Name: Un passo negativo cromatografica Purificazione di Helicobacter pylori Neutrofili-attivazione della proteina sovraespresso in Escherichia coli In modalità batch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Scopri la purificazione cromatografica negativa di HP-NAP da Escherichia coli con resina DEAE in modalità batch. Questo metodo efficiente produce proteina funzionale ad alta purezza per applicazioni vaccinali e diagnostiche contro Helicobacter pylori.

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Ringraziamo il Dr. Chao-Sheng Cheng della National Tsing Hua University, Taiwan, per aver eseguito la misurazione del dicroismo circolare. Ringraziamo anche i dottori Evanthia Galanis e Ianko D. Iankov della Mayo Clinic, USA, per aver fornito l'anticorpo monoclonale anti-HP-NAP. Ringraziamo i dottori Han-Wen Chang e Chung-Chu Chen del Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, per la consulenza fornita per l'applicazione dell'IRB, il signor Te-Lung Tsai del Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, per la supervisione dell'analisi dei neutrofili isolati, e la signora Ju-Chen Weng della National Tsing Hua University, Taiwan, per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 e NSC98-2311-B-007-006-MY3), dal programma di ricerca congiunto della National Tsing Hua University e del Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1) e dal programma di ricerca della National Tsing Hua University (104N2052E1).

