Generazione di Media e Applicazioni organo condizionata per lo studio Influenze organo-specifiche sul cancro al seno metastatico Comportamento

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un mezzo condizionato utilizzando linfonodi, ossa, polmoni e cervelli di topo per identificare e studiare i fattori solubili derivati dagli organi e i loro effetti sul comportamento metastatico delle cellule tumorali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della metastasi, come ad esempio: come influenzano i fattori specifici degli organi la crescita, la migrazione e l'espressione genica delle cellule tumorali? Questa tecnica fornisce una piattaforma semplice ex vivo rappresentativa dei fattori solubili specifici degli organi in vivo che influenzano il fenotipo e il comportamento delle cellule tumorali.

Per isolare i linfonodi, iniziare posizionando un topo di età compresa tra le sei e le dodici settimane su un supporto in polistirolo espanso all'interno di una cappa sterile per colture cellulari, fissando gli arti in posizione estesa. Successivamente, utilizzare pinzette e forbici per praticare un'incisione mediana sulla cute addominale, partendo dai genitali fino alla bocca. Quindi, staccare delicatamente la pelle dai muscoli addominali e fissarla al supporto per dissezione.

Utilizzando le forbici, rimuovere con attenzione i linfonodi dalla pelle, dal tessuto adiposo e dai vasi, ponendo i linfonodi in 30 millilitri di PBS ghiacciato man mano che vengono prelevati. Quando tutti i linfonodi sono stati raccolti, utilizzare pinzette e forbici per tagliare con cura la parete addominale esposta con un movimento ascendente attraverso lo sterno, esponendo la cavità toracica. Tagliare il diaframma.

Sollevare i polmoni dal basso e tagliare il tessuto sottostante in direzione della trachea. Successivamente, trasferire i polmoni in un nuovo contenitore con PBS freddo su ghiaccio. Il cuore può essere rimosso dai polmoni in questo passaggio o prima della pesatura dell'organo.

Per prelevare le ossa delle zampe posteriori, posizionare il topo in posizione prona e tagliare la pelle lungo la parte bassa della schiena da un fianco all'altro. Successivamente, utilizzare un pezzo sterile di garza per afferrare il tronco e la pelle sulle zampe e sui piedi. Utilizzando lo stesso pezzo di garza, tenere la zampa inferiore mentre si rompe con attenzione l'articolazione della caviglia di una delle zampe, quindi staccare la pelle oltre l'articolazione in direzione prossimale verso il ginocchio.

Quindi, utilizzando delle forbici, rimuovere la tibia dall'articolazione del ginocchio e posizionare l'osso della gamba in PBS ghiacciato. Dopo aver prelevato la seconda tibia, tenere il femore fermo con una pinza e usare le forbici per asportare il tessuto muscolare circostante. Successivamente, posizionare l'osso della gamba in PBS ghiacciato.

Per prelevare il cervello, utilizzare un nuovo pezzo di garza sterile per afferrare la testa ed esporre delicatamente il cranio rimuovendo la pelle con forbici e pinzette. Successivamente, utilizzare le forbici per tagliare con attenzione l'osso occipitale partendo dal centro superiore del cranio lungo una linea dritta e verso il basso, in modo da esporre la parte posteriore del cervello. Quindi, inserendo lo strumento sotto il tessuto in direzione della parte anteriore del cranio, trasferire l'intero cervello in PBS ghiacciato.

Per generare il mezzo condizionato del polmone, capovolgere le provette contenenti il tessuto polmonare tre volte per rimuovere qualsiasi residuo di sangue dagli organi. Successivamente, sostituire la soluzione di lavaggio con PBS freddo fresco e ripetere l'operazione fino a quando la soluzione salina risulti priva di sangue. Poi, trasferire i polmoni in una piastra di Petri di vetro da 60 millimetri quadrati per topo e utilizzare due lame di bisturi sterili per tritare i tessuti mediante ripetuti tagli avanti e indietro.

Quando i frammenti di tessuto hanno dimensioni di circa un millimetro cubo, risospendere i pezzi nel volume appropriato di mezzo DMEM:F12 integrato con antibiotici e incubare i tessuti in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti per topo a 37 gradi Celsius e cinque percento di CO2. Dopo 24 ore, trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto in provette coniche individuali da 50 millilitri e diluire il mezzo condizionato con tre volumi equivalenti di mezzo DMEM:F12 fresco per ogni provetta. Centrifugare le provette per rimuovere eventuali frammenti di tessuto di grandi dimensioni.

