Name: Generazione di Media e Applicazioni organo condizionata per lo studio Influenze organo-specifiche sul cancro al seno metastatico Comportamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri come generare media condizionati da organi murini per studiare i fattori solubili specifici d'organo e il loro impatto sul comportamento metastatico delle cellule tumorali al seno.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, dalla Canada Foundation for Innovation (n. 13199) e dal sostegno di donatori da John e Donna Bristol attraverso la London Health Sciences Foundation (ad A.L.A.). Il sostegno alle borse di studio e alle borse di studio è stato fornito dal programma di borse di studio per laureati dell'Ontario (Provincia dell'Ontario, a GMP e J.E.C.), dal programma di master con borsa di studio per laureati del Canada (a M.M.P.), dal programma di formazione strategica del Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (a M.M.P., G.M.P e J.E.C.) e dall'unità di ricerca traslazionale sul cancro al seno Pamela Greenaway-Kohlmeier presso il London Regional Cancer Program (a M.M.P., G.M.P., J.E.C. e Y.X.). A.L.A. è supportato da un CIHR New Investigator Award e da un Early Researcher Award dal Ministero della Ricerca e dell'Innovazione dell'Ontario.

Tutti gli studi su animali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni del Consiglio canadese sulla cura degli animali, sotto protocolli approvati dalla Western University Animal Usa sottocommissione. 1. Isolamento Organo (polmone, cervello, ossa, Linfonodo) <ol><li> Preparare quattro sterili 50 ml provette coniche (una per ciascun organo di essere isolato) contenente circa 30 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Pre-pesare ogni tubo di PBS usando una bilancia elettronica. </li><li> Euthanize 6-12 settimane vecchio topo da CO 2 inalazione. I topi devono essere lasciati nella camera di CO 2 per circa 1 - 2 minuti o fino a quando il mouse smette di muoversi e la respirazione. l&#39;eutanasia di successo può essere ulteriormente confermata da una mancanza di battito cardiaco, quando controllato manualmente con un dito. Evitare dislocazione cervicale come questo metodo può rompere vasi sanguigni del collo che porta a difficoltà di rimozione di linfonodi ascellari. Nota: Il lavoro precedente ha utilizzate in modo specificosani topi nudi femminili, Hsd: atimici Nude- Foxn1 nu 13. </li><li> In una cappa coltura di tessuti sterili, posizionare il mouse sul dorso su un blocco di polistirolo espanso, diffondere le arti e utilizzare perni per mantenere al loro posto. </li><li> Utilizzando pinze sterili e forbici, tagliare la pelle addominale sulla linea mediana ai genitali e tagliare verso l&#39;alto verso la bocca. Delicatamente tirare indietro la cute addominale dai muscoli addominali e perno in posizione sul blocco di polistirolo espanso. </li><li> Individuare il ascellare, brachiale, e linfonodi inguinali. Nota: I linfonodi sono di solito circondate da tessuto adiposo. I linfonodi inguinali sono le più facili da individuare come si trovano superficialmente all&#39;incrocio di due vasi sanguigni sulla pelle addominale posteriore tirato. linfonodi ascellari e linfatici brachiale si trovano più in profondità all&#39;interno del tessuto e richiedono delicata manovra di tessuto. <ol><li> Dopo aver individuato i linfonodi, usare le forbici per tagliare delicatamente e con attenzione la linfa nodes dalla pelle, grasso e vasi e rimuoverli dal mouse. Per confermare la corretta dissezione, rotolare la pinza sopra il tessuto rimosso. Se un nodulo duro esiste quando rotolare la pinza sopra il tessuto, poi un linfonodo è probabilmente stato rimosso con successo. </li><li> Posizionare linfonodi rimossi in ghiaccio PBS freddo. </li></ol></li><li> Utilizzando le pinze e forbici, aprire la cavità addominale tagliando attraverso la parete addominale esposta in un movimento ascendente verso il petto. tagliare con cura attraverso lo sterno, esponendo la cavità toracica. </li><li> Individuare il diaframma sotto i polmoni e tagliare il diaframma. Dovrebbe tirare verso le costole a causa della tensione. </li><li> Sollevare i polmoni da sotto e tagliare il tessuto sottostante verso la trachea. Questo permette ai polmoni di rimuovere liberamente dalla cavità toracica. Rimuovere il cuore e polmoni in blocco e mettere in ghiaccio PBS freddo. Il cuore può essere rimossa dai polmoni qui o appena prima di pesare nella Fase 2. </li><li> Rimuovi ilperni, mantenendo il mouse in posizione sul pad polistirolo espanso. Capovolgere il mouse e tagliare la pelle della parte bassa della schiena tutta la strada di fronte a fianco a fianco. </li><li> Utilizzando un pezzo di garza sterile, per tenere il busto del mouse, sbucciare la pelle posteriore del mouse sopra le gambe ei piedi del mouse. </li><li> Utilizzando lo stesso pezzo di garza sterile, tenere la gamba in atto, con attenzione rompere l&#39;articolazione della caviglia del piede mouse e sbucciare la pelle sopra il giunto prossimale verso l&#39;articolazione del ginocchio. </li><li> Utilizzando le forbici, rimuovere la tibia libero dal ginocchio e mettere in ghiaccio PBS freddo. </li><li> Ripetere i passaggi 1.11) a 1.12) con arto opposto. </li><li> Utilizzando pinze, tenere il femore in luogo, tagliare circostante tessuto muscolare utilizzando le forbici e rimuovere il femore, ponendolo in ghiaccio PBS freddo. </li><li> Ripetere il passaggio 1.14) con arto opposto. </li><li> Utilizzando un nuovo pezzo di garza sterile, tenere la testa del mouse sul posto. Utilizzando pinze e forbici, rimuovere delicatamente la pelle per esporre le sKull. Utilizzando le forbici, tagliare con attenzione il cranio occipitale dal centro superiore in linea retta e verso il basso per esporre il cervello posteriore. </li><li> Utilizzando pinze, scoop sotto il cervello verso l&#39;anteriore e rimuovere l&#39;intero cervello. Mettere il cervello in ghiaccio PBS freddo. </li><li> Ripetere passaggi 1.1) a 1.17) per almeno quattro topi. </li></ol> 2. Organo di pesatura <ol><li> Dopo aver isolato organo, pesare ogni tubo PBS contenente polmone e tessuto cerebrale con una bilancia elettronica. </li><li> Calcolare la differenza di peso sottraendo il peso pre-isolamento (solo PBS) dal peso del tubo PBS + organi (polmone e cervello). </li><li> Determinare la quantità di supporti necessari per risospendere frammenti di tessuto dalla differenza di peso calcolato. Nota: Lung e tessuto cerebrale sono il peso normalizzato da risospensione in un 4: 1 Media: rapporto di tessuto (vol / peso). </li></ol> 3. generazione di supporti Lung- e Braintree condizionata <ol><li> In una t sterileproblema cappuccio cultura, invertire i tubi PBS contenente polmoni o il cervello tre volte per rimuovere residui di sangue da organi e aspirare PBS contenenti sangue. Ripetere con fresca PBS freddo fino a soluzione appare chiara senza evidenza di sangue. </li><li> Posizionare i polmoni e il cervello in separati 60 millimetri 2 piatti in vetro di Petri. Utilizzando due lame bisturi sterile, polmoni tritare o cervelli ripetutamente affettare avanti e indietro fino a quando frammenti di tessuto sono circa ~ 1 mm 3 dimensioni. </li><li> frammenti di tessuto Risospendere in volume appropriato (determinati in precedenza al passo 2.3) del Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM): mezzi F12 addizionato con 1x concentrato integratore mitogeno e la penicillina (50 ug / ml) / streptomicina (50 mg / ml). </li><li> Aggiungere