Misura della produzione di anidride carbonica da marcata radioattivamente Substrati in

L'obiettivo generale di questo protocollo è misurare l'anidride carbonica prodotta da moscerini della frutta integri, utilizzando substrati radiomarcati come l'acido palmitico o il glucosio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali per i ricercatori di Drosophila, ad esempio se una determinata mutazione possa influenzare il metabolismo energetico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente misurazioni quantitative, sensibili e riproducibili dell'ossidazione dei combustibili in piccoli numeri di moscerini della frutta.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di assemblaggio della capsula per moscerini richiedono una rapida manipolazione di piccole parti, necessaria per garantire la corretta costruzione dell'apparato sperimentale prima che le mosche si riprendano dall'anestesia. Il carbonio-14 è un emettitore beta a bassa energia e ha un breve raggio d'azione nell'aria, ma è comunque necessario prestare attenzione per evitare lo spargimento di molecole radioattive o un'eventuale ingestione accidentale da parte dell'operatore. Mescolare da uno a due microcurie di substrato radioattivo con 15 microlitri di colorante alimentare blu FD&C Numero Uno e acqua, fino a ottenere un volume totale di 25 microlitri.

Trasferire con la pipetta tutta la miscela di substrato radioattivo e colorante blu nella parte inferiore di una provetta vuota per il cibo delle mosche. Poiché le provette per il cibo delle mosche si rovesciano facilmente, assicurarsi di collocarle all'interno di un contenitore che ne impedisca il rovesciamento. Riscaldare il cibo standard per mosche in un forno a microonde fino a quando il cibo si è appena liquefatto.

Da 15 a 20 secondi a potenza elevata sono generalmente sufficienti per un vial contenente 10 millilitri di cibo. Aggiungere 975 microlitri di cibo fuso alla miscela di substrato radiomarcato e colorante blu, quindi agitare rapidamente controllando l'uniformità del colore blu per assicurare un mescolamento completo. Le punte dei pipetti potrebbero dover essere tagliate con le forbici per allargare l'estremità stretta, consentendo così un prelievo accurato del cibo fuso viscoso.

Lasciare raffreddare il cibo e solidificare completamente a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Per anestetizzare le mosche adulte si utilizza un apparato anestetizzante a biossido di carbonio costituito da polietilene poroso fuso su una base in acrilico e collegato a una bombola di biossido di carbonio dotata di regolatore di pressione. Far fluire il biossido di carbonio nell'apparato anestetizzante a cinque litri al minuto.

Trasferire le mosche anestetizzate in provette contenenti cibo colorato di blu con traccianti radioattivi. Chiudere ogni provetta con un tappo di schiuma e posizionarla in orizzontale fino al risveglio delle mosche. Trasferire le provette in un contenitore acrilico con coperchio.

Per un'alimentazione a breve termine, privare le mosche del cibo per 18-24 ore prima del loro trasferimento sul cibo radiomarcato, in modo da garantire che mangino durante la fase di alimentazione della durata di due o tre ore. Per un'alimentazione a lungo termine della durata di cinque a sette giorni, non è necessario privare le mosche del cibo, ma lo sperimentatore deve monitorare il contenuto di acqua del cibo radiomarcato nei flaconi, utilizzando un ago e una siringa per aggiungere acqua ai flaconi con cibo secco. Al termine del periodo di alimentazione con il substrato radiomarcato, trasferire le mosche su cibo non marcato, facendole cadere in un nuovo flacone.

Un periodo iniziale di attesa di due a quattro ore permette alle mosche di rimuovere le particelle di cibo radiomarcate dal loro cuticolo e consente la digestione del cibo radiomarcato rimasto nell'intestino. Monitorare il transito del cibo attraverso l'intestino ispezionando visivamente le mosche alla ricerca di addomi di colore blu. Successivamente, trasferire le mosche su diversi tipi di cibo o a diverse temperature ambienti.

La durata di questo periodo di caccia varierà a seconda dell'esperimento in corso. Prima di preparare l'apparato per la raccolta di anidride carbonica, assemblare i materiali necessari per costruire i contenitori per moscerini, ovvero tubi con tappo in rete che conterranno moscerini marcati con glucosio C-14 o acido palmitico C-14, e che rimarranno aperti all'atmosfera. Fissare una lametta con un emostatico, riscaldarla nella fiamma di un becco Bunsen fino a quando diventa incandescente, e utilizzare la lametta riscaldata per tagliare la parte superiore di 50 millimetri di tubi in polipropilene di 12 millimetri per 75 millimetri, ottenendo tubi di 25 millimetri di lunghezza con fondo arrotondato.

Preparare quadrati di rete in nylon di 35 millimetri per 35 millimetri e 130 micron di spessore. Tagliare diversi pezzi di nastro trasparente lunghi da uno e mezzo a due pollici. Successivamente, assemblare i materiali per l'apparato di raccolta della anidride carbonica.