Il sangue umano è stato raccolto da volontari sani con il previo consenso informato scritto e approvazione da parte del Institutional Review Board della National Tsing Hua University, Hsinchu, Taiwan. 1. Espressione ricombinante HP-NAP in E. coli <ol><li> Preparare il plasmide pET42a-NAP che contiene la sequenza di DNA di HP-NAP da H. pylori 26695 ceppo come descritto in precedenza 16. Preparare i plasmidi contenenti la sequenza di DNA di HP-NAP con le mutazioni puntiformi desiderati come descritto (vedi protocollo, punto 8). </li><li> Trasformare 10 ng dei plasmidi di DNA sopra in E. coli BL21 (DE3) cellule competenti di shock termico per 45 secondi a 42 ° C, striscia le celle brodo lisogenia (LB) piastre di agar contenenti 50 mg / ml kanamicina, e incubare le piastre a 37 ° C per 16 ore. </li><li> Seminare singole colonie in tubi singoli contenenti 5 ml di brodo LB con 50 ug / ml kanamicina e crescere come precultures a 37 ° C per 16 ore con agitazione a 170 giri al minuto. </li><li> Seminare 2 ml di cellule pre-coltura sopra in 200 ml di brodo LB contenente 50 ug / ml kanamicina in un pallone da 1 L. Incubare la pallone di coltura inoculato a 37 ° C per 2 ore con agitazione a 170 rpm fino l&#39;assorbanza a 600 nm raggiunge circa 0,4-0,5 rilevati mediante UV / VIS. </li><li> Aggiungere 80 ml di 1 M isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) nella cultura sopra ad una concentrazione finale di 0,4 mM di indurre l&#39;espressione di HP-NAP. Incubare la coltura per 3 ore finché l&#39;assorbanza a 600 nm raggiunge circa 1,6-1,7. </li><li> Centrifugare le cellule a 6000 xga 4 ° C per 15 minuti per rimuovere il surnatante. Conservare il pellet cellulare a -70 ° C fino purificazione. </li></ol> 2. Preparazione della frazione proteica solubile contenenti HP-NAP Nota: Tutti i seguenti passaggi vengono effettuati a 4 ° C. <ol><li> Risospendere 50 ml della cellula pEllet preparata nel protocollo punto 1.6 in 20 ml di 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM NaCl contenente 0.13 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 0,03 mM N-alpha-tosil-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK), e 0,03 mM N-tosil-L-fenilalaninil-chloromethylketone (TPCK) a 4 ° C come descritto in precedenza 16. </li><li> Frantumare le cellule dei batteri facendo passare la sospensione batterica attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione azionata ad una gamma di 15.000 a 20.000 psi per 7 volte a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il lisato cellulare a 30.000 xg a 4 ° C per 1 ora per separare le frazioni proteiche solubili e insolubili utilizzando un&#39;ultracentrifuga. Trasferire il surnatante come frazione proteica solubile in un becher. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine ​​della frazione proteina solubile con il metodo di Bradford utilizzando un kit commerciale con siero albumina bovina (BSA) come standard secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Aggiungere 177,6 ml di HCl 1 N in 20 ml di thfrazione proteica solubile e ottenuto dal protocollo punto 2.3 per regolarne il valore di pH da pH 9,0 a pH 8,0. </li><li> Aggiungere 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl alla soluzione proteica sopra per effettuare la concentrazione proteica finale sia 0,5 mg / ml. </li></ol> 3. Purificazione di ricombinante HP-NAP Da E. coli da Negativo cromatografia modalità batch con resine a scambio ionico DEAE <ol><li> Preparare 15 ml di resine DEAE. <ol><li> Pesare 0,6 g di polvere secca di resine DEAE e sospensione in 30 ml di 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl a temperatura ambiente per almeno 1 giorno. </li><li> Centrifugare la resina a 10.000 x ga 4 ° C per 1 min. </li><li> Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 15 ml di 