Un passo negativo cromatografica Purificazione di

L'obiettivo generale di questa purificazione è ottenere la proteina attivante i neutrofili di Helicobacter pylori, o HP-NAP, in forma nativa, con elevata purezza e resa, utilizzando una cromatografia in modalità negativa con resina a scambio ionico di etilammino dietilico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'HP-NAP può essere purificata in un unico passaggio, in forma nativa, con elevata purezza e resa. La purificazione negativa dell'HP-NAP inizia con una procedura di legame in batch, in cui la frazione proteica solubile proveniente dai lisati batterici viene aggiunta alla resina DEAE.

La miscela viene incubata per consentire alle proteine totali di legarsi alla resina. L'HP-NAP presente nella frazione non legata viene quindi ottenuto mediante centrifugazione o flusso per gravità. Le implicazioni di questa tecnica sono una prevenzione, un trattamento e una prognosi in rapporto di 10:1 per le malattie associate a Helicobacter pylori, nonché per la terapia del cancro.

A causa delle proprietà immunogeniche e immunomodulatrici dell'HP-NAP. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà. Poiché l'HP-NAP si aggrega facilmente durante la sterilizzazione.

Il procedimento sarà dimostrato da Zhi-Wei Hong, uno studente laureato del nostro laboratorio. Lavorando a quattro gradi Celsius, sospendiamo 50 millilitri della pasta cellulare preparata come descritto nel protocollo testuale in 20 millilitri di tampone tris a basso contenuto salino a pH 9,0 con una miscela di inibitori della proteasi. È fondamentale mantenere il campione a quattro gradi Celsius per consentire al procedimento di prevenire l'aggregazione delle proteine.

Disperdere le cellule batteriche passando la sospensione batterica attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione, operato a una pressione compresa tra 15.000 e 20.000 PSI per sette volte a quattro gradi Celsius. Dopo la lisi batterica, il lisato deve essere centrifugato immediatamente. Trasferire i campioni omogeneizzati in una provetta per centrifuga.

Centrifugare immediatamente il lisato cellulare a 30.000 ×g a quattro gradi Celsius per un'ora, utilizzando una ultracentrifuga, per separare le frazioni proteiche solubili e insolubili. Dopo la centrifugazione, trasferire il soprannatante come frazione proteica solubile in un becher. Misurare la concentrazione proteica della frazione proteica solubile mediante il metodo di Bradford, utilizzando un kit commerciale con albumina sierica bovina come standard, seguendo le istruzioni del produttore.

Quindi aggiungere 177,6 µL di HCl 1 N in 20 mL della frazione proteica solubile per regolare il valore di pH da pH 9,0 a pH 8,0. Aggiungere Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, e cloruro di sodio 50 mM alla soluzione proteica in modo da ottenere una concentrazione proteica finale di 0,5 mg/mL. Per preparare 15 mL di resina DEAE, sospendere 0,6 g di polvere secca di resina DEAE in 30 mL di tampone Tris-HCl a temperatura ambiente per almeno un giorno.

Centrifugare la resina a 10.000 ×g a quattro gradi Celsius per un minuto, quindi rimuovere e scartare il soprannatante. Aggiungere quindi 15 millilitri di tampone Tris-HCl. Dopo aver ripetuto i passaggi di centrifugazione e risospensione altre quattro volte, conservare i 15 millilitri di resina sedimentata a quattro gradi Celsius per utilizzi successivi.

A quattro gradi Celsius, aggiungere 45 millilitri delle proteine solubili preparate a millilitri della resina e trasferire in un becher da 100 millilitri con agitatore magnetico. Mescolare la sospensione di proteine-resina utilizzando un agitatore magnetico a quattro gradi Celsius per un’ora. Successivamente, versare la sospensione di proteine-resina in una colonna di plastica o vetro munita di rubinetto e lasciare sedimentare la resina per gravità.