frammenti di polmone o di tessuto cerebrale risospesa per un pozzetto di un 6-pozzetti. </li><li> Incubare frammenti di tessuto in mezzi per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo l&#39;incubazione, raccogliere condizionata multimediale per ogni tessuto e fn ulteriore diluito aggiungendo tre volumi equivalenti di mezzi freschi in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Centrifugare a 1000 xg in mezzi condizionati diluito per ciascun organo a 4 ° C per 15 minuti per rimuovere grandi frammenti di tessuto. Raccogliere il surnatante media e filtrare attraverso un filtro siringa da 0,22 micron. </li><li> Pool di supporti condizionato da ciascun organo (es., Del polmone con polmone e al cervello con il cervello) da più topi per tenere conto della variabilità del mouse-to-mouse. Aliquotare e conservare mezzi condizionati a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 4. generazione di supporti midollo osseo condizionata <ol><li> In una cappa coltura di tessuti sterili, tagliare il tessuto in eccesso dal tessuto osseo e rimuovere epifisi (terminali) dalle ossa con le forbici. </li><li> Utilizzando un 27 ½ ago G, filo cavità midollare delle ossa spingendo 1 ml di PBS attraverso il centro di ogni osso. Questo vi permetterà di raccogliere le cellule del midollo osseo stromali (BMSC) in una nuova provetta contenente PBS. </li><li> Centrifugare a 1,000 xg per 5 minuti a 4 ° C e lavare BMSC due volte con PBS. Risospendere le cellule stromali del midollo osseo in 20 ml di mezzi di crescita delle cellule stromali del midollo (DMEM: mezzi F12 addizionato con 1x concentrati mitogeno supplemento, penicillina (50 ug / ml) / streptomicina (50 mg / ml) e 10% di siero boven fetale (FBS) ). </li><li> Piastra 10 ml di cellule stromali del midollo osseo risospeso in un pallone T75. Nota: Unire e le cellule piastra da ogni 2 topi in ogni contenitore T75; per quattro topi, due palloni T75 sono necessari (circa 1 x 10 7 cellule / fiasco). </li><li> Incubare ossei cellule stromali del midollo osseo in stromale mezzi di crescita delle cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo l&#39;incubazione, rimuovere il supporto da entrambi i palloni T75 e mettere in pallone nuovo T75, etichettare questo fiasco come &quot;Floater Flask&quot;. Aggiungere fresca stromali del midollo terreni di coltura cellulare per precedenti 2 palloni e incubare tutte e 3 palloni a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Dopo cellule raggiungono circa il 70% di confluenza (circa 5 - 7giorni), le cellule di passaggio. Per fare questo, rimuovere medie e lavare le cellule due volte con PBS (3 ml ogni lavaggio). Rimuovere PBS e aggiungere 3 ml di soluzione di tripsina / EDTA, assicurando che la tripsina copre l&#39;intera superficie del pallone. Dopo che le cellule si sollevano il pallone (~ 2 - 3 min), fermata tripsinizzazione reazione aggiungendo 3 ml di osso stromali terreni di coltura delle cellule). Centrifugare 900 xg per 5 minuti a 4 ° C, scartare media e risospendere le cellule in 10 ml di mezzi di crescita delle cellule stromali del midollo fresco. </li><li> Cellule piscina da tutti i palloni e il passaggio 1: 5 in tre nuovi palloni T75 e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2. Dopo che le cellule ancora una volta raggiungono il 70%, ripetere il punto 4.6 e piscina e di passaggio tutte le cellule aderenti una seconda volta. Re-plate tutte le cellule a quattro fiaschi T75 e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2. mezzi Bone crescita delle cellule stromali dovrebbero essere utilizzati per tutte le fasi. </li><li> mezzi F12 + 1x mitogeno concentrato su: consentono alle cellule di raggiungere confluenza, lavare le cellule tre volte con PBS e aggiungere osso stromali collezione media delle cellule (DMEMpplement + penicillina (50 ug / ml) / streptomicina (50 mg / ml); 10 ml / T75), facendo in modo che questo supporto è privo di FBS. Raccogliere media-midollo condizionata osso 72 ore più tardi, filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron, piscina, aliquota e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Se lo si desidera, di confermare il fenotipo delle cellule stromali del midollo osseo isolate (BMSC) utilizzando anticorpi contro il mouse Sca-1, CD105, CD29, CD73 e, CD44, utilizzando citometria di flusso standard tecniche come descritto in precedenza 13. </li></ol> 5. generazione di supporti linfonodo condizionata <ol><li> In una cappa coltura di tessuti sterili, invertire tubo PBS contenente linfonodi tre volte per rimuovere il sangue residuo linfonodi e aspirare sanguinosa PBS. Ripetere con fresca PBS freddo fino a soluzione appare chiara senza evidenza di sangue. </li><li> Mettere linfonodi in capsule di Petri 60 millimetri 2 di vetro. Utilizzando due lame bisturi sterile, i nodi linfatici tritare ripetutamente affettare avanti e indietro fino Tissue frammenti sono circa 1 mm 3 dimensioni. </li><li> In una provetta conica, frammenti di tessuto risospendere in 10 ml di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) mezzi addizionato con penicillina (50 ug / ml) / streptomicina (50 mg / ml), 5 x 10 -5 M sterile β-mercaptoetanolo ( 1.75 ml / 500 ml media) e il 10% FBS. </li><li> Centrifugare a 900 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere tutte le cellule in 30 ml media. Aggiungere 5 ml media / bene in un 6-pozzetti e incubare per 7 giorni a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Dopo l&#39;incubazione di 7 giorni, scartare i media, lavare cellule aderenti con 5 ml di caldo PBS e aggiungere 5 ml di mezzi freschi in ogni pozzetto. Consentono alle cellule di crescere fino a confluenza (circa 5 - 7 giorni), trypsinize, piscina per tutte le cellule, e il passaggio come descritto al punto 4.6. cellule Re-plate a 6-pozzetti. Ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Dopo tre passaggi, consentono alle cellule di crescere fino a confluenza, lavare i pozzetti tre volte con PBS e aggiungere 2 ml / pozzetto di DMEM: F12 + 1xsupplemento concentrato mitogeno e la penicillina (50 mg / ml) / streptomicina (50 mg / ml), assicurando che questo supporto è privo di FBS. Raccogliere media-nodi linfatici condizionata dopo 72 ore, piscina, aliquota e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Se lo si desidera, di confermare il fenotipo delle cellule stromali del linfonodo isolate (LNSC) utilizzando anticorpi contro CD45 mouse e gp38, utilizzando citometria di flusso standard tecniche come descritto in precedenza 13. </li></ol> 6. L&#39;utilizzo di supporti Organo condizionata per saggi a valle del comportamento metastatico delle cellule tumorali <ol><li> Una volta che i mezzi di organo-condizionata è stato generato come descritto nei passi 1 - 5, usarlo per effettuare diverse cellule valle e test di biologia molecolare per determinare l&#39;influenza dei fattori organo-derivati ​​solubili sul comportamento metastatico delle cellule tumorali. Esempi di test standard (già descritto in letteratura) comprendono saggi proteici 13, saggi di crescita cellulari &lt;sup&gt; 13, migrazione cellulare Saggi 13, tumorsphere formazione 14, e RT-PCR 15. I mezzi di comunicazione di base originali utilizzati per generare il supporto organo condizionata (per esempio, incondizionata DMEM:. Multimediale F12 integrato con 1x concentrato supplemento mitogeno e la penicillina (50 mg / ml) / streptomicina (50 mg / ml) dovrebbe essere utilizzato come controllo negativo . </li></ol>