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl. </li><li> Ripetere i passaggi protocollo 3.1.2 a 3.1.4 quattro volte di più. </li><li> Conservare i 15 ml di resina regolate (50% slurry in 30 ml di tampone Tris) a 4 ° C per un uso successivo. Nota: Tutti i seguenti steps è condotta a 4 ° C. </li></ol></li><li> Aggiungere 45 ml di proteine ​​solubili preparati nel protocollo punto 2.6 a 15 ml della resina e mescolare la poltiglia proteine ​​/ resina con un agitatore magnetico a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Versare la poltiglia proteine ​​/ resina in una colonna plastica o vetro, dotata di rubinetto. Lasciare che la resina di stabilirsi per gravità. </li><li> Aprire il rubinetto per consentire alla soluzione proteica per eseguire attraverso la colonna flusso per gravità fino a che il livello del liquido nella colonna è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso attraverso la frazione non legata, che contiene il purificato HP-NAP. </li><li> Aggiungere 15 ml di ghiaccio freddo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl nella colonna. </li><li> Aprire il rubinetto per consentire al tampone di lavaggio per eseguire attraverso la colonna flusso per gravità fino a che il livello del liquido nella colonna è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso attraverso la frazione di lavaggio. </li><li> Ripetere i passaggi protocollo 3.5 a 3.6 quattro volte di più per raccogliere le frazioni di lavaggio aggiuntivi. </li><li> Aggiungere 15 ml di ghiaccio freddo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl in una colonna. </li><li> Aprire il rubinetto per consentire al tampone di eluizione a correre attraverso la colonna flusso per gravità fino a che il livello del liquido nella colonna è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso attraverso la frazione di eluizione. </li><li> Ripetere i passaggi protocollo 3.8 a 3.9 quattro volte di più per raccogliere le frazioni di eluizione aggiuntivi. </li></ol> 4. Scambio Buffer e rimozione di endotossina HP-NAP Purificato da Negative cromatografia modalità batch con DEAE Resine Nota: Il purificato HP-NAP espresso in E. coli deve essere sottoposto al buffer di scambio e la rimozione di endotossina prima stimolare neutrofili. <ol><li> Eseguire dialisi per modificare il buffer del purificato HP-NAP di tampone fosfato salino di Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, a 4 ° C utilizzando tubo di dialisi con molecolare cutoff peso di 14 kDa come descritto in precedenza 24. </li><li> Filtrare il HP-NAP dializzata attraverso un SyringFiltro e con una carica positiva, la membrana idrofila attaccato ad una siringa monouso da 20 ml a portate da 2,5 a 4 ml / minuto a 4 ° C per rimuovere endotossine. </li></ol> 5. caratterizzazione delle proprietà molecolari del purificata ricombinante HP-NAP di dodecil solfato di sodio-SDS-PAGE (SDS-PAGE), Western Blotting, nativo-PAGE, gel filtrazione Cromatografia e Circular Dicroismo Spettroscopia <ol><li> Analizzare il purificato ricombinante HP-NAP mediante SDS-PAGE e western blotting con sovranatanti di coltura di ibridomi contenenti anticorpo monoclonale murino Mab 16F4 25 come descritto in precedenza 24. </li><li> Analizzare la purificato HP-NAP da nativo-PAGE e cromatografia su gel di filtrazione per esaminare lo stato oligomerico come descritto in precedenza 26. </li><li> Analizzare il purificato ricombinante HP-NAP mediante spettroscopia di dicroismo circolare per esaminare la sua struttura secondaria come descritto in precedenza 26. </li></ol> 6. Valutazione della purezza di HP-NAP da Silver colorazione di un gel SDS-PAGE <ol><li> Preparare la soluzione di fissaggio, sensibilizzazione soluzione, soluzione d&#39;argento, soluzione di sviluppo, stop soluzione, e la soluzione di lavaggio secondo le istruzioni di un kit d&#39;argento colorazione