Aprire il rubinetto per permettere alla soluzione proteica di scorrere attraverso la colonna per gravità, fino a quando il livello del liquido nella colonna si trova appena sopra alla resina. Raccogliere il flusso in uscita come frazione non legata, che contiene la proteina attivante i neutrofili purificata. Aggiungere 15 millilitri del tampone Tris-HCl freddo di ghiaccio nella colonna.

Aprire nuovamente il rubinetto per consentire al tampone di lavaggio di scorrere attraverso la colonna per gravità, fino a quando il livello del liquido nella colonna si trova appena sopra alla resina. Raccogliere il flusso in uscita come frazione di lavaggio. Ripetere il lavaggio con tampone freddo aggiungendo ghiaccio altre quattro volte per raccogliere ulteriori frazioni di lavaggio.

Quindi aggiungere 15 millilitri di Tris-HCl 20 millimolare freddo di ghiaccio pH 8,0, cloruro di sodio uno molare nella colonna. Raccogliere il flusso in uscita come frazioni di eluizione, come in precedenza. Ripetere i passaggi di eluizione altre quattro volte per raccogliere ulteriori frazioni di eluizione.

L'effetto del pH sulla solubilità di HP-NAP nel lisato di E.coli è mostrato qui. La quantità di HP-NAP rilevata in questa frazione solubile è notevolmente aumentata a pH compreso tra 7,5 e 9,5. L'HP-NAP ricombinante è stato quasi completamente recuperato nella frazione solubile dopo il lisamento cellulare a pH 9,0.

Qui viene mostrato l'effetto del pH sulla purificazione negativa dell'HP-NAP ricombinante espresso in E.coli mediante resine DEAE in modalità batch. A pH 8,0, solo una piccola quantità di HP-NAP era presente nella frazione eluita. La quantità di HP-NAP presente nelle frazioni non legate era massima a pH 8,0.

La quantità ottimizzata di proteine caricate sulla resina DEAE è di 1,5 milligrammi di proteina per millilitro di resina, al fine di raggiungere la capacità massima della resina nell'assorbire le impurità da E.coli. A pH 8,0, pochissime proteine diverse dall'HP-NAP nella sua forma nativa vengono recuperate nella frazione non legata utilizzando resine DEAE in modalità batch. La purezza dell'HP-NAP era superiore al 95 percento.

HP-NAP purificato si ripiega in un multimero con una struttura secondaria ad alfa-elica, come mostrato dal cromatogramma di gel filtrazione e dallo spettro di dicromismo circolare nell'ultravioletto lontano. Un saggio chemiluminescente dipendente dal lume rivela che l'HP-NAP purificato è in grado di indurre la produzione di specie reattive dell'ossigeno da parte dei neutrofili. Una volta acquisite, queste tecniche possono essere eseguite entro cinque ore se effettuate correttamente.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come purificare l'HP-NAP funzionale nella sua forma nativa con resa elevata e alta purezza, utilizzando una cromatografia a batch in modalità negativa con resina DEAE e scambio ionico. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di utilizzare tamponi al pH appropriato nel passaggio di sterilizzazione della cromatografia a batch. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo provato ad applicare altre tecniche cromatografiche al posto della filtrazione per purificare l'HP-NAP nella sua forma nativa.

Sebbene questo metodo sia stato ideato per attrarre l'HP-NAP ricombinante espresso in E.coli, può essere applicato anche ad altri sistemi di espressione batterica come per-sida sep-tidas. La dimostrazione visiva di questa procedura è un codice rapido.

Inoltre, i passaggi di sterilizzazione e cromatografia a lotti sono difficili da apprendere, poiché devono essere eseguiti a quattro gradi Celsius senza alcun ritardo temporale. Se una proteina progettata per la purificazione è adatta alla nostra cromatografia di scambio in modalità negativa, questa procedura potrebbe comunque essere adattata come punto di partenza per lo sviluppo di un processo di purificazione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca clinica per esplorare la possibilità di utilizzare l'HP-NAP nella terapia del cancro, nonché nello sviluppo di vaccini, farmaci e diagnostici per le malattie associate a Helicobacter pylori.