<ol><li>Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organ+microenvironment+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The organ microenvironment and cancer metastasis.</a> Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).</li>
<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li>
<li>Kennecke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+behavior+of+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Metastatic behavior of breast cancer subtypes.</a> J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+Diseases%3A+A+Treatise+on+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors.</a> Am J Med Sci. 176 (2), 278(1928).</li>
<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast.+1889%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889.</a> Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+hematogenous+metastatic+patterns+in+humans+as+revealed+by+autopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy.</a> Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Chu, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-Derived+Factors+Mediate+Breast+Cancer+Cell+Migration+through+CD44+Receptor-Ligand+Interactions+in+a+Novel+Ex+Vivo+System+for+Analysis+of+Organ-Specific+Soluble+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins.</a> Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).</li>
<li>Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).</li>
<li>Deepak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+PCR%3A+Revolutionizing+Detection+and+Expression+Analysis+of+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes.</a> Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).</li>
<li>Hammerschmidt, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+mesenteric+lymph+node+cells+are+essential+for+the+generation+of+gut-homing+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo.</a> J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Baddoo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+murine+bone+marrow+by+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection.</a> J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).</li>
<li>Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFurger%2C+KA+%22Curr+Mol+Med%22">Curr Mol Med</a>. 1 (5), 621-632 (2001).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+as+breast+cancer+drivers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+induction+of+breast+cancer%3A+inflammation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Endocr+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion.</a> Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).</li>
<li>Kakinuma, T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines%2C+chemokine+receptors%2C+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis.</a> J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).</li>
<li>Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemokines and cancer.</a> Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).</li>
<li>Schlesinger, M., Bendas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cell+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29--an+increasing+insight+into+its+role+in+tumorigenicity+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis.</a> Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).</li>
<li>Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+endocrine+resistance+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.</a> Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).</li>
<li>Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+%28IR%29+and+insulin-like+growth+factor+receptor+1+%28IGF-1R%29+signaling+systems%3A+novel+treatment+strategies+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer.</a> Med Oncol. 31 (1), 805(2014).</li>
<li>Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+vascular+endothelial+growth+factor+pathway+in+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis.</a> Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).</li>
<li>Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+functional+TSLP+receptors+mitigates+Th2+polarization+and+the+establishment+and+growth+of+4T1+primary+breast+tumours+but+has+different+effects+on+tumour+quantities+in+the+lung+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain.</a> Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).</li>
<li>Chambers, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+tumor+metastasis%3A+new+concepts+from+intravital+videomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy.</a> Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).</li>
<li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).</li>
<li>Gupta, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+site-specific+metastasis+genes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying site-specific metastasis genes and functions.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li>
<li>Psaila, B., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metastatic+niche%3A+adapting+the+foreign+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The metastatic niche: adapting the foreign soil.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).</li>
<li>Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+factors+secreted+by+mesenchymal+stromal+cells+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair.</a> J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Metastasi è un processo complesso attraverso il quale una serie di eventi cellulari sono in ultima analisi responsabile per l&#39;invasione dei tessuti e tumorale lontana istituzione 4,30,31. Il sistema ex vivo modello qui presentato può essere utilizzato per studiare due aspetti importanti della progressione metastatica: homing delle cellule del cancro o la migrazione ad un organo specifico ( &quot;arrivare&quot;) e la crescita in tale organo ( &quot;crescere lì&quot;). Molti studi hanno precedentem...