del produttore. </li><li> Eseguire colorazione d&#39;argento di un gel SDS-PAGE secondo le istruzioni di un kit di colorazione d&#39;argento del produttore. </li><li> Acquisire l&#39;immagine del gel con un sistema di imaging. </li></ol> 7. Misura del ROS di produzione dai neutrofili indotta da HP-NAP <ol><li> Isolare neutrofili umani da sangue eparinizzato umano mediante sedimentazione destrano seguita da centrifugazione in gradiente di densità come descritto in precedenza 24. </li><li> Misura della produzione di ROS da neutrofili stimolati con HP-NAP utilizzando un saggio di chemiluminescenza luminol-dipendente. <ol><li> Attivare un lettore di piastre e impostare la temperatura a 37 ° C. Inserire unfondo piatto vuoto piatto a 96 pozzetti bianca all&#39;interno della camera di lettore di piastre, permettendo così di riscaldare a 37 ° C. </li><li> Preparare le miscele di stimolo in D-PBS, pH 7,2, contenente 0,9 mM CaCl 2, 0.5 mM MgCl 2 e 13,3 pM 5-ammino-2,3-diidro-1,4-phthalazinedione (luminol) con la presenza e assenza di 0,67 micron endotossine-rimosso HP-NAP preparata dal protocollo passo 4.2. </li><li> Regolare la concentrazione di neutrofili umani preparati protocollo punto 7.1 a 2 x 10 6 cellule / ml in D-PBS, pH 7,2, contenente 5 mM di glucosio. </li><li> Aggiungere 50 ml di sospensione di neutrofili in ciascun pozzetto della 96-bene mentre plate. </li><li> Aggiungere 150 microlitri della miscela stimolo preparati con protocollo punto 7.2.2 nei neutrofili e contenenti un intervallo di tempo di 5 secondi per pozzetto. </li><li> Misurare le emissioni di chemiluminescenza per 5 sec per oltre un periodo di tre ore utilizzando un lettore di piastre. </li></ol></li></ol> 8.La costruzione del DNA plasmidi ospitare HP-NAP Mutants da Polymerase Chain Reaction (PCR) a base di mutagenesi sito-diretta Nota: mutagenesi sito-diretta PCR-based è stato generato essenzialmente come descritto in precedenza 27, tranne che i siti di restrizione &quot;silenziose&quot; sono state introdotte per i primer di mutagenesi sito-diretta dal mutagenesi (SDM) software -Assistere 28. <ol><li> Eseguire la PCR reazione. <ol><li> Aggiungere 10 ng di plasmide pET42a-NAP, 1 mM di mutagenesi coppie di primer elencati nella tabella 1, 200 micron di trifosfati deossinucleosidici (dNTP), e 3 unità di alta fedeltà mix enzima PCR in una provetta PCR contenenti acqua deionizzata, dando una finale volume di 25 microlitri. </li><li> Avviare i cicli di PCR a 95 ° C per 10 minuti per denaturare il DNA stampo, e seguire con 12 cicli di amplificazione a 95 ° C per 1 minuto, T M No -5 ° C per 1 minuto, e 72 ° C per 6 min. </li><li> Finire i cicli di PCR conuna fase di ricottura a T m pp -5 ° C per 1 minuto ed una fase di estensione a 72 ° C per 30 min. </li></ol></li><li> Trattare 15 ml di prodotto di PCR con 0,4 ml di Dpn I restriction enzyme a 37 ° C per 2 ore e quindi analizzare 2 microlitri del prodotto PCR Dpn I trattati mediante elettroforesi su gel di agarosio. </li><li> mutanti schermo. <ol><li> Trasforma 2 ml di prodotto di PCR in E. coli DH5α cellule competenti di shock termico per 45 sec a 42 ° C. </li><li> Distribuire le cellule trasformate su una piastra di LB contenente 50 ug / ml kanamicina e incubare la piastra a 37 ° C per 16 ore. </li><li> Isolare il DNA plasmidico dalle colonie batteriche utilizzando un kit commerciale lisi alcalina secondo il protocollo del produttore. </li><li> Trattare il DNA plasmide isolato nel protocollo passo 8.3.3 con XhoI enzima di restrizione per verificare la presenza delle mutazioni silenti desiderati secondo il protocollo del produttore. </li><li> sequenza ilplasmide DNA verificato da protocollo passo 8.3.4 con T7 promotore primer per confermare la correzione delle sequenze codificanti di mutanti HP-NAP secondo il protocollo del produttore. </li></ol></li></ol>

