniziale verifica delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica, per programmi di immunologia mucosale e di interazione ospite-microbo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di segnalazione dell'immunità innata e dell'interazione ospite-patogeno.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per l'analisi di proteine secretorie in saggi con organoidi.
- Analisi: Permette la normalizzazione rispetto al numero totale di cellule, migliorando la comparabilità tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro alla biologia della mucosa in vivo per l'allineamento di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro basato su organoidi riutilizzabile per portafogli di ricerca e sviluppo in immunologia e nel microbioma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione delle target.
- Valore operativo: Standardizza la normalizzazione e la quantificazione nei sistemi complessi di organoidi.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di avanzamento o interruzione e un progresso del portafoglio efficiente in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio di asset in immunologia e nel microbioma.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di organoidi e nella biologia epiteliale.
- Necessita dell'accesso a strumentazione specializzata per la coltura tissutale e la quantificazione proteica.
- Esige una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di normalizzazione e di analisi.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi tipi di organoidi o modelli di malattia.
- L'eterogeneità nella crescita degli organoidi e nella composizione della matrice può influenzare la riproducibilità del saggio.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Mus musculus Small Intestinal Crypt Harvest
3:57
Organoid Plating for Pathogen Associated Molecular Patters (PAMP) and L. monocytogenes Challenge
6:58
Results: Representative Mouse Intestinal Organoid Culture and Stimulation
8:29
Conclusion