Il carcinoma della mammella è il tumore più frequentemente diagnosticato nelle donne e la seconda causa di decessi correlati al cancro 1. alto tasso di mortalità di cancro al seno è dovuto principalmente al fallimento della terapia convenzionale per mitigare ed eliminare la malattia metastatica; circa il 90% dei decessi correlati al cancro sono dovute a metastasi 2. La comprensione dei meccanismi molecolari alla base della cascata metastatica è di primaria importanza per lo sviluppo di terapie efficaci sia precoce e il cancro al seno in fase avanzata. Precedenti ricerche hanno contribuito a chiarire la natura più fasi di metastasi del cancro al seno e si ipotizza che il risultato sia della progressione del cancro e metastasi dipende in gran parte le interazioni tra cellule tumorali e l&#39;ambiente host 3. Osservazioni cliniche indicano che molti tumori mostrano tropismo d&#39;organo, vale a dire., La tendenza a metastatizzare preferenzialmente a specifici organs.In case di cancro al seno, la malattia di un paziente si diffonde in genere o metastatizza a 5 siti principali, tra cui l&#39;osso, polmoni, linfonodi, fegato e cervello 4-6. Molte teorie sono state sviluppate per spiegare questo processo, ma solo pochi hanno resistito alla prova del tempo. La teoria di Ewing di metastasi, proposto nel 1920, ipotizza thatthe la distribuzione delle metastasi era strettamente dovuta a fattori meccanici; quale le cellule tumorali sono effettuate in tutto il corpo dai normali modelli di flusso di sangue fisiologica definiti e semplicemente arrestano nel primo letto capillare che incontrano 7. Al contrario, &quot;seme e suolo&quot; ipotesi di Stephen Paget 1889 ha suggerito che le interazioni molecolari supplementari erano responsabili per la sopravvivenza e la crescita delle metastasi, in cui le cellule tumorali ( &quot;semi&quot;) in grado di stabilire solo se stessi e microambienti organo proliferatein che producono fattori molecolari appropriati ( &quot;terreno &quot;) 8. Quasi un secolo dopo, Leonard Weiss sottoha preso una meta-analisi dei dati autoptici pubblicati in precedenza e ha confermato la previsione di Ewing che molti tumori metastatici rilevati al momento della autopsia sono stati trovati nelle proporzioni previste che ci si aspetterebbe se tropismo d&#39;organo metastatico è stata determinata da modelli di flusso di sangue da solo. Tuttavia, in manyinstances c&#39;erano meno o più di metastasi formate in certi siti, allora ci si aspetterebbe da fattori meccanici proposte di Ewing 9. Questi conti e teorie suggeriscono che specifici microambienti organo giocano un ruolo critico nei modelli di diffusione e la successiva crescita e la sopravvivenza di molti tumori, tra cui il cancro al seno. Gli sforzi di ricerca in passato si sono concentrate principalmente su fattori derivati ​​delle cellule tumorali e il loro contributo al tropismo d&#39;organo osservata in metastasi del cancro al seno 10-12, fattori per quanto poco la ricerca ha esplorato derivati ​​dal microambiente organo che possono fornire una nicchia favorevole per l&#39;istituzionedelle metastasi del cancro al seno. Questo è in gran parte attribuibile alle sfide tecniche di studiare componenti del microambiente organo in vitro. L&#39;attuale articolo descrive una vasta ex vivo sistema modello per studiare l&#39;influenza delle componenti solubili del linfonodo, ossa, polmoni e cervello sul comportamento metastatico delle cellule di cancro al seno umano. Precedenti studi hanno convalidato questo sistema modello dimostrando che le diverse linee di cellule del cancro al seno mostrare un comportamento maligno specifico organo-specifica linea cellulare e in risposta a media-organo condizionata che corrisponde alla loro in vivo metastatico potenziale 13. Questo sistema modello può essere utilizzato per identificare e valutare i fattori solubili specifici organi di derivazione che possono giocare un ruolo nel comportamento metastatico della mammella e altri tipi di cellule tumorali, comprese le influenze sulla crescita, la migrazione, staminali come il comportamento e l&#39;espressione genica, nonché l&#39;identificazione dinuovi potenziali bersagli terapeutici per il cancro. Questo è il primo sistema vivo ex modello che può essere usato per studiare il comportamento metastatico organo-specifiche in dettaglio e valutare il ruolo di fattori solubili organo-derivato nel guidare il processo di metastasi del cancro.