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<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li>
<li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+%27silent%27+restriction+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li>
</ol>

HWF e YCY sono inventori dei brevetti TW I 432579 e US 8,673,312 per il metodo di purificazione in un solo passaggio della proteina attivante i neutrofili Helicobacter pylori . Tutti i materiali descritti nel manoscritto saranno disponibili per scopi di ricerca. Gli autori confermano che ciò non altera la loro adesione a tutte le politiche di JoVE sulla condivisione di dati e materiali.

La modalità di cromatografia lotto negativo con resine a scambio anionico DEAE qui presentata è adatto per la purificazione di ricombinante HP-NAP sovraespresso in E. coli. I valori di pH dei tamponi usati nelle fasi di lisi cellulare e purificazione sono molto critici per assicurare la solubilità di HP-NAP in E. lisati coli e efficiente separazione dei ricombinante HP-NAP dalle impurità cellula ospite, rispettivamente. Le cellule batteriche devono essere lisati a pH 9,0, e la purificazione ne...

Helicobacter pylori (H. pylori) è una delle principali cause di gastrite e ulcera peptica. Questo batterio è stato classificato come sostanza cancerogena per l&#39;uomo dall&#39;Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro, che fa parte dell&#39;Organizzazione Mondiale della Sanità, nel 1994. E &#39;stato stimato che la prevalenza di H. pylori è del 70% nei paesi in via di sviluppo e il 30-40% nei paesi industrializzati 1. Anche se il tasso di infezione di H. pylori è in calo nei paesi industrializzati, il tasso di infezione di H. pylori nei paesi in via di sviluppo è ancora alto 2. Il trattamento standard per sradicare H. pylori consiste nella somministrazione di un inibitore della pompa protonica, PPI, e due antibiotici, claritromicina più amoxicillina o metronidazolo 3. Tuttavia, l&#39;aumento della resistenza agli antibiotici in H. pylori -related terapia dell&#39;ulcera sollecita lo sviluppo di nuove strategie per prevenire or curare l&#39;infezione. Sviluppo di vaccinazione preventiva e / o terapeutico contro H. pylori potrebbe fornire un approccio alternativo per controllare H. pylori. Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine ​​(HP-NAP), un importante fattore di virulenza di H. pylori, è stato identificato in estratti di acqua di H. pylori con la possibilità di attivare neutrofili di aderire alle cellule endoteliali e produrre specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) 4. Infiltrazione dei neutrofili della mucosa gastrica si trovano in H. pylori pazienti infettati con gastrite attiva possono provocare infiammazione e danni ai tessuti dello stomaco. Così, HP-NAP può giocare un ruolo patologico attivando neutrofili per indurre infiammazione gastrica, che provoca ulteriore ulcera o H. pylori -associated malattie gastriche. Tuttavia, HP-NAP è un potenziale candidato per le applicazioni cliniche 5,6. A causa della pro immunogenica e immunomodulanteprietà di HP-NAP, questa proteina potrebbero essere utilizzati per sviluppare vaccini, agenti terapeutici, e strumenti diagnostici. Uno studio clinico è stato condotto per l&#39;utilizzo ricombinante HP-NAP come uno dei componenti di un vaccino contro H. proteine pylori. Questo vaccino è costituito da ricombinante HP-NAP, cytotoxin associata gene A (CagA), e le proteine ​​vacuolizzante citotossina A (VacA) formulato con idrossido di alluminio ed è stato ulteriormente dimostrato di essere sicuro ed immunogenico negli esseri umani 7. Inoltre, HP-NAP agisce come un potente immunomodulatore per innescare T helper di tipo 1 (Th1) -polarized risposte immunitarie per la terapia del cancro 8 e per regolare le risposte immunitarie Th2-mediate indotte da reazioni allergiche e infezioni parassitarie 9,10. Per quanto riguarda la diagnostica, ricombinante ELISA HP-NAP-based è stata applicata per rilevare gli anticorpi sierici contro HP-NAP in H. pylori -infected pazienti 11. Uno studio ha mostrato che il livello di anticorpi specifici per HP-NAP nei sieri di H. pylori -infected pazienti con cancro gastrico è risultata significativamente più alta di quella di pazienti con gastrite cronica 12. Un altro studio ha anche dimostrato che gli anticorpi sierici contro HP-NAP sono associati con la presenza di non-cardias adenocarcinoma gastrico 13. Così, ricombinante ELISA HP-NAP-based può essere applicata per rilevare anticorpi contro HP-NAP per la prognosi del cancro gastrico in H. pylori -infected pazienti. Nel loro insieme, la HP-NAP purificata potrebbe essere ulteriormente utilizzato per la prevenzione, il trattamento e la prognosi di H. pylori -associated malattie e terapia del cancro. Tra i vari metodi utilizzati per la purificazione di ricombinante HP-NAP espresso in Escherichia coli (E. coli), nella sua forma nativa, presentate finora, una cromatografia di gel-filtrazione seconda fase di purificazione che coinvolge è necessario per ottenere elevata purezza HP-NAP 14-16 . Qui, un metodo che utilizza negativo cromatografia modalità batch condietilamminoetil (DEAE) resine a scambio ionico è descritto per la purificazione di HP-NAP sovraespresso in E. coli con alto rendimento e di elevata purezza. Questa tecnica di purificazione è stata basata sul legame di proteine ​​della cellula ospite e / o impurezze diverse HP-NAP alla resina. A pH 8,0, quasi senza altre proteine ​​tranne HP-NAP vengono recuperati dalla