Per ogni contenitore di moscerini, assemblare un vial di vetro da 20 millilitri, un tappo di gomma con un foro eccentrico, una camera centrale e della carta filtrante in microfibra di vetro grado GFB. Inserire la camera centrale attraverso il foro nel tappo superiore. Preparare idrossido di potassio al 5% al momento dell'uso.

Subito prima di anestetizzare le mosche per il trasferimento nel contenitore per mosche, piegare e posizionare il filtro circolare in carta GFB nel pozzetto centrale, facendolo passare attraverso il foro del tappo di gomma, e saturarlo con 100 microlitri di idrossido di potassio al 5%. Il trasferimento delle mosche anestetizzate nei contenitori per mosche è il passaggio più difficile di questo protocollo. Per garantire il successo, tenere tutti i materiali necessari a portata di mano e lavorare rapidamente per limitare l'esposizione delle mosche all'anidride carbonica e per evitare che si risveglino e scappino prima che la rete sia stata fissata saldamente al tubo.

Dopo l'incubazione su terreni non marcati, anestetizzare le mosche con anidride carbonica. Trasferire le mosche anestetizzate nel tubo di polipropilene tagliato, chiuderlo con una rete di nylon e fissare la rete al tubo utilizzando nastro trasparente. Per un determinato esperimento, in ciascun contenitore per mosche deve essere utilizzato un numero uguale di mosche.

Da 10 a 20 moscerini per contenitore producono quantità sufficienti di anidride carbonica radiomarcata per essere misurate mediante conteggio con scintillazione. Trasferire il contenitore per moscerini nel vial di vetro da 20 millilitri. Chiudere il vial di vetro con un tappo a chiusura ermetica rivestito di gomma, contenente al centro un pozzetto con carta filtro GFB satura di idrossido di potassio.

Piegare la parte larga del tappo rivestito di gomma oltre il bordo del vial in vetro per scintillazione. Posizionare i vial in vetro contenenti le mosche in un contenitore acrilico con coperchio e incubare per periodi di tempo variabili. Al termine dell'incubazione, togliere il tappo dal vial in vetro e trasferire la carta filtro GFB saturata di idrossido di potassio in un vial di plastica per scintillazione da sei millilitri contenente 4 millilitri di cocktail per scintillazione.

Preparare provette per scintillazione aggiuntive, una contenente carta da filtro GFB non utilizzata da usare come fondo, e una o due provette contenenti da 0,1 a 0,5 microcurie di substrato marcati radioattivamente per determinare i conteggi al minuto per microcurie. Mediante un contatore a scintillazione, misurare i conteggi al minuto per ogni campione secondo il protocollo del produttore. Successivamente, calcolare la produzione totale di anidride carbonica come descritto nel testo del protocollo.

I moscerini sono stati sottoposti a digiuno per 18 ore, nutriti con acido palmitico marcato radioattivamente per due ore e quindi sottoposti a test per la produzione di anidride carbonica marcata radioattivamente, in gruppi di 12 o 25 animali, per incubazioni della durata di tre o sei ore. Come mostrato in questo grafico, la quantità di anidride carbonica prodotta da 25 moscerini era quasi il doppio rispetto a quella prodotta da 12 moscerini, e la quantità prodotta da ciascun gruppo raddoppiava quando il tempo di incubazione aumentava da tre a sei ore. I picomoli di anidride carbonica marcata radioattivamente per moscerino per ora erano quasi equivalenti in ciascun gruppo.

Dato che il digiuno stimola la degradazione degli acidi grassi tramite ossidazione beta, la produzione di anidride carbonica derivante dall'ossidazione degli acidi grassi dovrebbe essere più elevata negli animali a digiuno rispetto a quelli alimentati. Per verificare questa ipotesi, moscerini a digiuno da 18 ore sono stati nutriti con acido palmitico radiomarcato per due ore, suddivisi in due gruppi e trasferiti su cibo per moscerini non marcato o su agar al 1%. In due esperimenti separati, i moscerini coltivati su agar hanno prodotto una quantità significativamente maggiore di anidride carbonica radiomarcata rispetto ai moscerini coltivati su cibo, indicando un aumento dell'ossidazione beta negli animali a digiuno.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi complementari come la misurazione della produzione totale di anidride carbonica e del consumo totale di ossigeno, e il calcolo del rapporto di scambio respiratorio, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio riguardo alla fonte di combustibile preferita. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare questo protocollo per determinare l'effetto di una data mutazione o manipolazione sperimentale sulla capacità di utilizzare un particolare combustibile come fonte di energia. Non dimenticare che lavorare con radioattività può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come indossare guanti, camici da laboratorio e occhiali protettivi, e utilizzare un adeguato schermaggio durante l'esecuzione di questa procedura.