<table><tbody><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>339652</td><td>Mantenere sterile</td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Conservare topi</td></tr><tr><td>nudi</td> sterili <td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td><td>Utilizzare a 6 - 12 settimane di età</td></tr><tr><td>Cuscinetto in polistirene espanso</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>A questo scopo è possibile utilizzare il coperchio scartato (~ 4 x 8 pollici o più grande) di un contenitore di spedizione in polistirene espanso. Sterilizzare strofinando con etanolo.</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Mantenere le</td></tr><tr><td>forbici</td> sterili <td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Mantenere le</td></tr><tr><td>garze</td> sterili <td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td>Mantenere sterili</td></tr><tr><td>60 mm2 piastre di Petri in vetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7016560</td><td>Mantenere sterili</td></tr><tr><td>Lame per bisturi</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95937A</td><td>Mantenere sterile</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso, mantenere sterile&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Mito + Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td>indicato come "integratore di mitogeno concentrato" nel manoscritto. Mantenere sterile</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Mantenere sterile</td></tr><tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso, mantenere sterile&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>Conservare la</td></tr><tr><td>soluzione sterile di tripsina/EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso, mantenere sterile&nbsp;</td></tr><tr><td>piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td>Mantenere sterile</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtri per siringhe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359904</td><td>Conservare</td></tr><tr><td>fiasche sterili per colture tissutali T75</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td>Mantenere sterili</td></tr><tr><td>Transwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3464</td><td>Mantenere sterile, utilizzare per saggi di migrazione</td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca-1</td><td>R& D Sistemi</td><td>FAB1226P</td><td>l'uso a 10 &micro; l/106 cellule</td></tr><tr><td>Anti-topo CD105</td><td>R& Sistemi D</td><td>FAB1320P</td><td>l'uso a 10 & micro; l/106 cellule</td></tr><tr><td>Anti-topo CD29</td><td>R& D Systems</td><td>FAB2405P-025</td><td>utilizzo a 10 &micro; l/106 cellule</td></tr><tr><td>Anti-topo CD73</td><td>R& Sistemi D</td><td>FAB4488P</td><td>l'uso a 10 & micro; l/106 cellule</td></tr><tr><td>Anti-topo CD44</td><td>R& I sistemi D</td><td>MAB6127-SP</td><td>utilizzano a 0,25 & micro; g/106 cellule</td></tr><tr><td>Anti-topo CD45</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>uso a 5 &micro; l/106 cellule</td></tr><tr><td>Anti-topo gp38</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>uso a 10 &micro; cellule l/106 beta</td></tr><tr><td>;-mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp;</td><td>Mantieni sterile</td></tr><tr><td>Array di proteine</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>Utilizzare 1 array per condizione del supporto (incluso il controllo negativo), in triplice copia</td></tr></tbody></table>