frazione non legata. Questo approccio purificazione mediante DEAE cromatografia a scambio ionico in modalità negativa è semplice e risparmio consentendo purificazione ricombinante HP-NAP tramite one-step cromatografia attraverso la raccolta della frazione libera tempo. Oltre ad HP-NAP, diverse altre biomolecole, come virus 17, Immunoglobulina G (IgG) 18, emoglobina 19, proteina fosfatasi 20, e fattore di virulenza flagellin 21, sono stati segnalati anche ad essere purificata dalla cromatografia a scambio ionico in negativo modalità. La modalità negativa è preferito per cromatografia a scambio ionico se impurità sono il minorecomponenti presenti nel campione sottoposto da depurare 22. L&#39;applicazione della cromatografia negativo purificazione di biomolecole naturali o ricombinanti è stato recentemente rivisto 23. Il presente rapporto fornisce un passo per passo il protocollo per l&#39;espressione ricombinante HP-NAP in E. coli, la lisi delle cellule, e purificazione di HP-NAP utilizzando modalità negativa cromatografia batch con resine a scambio ionico DEAE. Se una proteina desiderata per purificazione è adatto per cromatografia a scambio ionico in modo negativo, il protocollo descritto potrebbe anche essere adattato come punto di partenza per lo sviluppo di un processo di purificazione.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>preparato come descritto in Dati supplementari di riferimento 15&nbsp; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>C6000-03</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>MD Biomedical Inc</td><td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20</td></tr><tr><td>fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>inibitore della proteasi http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-alfa-tosil-L-lisinil-clorometilchetone (TLCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td><td>inibitore della proteasi http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-tosil-L-fenillalaninil-clorometilchetone (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4376</td><td>inibitore della proteasi http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Protein standard (albumina sierica bovina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&nbsp;</td><td>una proteina standard per il saggio delle proteine Bio-Rad http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>DEAE&ndash; Sephadex &nbsp; Cloruro A-25 forma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Tubi per dialisi Spectrum/Por</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132720</td><td>con cutoff del peso molecolare di 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td></tr><tr><td>Unità Acrodisc® con Mustang® E membrana</td><td>Pall</td><td>MSTG25E3</td><td>per la rimozione delle endotossine; operato a velocità di flusso comprese tra 1 e 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td></tr><tr><td>l'anticorpo monoclonale di topo MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>sollevato contro l'HP-NAP purificato del ceppo di H. pylori NCTC 11637 come descritto nel riferimento 23; &nbsp; Un regalo dei dottori Evanthia Galanis e Ianko D. Iankov della Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28989335</td><td>per cromatografia con filtrazione su gel http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td></tr><tr><td>Kit di colorazione all'argento PlusOne, proteina</td><td>GE Healthcare Scienze della vita</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Scienze della vita</td><td>17-1440-02</td><td>per la centrifugazione in gradiente di densità per purificare i neutrofili umani http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td></tr><tr><td>Piastra bianca a 96 pozzetti a fondo piatto</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>protetta dalla luce http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td> sistema PCR a modello lungo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td>fonte di miscela di enzimi PCR ad alta fedeltà http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alfa;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Codice prodotto</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV/VIS a doppio raggio U-2800</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td>N/A</td><td>fuori mercato e aggiornato a un nuovo modello http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore ad alta pressione EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin Inc</td><td>C315320</td><td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>Hitachi Koki himac CP80WX ultracentrifuga generale</td><td>Hitachi Koki Co</td><td>90106401</td><td>per la separazione delle frazioni proteiche solubili e insolubili da E. coli lisati http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1900-26</td><td>per cromatografia a filtrazione su gel http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td></tr><tr><td>Aviv modello 62ADS Spettrofotometro CD</td><td>Aviv Biomedical</td><td>N/A</td><td>fuori mercato e aggiornato a un nuovo modello http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td></tr><tr><td>sistema di imaging LAS-3000</td><td>Fujifilm</td><td>N/A</td><td>fuori produzione e sostituito http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>Wallac 1420 (Victor2) contatore multilabel</td><td>Perkin-Elmer</td><td>1420-018</td><td>per il rilevamento della chemiluminescenza http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td></tr></tbody></table>

