Il Ex Vivo Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare gli effetti della provocazione patogena sugli organoidi dell'intestino tenue, con particolare attenzione alle tecniche di normalizzazione rispetto al numero totale di cellule. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia innata e della mucosa, fornendo un mezzo per studiare le interazioni dei batteri tra i patogeni dell'ospite e le cellule epiteliali intestinali in vitro. Essenziale per questa procedura è il metodo per la normalizzazione rispetto al numero totale di cellule, una necessità quando si misurano le proteine secrete dagli organoidi attraverso tecniche come ELISA.To raccogliere cripte intestinali tenue di topo per la coltura di organoidi, iniziare utilizzando un vetrino sterile per raschiare delicatamente i villi dalla superficie luminale dell'intestino tenue. Quindi, usa le forbici da dissezione per tagliare il tessuto in strisce di 1-2 centimetri di lunghezza. E metti le strisce in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di PBS ghiacciato. Mescolare il contenuto mediante una leggera inversione e lasciare che il contenuto del tessuto si depositi sul fondo della provetta. Quindi, aspirare il PBS e lavare le strisce altre tre volte in 10 millilitri di PBS fresco, ogni volta nello stesso modo. Al termine del lavaggio finale, posizionare il tubo sul ghiaccio per dieci minuti. Quindi, sostituire il PBS con 25 millilitri di PBS integrati con 2 millimolari di EDTA, in un secchiello del ghiaccio su una piattaforma a dondolo per 45 minuti. Al termine dell'incubazione, lasciare che le strisce di tessuto si depositino sul fondo della provetta e sostituire il PBS-EDTA con 10 millilitri di PBS integrato con il 10% di FBS. Agitare energicamente il tubo a mano dieci volte. Quindi, lasciare che il tessuto si depositi sul fondo della provetta e trasferire il surnatante in una provetta conica da 15 millilitri etichettata, Frazione 1.Agitare i tessuti in PBS FBS altre cinque volte. Trasferire ogni volta il surnatante in una nuova provetta frazionaria. Dopo l'ultima agitazione, centrifugare tutti i campioni e risospendere i pellet in cinque millilitri di DMEM/F12 preriscaldato senza l'aggiunta di fattori di crescita. A questo punto, centrifugare nuovamente i campioni e aspirare quattro millilitri di surnatante da ciascuna provetta. Risospendere i pellet nell'ultimo millilitro di terreno rimanente e utilizzare aliquote da 20 microlitri di ciascuna frazione per visualizzare le cripte e i detriti sui vetrini. Dopo aver raggruppato le frazioni appropriate per ottenere la massima percentuale di rapporto cripta/detriti, centrifugare le frazioni raggruppate e aspirare tutti tranne gli ultimi 50-100 microlitri dei surnatanti. Mantenendo le provette sul ghiaccio, aggiungere 1 millilitro di matrice proteica alle frazioni raggruppate, pipettando lentamente su e giù per evitare l'aggiunta di bolle d'aria. Quindi, aggiungere 50 microlitri di sospensione di matrice proteica/cripta al centro di ciascun pozzetto da 37