generazione di media e applicazioni organo condizionata per lo studio influenze organo-specifiche sul cancro al seno metastatico comportamento

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

Il cancro al seno metastatizza preferenzialmente al linfonodo, alle ossa, ai polmoni, al cervello e al fegato nei pazienti con cancro al seno. Precedenti sforzi di ricerca si sono concentrati sull'identificazione dei fattori inerenti alle cellule del cancro al seno che sono responsabili di questo modello metastatico osservato (chiamato tropismo d'organo), tuttavia si sa molto meno sui fattori presenti all'interno di organi specifici che contribuiscono a questo processo. Ciò è in parte dovuto alla mancanza di sistemi modello in vitro che ricapitolino accuratamente il microambiente dell'organo. Per affrontare questo problema, è stato stabilito un sistema modello ex vivo che consente lo studio di fattori solubili presenti all'interno di diversi microambienti d'organo. Questo modello consiste nella generazione di terreni condizionati da organi (linfonodi, ossa, polmoni e cervello) isolati da normali topi nudi atimici. Il sistema modello è stato convalidato dimostrando che diverse linee cellulari di carcinoma mammario mostrano un comportamento maligno specifico della linea cellulare e dell'organo in risposta a terreni condizionati dall'organo che corrisponde al loro potenziale metastatico in vivo. Questo sistema modello può essere utilizzato per identificare e valutare specifici fattori solubili derivati da organi che possono svolgere un ruolo nel comportamento metastatico della mammella e di altri tipi di cellule tumorali, comprese le influenze sulla crescita, la migrazione, il comportamento staminale e l'espressione genica, nonché l'identificazione di potenziali nuovi bersagli terapeutici per il cancro. Questo è il primo sistema modello ex vivo che può essere utilizzato per studiare in dettaglio il comportamento metastatico organo-specifico e valutare il ruolo di specifici fattori solubili derivati da organi nel guidare il processo di metastasi del cancro.

Generazione di Media-Organ condizionata Una panoramica Schema / schematica del processo di isolamento organo e generazione di mezzi condizionati è presentato nella figura 1, con immagini rappresentative fotografiche della procedura illustrata in figura 2. Si deve notare che quando questo protocollo era prima fase di sviluppo, il fegato è stato incluso nella nostra analisi perc...

Questo manoscritto descrive un sistema modello ex vivo composto da terreni condizionati da organi derivati dal linfonodo, dalle ossa, dai polmoni e dal cervello dei topi. Questo sistema modello può essere utilizzato per identificare e studiare fattori solubili derivati da organi e i loro effetti sul tropismo degli organi e sul comportamento metastatico delle cellule tumorali.

Generazione di Media e Applicazioni organo condizionata per lo studio Influenze organo-specifiche sul cancro al seno metastatico Comportamento