un passo negativo cromatografica purificazione di<em&gt; helicobacter pylori</em&gt; neutrofili-attivazione della proteina sovraespresso in<em&gt; escherichia coli</em&gt; in modalità batch

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine ​​(HP-NAP) è un importante fattore di virulenza di Helicobacter pylori (H. pylori). Essa svolge un ruolo fondamentale in H. pylori indotta infiammazione gastrica attivando diversi leucociti innate tra neutrofili, monociti e mastociti. Le proprietà immunogeniche e immunomodulanti di HP-NAP lo rendono un candidato potenziale diagnostico e vaccino per H. pylori e un nuovo candidato farmaco per la terapia del cancro. Per ottenere quantità sostanziali di purificato HP-NAP utilizzato per le sue applicazioni cliniche, un metodo efficace per purificare questa proteina con alta resa e purezza deve essere stabilito. In questo protocollo, abbiamo descritto un metodo per un passo negativo purificazione cromatografica ricombinante HP-NAP sovraespresso in Escherichia coli (E. coli) utilizzando dietilamminoetil (DEAE) resine a scambio ionico (per es., Sephadex) imodalità batch n. Ricombinante HP-NAP costituisce quasi il 70% delle proteine ​​totali in E. coli ed è quasi completamente recuperato nella frazione solubile upon lisi cellulare a pH 9,0. A condizione ottimale a pH 8,0, la maggioranza di HP-NAP viene recuperato nella frazione non legata mentre le proteine ​​endogene da E. coli sono efficacemente rimossi dalla resina. Questo metodo di purificazione mediante cromatografia modalità negativa batch con resine a scambio ionico DEAE produce funzionale HP-NAP da E. coli nella sua forma nativa con alta resa e purezza. L&#39;HP-NAP purificata potrebbe essere ulteriormente utilizzato per la prevenzione, il trattamento e la prognosi di H. pylori -associated malattie e terapia del cancro.

Lo schema della procedura sperimentale di purificazione negativo ricombinante HP-NAP espressa in E. coli mediante resine a scambio ionico DEAE in modalità batch è mostrato in Figura 1. Questa tecnica di purificazione è basato sul legame di proteine ​​della cellula ospite e / o impurezze diverse HP-NAP alla resina. A pH 8,0, quasi senza altre proteine ​​tranne HP-NAP nella sua forma nativa vengono recuperati dalla frazione libera (Figura 2A e <st...

Un metodo ad alto rendimento per un solo passaggio di purificazione negativo ricombinante Helicobacter pylori neutrofili-attivazione di proteine ​​(HP-NAP) sovraespresso in Escherichia coli utilizzando resine dietilamminoetil in modalità batch è descritta. HP-NAP purificata da questo metodo è utile per lo sviluppo di vaccini, farmaci, o diagnostica per H. pylori -associated malattie.

Un passo negativo cromatografica Purificazione di<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofili-attivazione della proteina sovraespresso in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In modalità batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

L'obiettivo generale di questa purificazione è ottenere la proteina attivante i neutrofili di Helicobacter pylori, o HP-NAP, in forma nativa, con elevata purezza e resa, utilizzando una cromatografia in modalità negativa con resina a scambio ionico di etilammino dietilico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'HP-NAP può essere purificata in un unico passaggio, in forma nativa, con elevata purezza e resa. La purificazione negativa dell'HP-NAP inizia con una procedura di legame in batch, in cui la frazione proteica solubile proveniente dai lisati batterici viene aggiunta alla resina DEAE.La miscela viene incubata per consentire alle proteine totali di legarsi alla resina. L'HP-NAP presente nella frazione non legata viene quindi ottenuto mediante centrifugazione o flusso per gravità. Le implicazioni di questa tecnica sono una prevenzione, un trattamento e una prognosi in rapporto di 10:1 per le malattie associate a Helicobacter pylori, nonché per la terapia del cancro.A causa delle proprietà immunogeniche e immunomodulatrici dell'HP-NAP. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà. Poiché l'HP-NAP si aggrega facilmente durante la sterilizzazione

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Un passo negativo cromatografica Purificazione di Helicobacter pylori Neutrofili-attivazione della proteina sovraespresso in Escherichia coli In modalità batch (Video) | JoVE Journal

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