Quindi, raccogliere i mezzi condizionati attraverso un filtro per siringa da 0,22 micron in un singolo tubo conico da 50 millilitri. Per generare il mezzo condizionato del midollo osseo, trasferire le ossa sotto una cappa a flusso laminare sterile e rimuovere i tessuti in eccesso dall'osso. Utilizzare le forbici per rimuovere le epifisi.

Quindi, utilizzare un ago da 27 e mezzo per lavare un millilitro di PBS attraverso la cavità midollare di ciascun osso in un tubo contenente PBS fresco. Una volta raccolte tutte le cellule stromali del midollo osseo, lavare le cellule tre volte in PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 20 millilitri di mezzo di crescita per cellule stromali ossee integrato con il 10% di siero fetale bovino e seminare 10 millilitri di cellule per fiala T75.

Quando le cellule hanno raggiunto una confluenza di circa il 70%, lavare le colture due volte con tre millilitri di PBS. Successivamente, staccare le cellule utilizzando tre millilitri di soluzione di tripsina/EDTA 0,025%, avendo cura che la tripsina ricopra l'intera superficie della fiasca. Dopo due o tre minuti, arrestare la reazione enzimatica aggiungendo tre millilitri di mezzo di crescita per cellule stromali ossee e raccogliere le cellule in un tubo da 50 millilitri.

Centrifugare le cellule. Successivamente, risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo fresco. A questo punto, suddividere le colture in rapporto uno a cinque in tre nuove fiasche T75 fino al raggiungimento di una confluenza del 70%.

Quindi, lavare le cellule tre volte con PBS come appena dimostrato e coltivare con mezzo di raccolta per cellule stromali ossee senza siero, integrato con mitogeno e antibiotici, per 72 ore. Dopo il terzo giorno di coltura, raccogliere i mezzi attraverso un filtro da 0,22 micron. Le cellule stromali dovrebbero risultare aderenti in coltura con una morfologia allungata e fibroblastica osservata nelle colture di cellule stromali del linfonodo, e una morfologia più piccola e arrotondata presente nelle colture di cellule stromali del midollo osseo.

L'analisi mediante citometria a flusso conferma che le cellule stromali del linfonodo sono prevalentemente negative per CD45 e positive per gp38. Le cellule stromali del midollo osseo devono risultare positive per CD-44 e CD-29, debolmente positive per CD-105 e Sca-1, e negative per CD-73. Le cellule del cancro al seno umano con diversi background genetici mostrano schemi differenziali di migrazione e crescita verso condizioni specifiche di organo.

Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, la variante 231-BoM con tropismo osseo migra preferenzialmente verso il mezzo condizionato del midollo osseo rispetto ai mezzi condizionati cerebrale e polmonare. Analogamente, la variante 231-LM2 con tropismo polmonare migra preferenzialmente verso il mezzo condizionato polmonare rispetto ai mezzi condizionati del midollo osseo e cerebrale. Inoltre, l'analisi mediante RT qPCR dimostra che l'esposizione delle cellule tumorali della mammella MDA-MB-231 parentali a mezzo condizionato osseo o polmonare induce un'up-regolazione dei geni associati alle metastasi specifiche del tumore della mammella a livello osseo o polmonare in vivo.

Una volta acquisita padronanza, le operazioni di raccolta del tessuto e di preparazione del mezzo condizionato possono essere completate in due o tre ore, se eseguite correttamente. Le fasi di subcoltura nei giorni successivi richiedono da 15 a 30 minuti al giorno. Durante l'esecuzione di queste procedure, è fondamentale ricordare di mantenere tutto sterile.

Dopo la generazione del mezzo condizionato, altri metodi come array proteici, saggi di crescita e migrazione cellulare, formazione di tumorsfere e RT-PCR possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardo l'effetto dei fattori specifici degli organi sul comportamento delle cellule tumorali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio del cancro al seno per esplorare il comportamento metastatico specifico degli organi in un sistema modello ex vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare mezzi condizionati utilizzando le ossa, i polmoni e il cervello dei topi.

Non dimenticare che lavorare con strumenti di dissezione taglienti può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come l'uso di una tecnica di dissezione precisa e accurata, durante l'esecuzione di questa procedura.