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un mezzo condizionato utilizzando linfonodi, ossa, polmoni e cervelli di topo per identificare e studiare i fattori solubili derivati dagli organi e i loro effetti sul comportamento metastatico delle cellule tumorali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della metastasi, come ad esempio: come influenzano i fattori specifici degli organi la crescita, la migrazione e l'espressione genica delle cellule tumorali? Questa tecnica fornisce una piattaforma semplice ex vivo rappresentativa dei fattori solubili specifici degli organi in vivo che influenzano il fenotipo e il comportamento delle cellule tumorali.Per isolare i linfonodi, iniziare posizionando un topo di et&agrave; compresa tra le sei e le dodici settimane su un supporto in polistirolo espanso all'interno di una cappa sterile per colture cellulari, fissando gli arti in posizione estesa. Successivamente, utilizzare pinzette e forbici per praticare un'incisione mediana sulla cute addominale, partendo dai genitali fino alla bocca. Quindi, staccare delicatamente la pelle dai muscoli addominali e fissarla al supporto per dissezione.Utilizzando le forbici, rimuovere con attenzione i linfonodi dalla pelle, dal tessuto adiposo e dai vasi, ponendo i linfonodi in 30 millilitri di PBS ghiacciato man mano che vengono prelevati. Quando tutti i linfonodi sono stati raccolti, utilizzare pinzette e forbici per tagliare con cura la parete addominale esposta con un movimento ascendente attraverso lo sterno, esponendo la cavità toracica. Tagliare il diaframma.Sollevare i polmoni dal basso e tagliare il tessuto sottostante in direzione della trachea. Successivamente, trasferire i polmoni in un nuovo contenitore con PBS freddo su ghiaccio. Il cuore può essere rimosso dai polmoni in questo passaggio o prima della pesatura dell'organo.Per prelevare le ossa delle zampe posteriori, posizionare il topo in posizione prona e tagliare la pelle lungo la parte bassa della schiena da un fianco all'altro. Successivamente, utilizzare un pezzo sterile di garza per afferrare il tronco e la pelle sulle zampe e sui piedi. Utilizzando lo stesso pezzo di garza, tenere la zampa inferiore mentre si rompe con attenzione l'articolazione della caviglia di una delle zampe, quindi staccare la pelle oltre l'articolazione in direzione prossimale verso il ginocchio.Quindi, utilizzando delle forbici, rimuovere la tibia dall'articolazione del ginocchio e posizionare l'osso della gamba in PBS ghiacciato. Dopo aver prelevato la seconda tibia, tenere il femore fermo con una pinza e usare le forbici per asportare il tessuto muscolare circostante. Successivamente, posizionare l'osso della gamba in PBS ghiacciato.Per prelevare il cervello, utilizzare un nuovo pezzo di garza sterile per afferrare la testa ed esporre delicatamente il cranio rimuovendo la pelle con forbici e pinzette. Successivamente, utilizzare le forbici per tagliare con attenzione l'osso occipitale partendo dal centro superiore del cranio lungo una linea dritta e verso il basso, in modo da esporre la parte posteriore del cervello. Quindi, inserendo lo strumento sotto il tessuto in direzione della parte anteriore del cranio, trasferire l'intero cervello in PBS ghiacciato.Per generare il mezzo condizionato del polmone, capovolgere le provette contenenti il tessuto polmonare tre volte per rimuovere qualsiasi residuo di sangue dagli organi. Successivamente, sostituire la soluzione di lavaggio con PBS freddo fresco e ripetere l'operazione fino a quando la soluzione salina risulti priva di sangue. Poi, trasferire i polmoni in una piastra di Petri di vetro da 60 millimetri quadrati per topo e utilizzare due lame di bisturi sterili per tritare i tessuti mediante ripetuti tagli avanti e indietro.Quando i frammenti di tessuto hanno dimensioni di circa un millimetro cubo, risospendere i pezzi nel volume appropriato di mezzo DMEM:F12 integrato con antibiotici e incubare i tessuti in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti per topo a 37 gradi Celsius e cinque percento di CO2. Dopo 24 ore, trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto in provette coniche individuali da 50 millilitri e diluire il mezzo condizionato con tre volumi equivalenti di mezzo DMEM:F12 fresco per ogni provetta. Centrifugare le provette per rimuovere eventuali frammenti di tessuto di grandi dimensioni.Quindi, raccogliere i mezzi condizionati attraverso un filtro per siringa da 0,22 micron in un singolo tubo conico da 50 millilitri. Per generare il mezzo condizionato del midollo osseo, trasferire le ossa sotto una cappa a flusso laminare sterile e rimuovere i tessuti in eccesso dall'osso. Utilizzare le forbici per rimuovere le epifisi.Quindi, utilizzare un ago da 27 e mezzo per lavare un millilitro di PBS attraverso la cavità midollare di ciascun osso in un tubo contenente PBS fresco. Una volta raccolte tutte le cellule stromali del midollo osseo, lavare le cellule tre volte in PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 20 millilitri di mezzo di crescita per cellule stromali ossee integrato con il 10% di siero fetale bovino e seminare 10 millilitri di cellule per fiala T75.Quando le cellule hanno raggiunto una confluenza di circa il 70%, lavare le colture due volte con tre millilitri di PBS. Successivamente, staccare le cellule utilizzando tre millilitri di soluzione di tripsina/EDTA 0,025%, avendo cura che la tripsina ricopra l'intera superficie della fiasca. Dopo due o tre minuti, arrestare la reazione enzimatica aggiungendo tre millilitri di mezzo di crescita per cellule stromali ossee e raccogliere le cellule in un tubo da 50 millilitri.Centrifugare le cellule. Successivamente, risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo fresco. A questo punto, suddividere le colture in rapporto uno a cinque in tre nuove fiasche T75 fino al raggiungimento di una confluenza del 70%.Quindi, lavare le cellule tre volte con PBS come appena dimostrato e coltivare con mezzo di raccolta per cellule stromali ossee senza siero, integrato con mitogeno e antibiotici, per 72 ore. Dopo il terzo giorno di coltura, raccogliere i mezzi attraverso un filtro da 0,22 micron. Le cellule stromali dovrebbero risultare aderenti in coltura con una morfologia allungata e fibroblastica osservata nelle colture di cellule stromali del linfonodo, e una morfologia più piccola e arrotondata presente nelle colture di cellule stromali del midollo osseo.L'analisi mediante citometria a flusso conferma che le cellule stromali del linfonodo sono prevalentemente negative per CD45 e positive per gp38. Le cellule stromali del midollo osseo devono risultare positive per CD-44 e CD-29, debolmente positive per CD-105 e Sca-1, e negative per CD-73. Le cellule del cancro al seno umano con diversi background genetici mostrano schemi differenziali di migrazione e crescita verso condizioni specifiche di organo.Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, la variante 231-BoM con tropismo osseo migra preferenzialmente verso il mezzo condizionato del midollo osseo rispetto ai mezzi condizionati cerebrale e polmonare. Analogamente, la variante 231-LM2 con tropismo polmonare migra preferenzialmente verso il mezzo condizionato polmonare rispetto ai mezzi condizionati del midollo osseo e cerebrale. Inoltre, l'analisi mediante RT qPCR dimostra che l'esposizione delle cellule tumorali della mammella MDA-MB-231 parentali a mezzo condizionato osseo o polmonare induce un'up-regolazione dei geni associati alle metastasi specifiche del tumore della mammella a livello osseo o polmonare in vivo.Una volta acquisita padronanza, le operazioni di raccolta del tessuto e di preparazione del mezzo condizionato possono essere completate in due o tre ore, se eseguite correttamente. Le fasi di subcoltura nei giorni successivi richiedono da 15 a 30 minuti al giorno. Durante l'esecuzione di queste procedure, è fondamentale ricordare di mantenere tutto sterile.Dopo la generazione del mezzo condizionato, altri metodi come array proteici, saggi di crescita e migrazione cellulare, formazione di tumorsfere e RT-PCR possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardo l'effetto dei fattori specifici degli organi sul comportamento delle cellule tumorali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio del cancro al seno per esplorare il comportamento metastatico specifico degli organi in un sistema modello ex vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare mezzi condizionati utilizzando le ossa, i polmoni e il cervello dei topi.Non dimenticare che lavorare con strumenti di dissezione taglienti può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come l'uso di una tecnica di dissezione precisa e accurata, durante l'esecuzione di questa procedura.

generation-organ-conditioned-media-applications-for-studying-organ

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Questo video descrive un metodo per generare un mezzo condizionato all'organo derivato dal fegato del topo. Questo sistema modello può essere utilizzato per identificare e studiare fattori solubili derivati da organi e i loro effetti sul tropismo degli organi e sul comportamento metastatico delle cellule tumorali.

Terreno condizionato dall'organo: terreno di generazione da cellule d'organo prelevate per studi sul cancro metastatico

Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per&gt; 6 mesi.

Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

I protocolli sono descritti per studiare la migrazione delle cellule del cancro al seno, la proliferazione e la colonizzazione in un tessuto osseo sistema modello espianto umana.

Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Gli organoidi sviluppati dalle ghiandole mammarie del topo sono stati irradiati e caratterizzati per valutare i tratti epiteliali e le interazioni con le cellule immunitarie. Gli organoidi irradiati possono essere utilizzati per valutare meglio le interazioni delle cellule cellulari che possono portare al reclutamento di cellule tumorali nel tessuto normale irradiato.

Crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie

Mostriamo un metodo per la necropsia e la dissezione dei modelli di cancro alla prostata del topo, concentrandosi sulla dissezione del tumore alla prostata. Viene inoltre presentato un protocollo passo-passo per la generazione di organoidi tumorali della prostata del topo.

Generazione di organidi tumorali da modelli murini geneticamente ingegnerizzati del cancro alla prostata

Viene presentato un protocollo per generare organoidi endometriali primari umani costituiti da cellule epiteliali e stromali e che conservano le caratteristiche del tessuto endometriale nativo. Questo protocollo descrive i metodi dall'acquisizione del tessuto uterino all'elaborazione istologica degli organoidi endometriali.

Generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari

La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Questo protocollo discute un approccio per generare organoidi epiteliali dal tessuto mammario primario normale e tumorale attraverso la centrifugazione differenziale. Inoltre, sono incluse istruzioni per la coltura tridimensionale e l'imaging immunofluorescente di organoidi incorporati.

Generazione e imaging di organoidi epiteliali di topo e umani da tessuto mammario normale e tumorale senza passaggio

Qui viene fornito un protocollo dettagliato per stabilire organoidi mammari umani da resezioni di tumore al seno derivate da pazienti o tessuto mammario normale. Il protocollo fornisce istruzioni dettagliate complete per la coltivazione, il congelamento e lo scongelamento degli organoidi mammari derivati dal paziente umano.

Istituzione e coltura di organoidi mammari derivati da pazienti

Scopri come generare media condizionati da organi murini per studiare i fattori solubili specifici d'organo e il loro impatto sul comportamento metastatico delle cellule tumorali al seno.

Generazione di Media e Applicazioni organo condizionata per lo studio Influenze organo-specifiche sul cancro al seno metastatico Comportamento (Video) | JoVE Journal

Generazione di Media e Applicazioni organo condizionata per lo studio Influenze organo-specifiche sul cancro al seno metastatico Comportamento

Esplora altri video