Name: Misura della produzione di anidride carbonica da marcata radioattivamente Substrati in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Scopri come misurare la produzione di anidride carbonica in Drosophila melanogaster utilizzando substrati radioattivi. Questo metodo consente misurazioni quantitative e sensibili dell'ossidazione dei combustibili.

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L'autore ringrazia i dottori Mingjian Lu e Morris Birnbaum per gli utili consigli e il supporto finanziario da parte di NIDDK (R21DK089391).

1. Preparazione di Fly alimentari contenenti radioattivo metaboliche Substrati <ol><li> In una provetta per microcentrifuga, mescolare 1 - 2 pCi substrato radioattivo (D- [6- 14 C]-glucosio, D [1- 14 C]-glucosio o acido -palmitic [1- 14 C], 40 - 60 mCi / mmol) con 15 microlitri FD &amp; C No. 1 blu colorante alimentare e H 2 O di eguagliare un volume totale di 25 microlitri. ATTENZIONE: Carbonio-14 è un beta emettitore a bassa energia ed ha un breve intervallo in aria. Tuttavia, fare attenzione per evitare fuoriuscita di molecole radioattivi o ingestione accidentale dallo sperimentatore. Vola fiale alimentari ribaltano facilmente; essere sicuri di ospitarli in un contenitore che li impediscono di ribaltamento, soprattutto quando radiomarcato è in forma liquida (punto 1.2) o in alimenti solidificata (passo 1,4). Le mosche che vengono alimentati o sono stati alimentati substrati radioattivi inizierà a espirare piccole quantità di CO 2 radioattivo. Queste mosche devono essere conservati in scatole acriliche in cappe di aspirazione, e un piccolo piatto di KOH can essere impostato nella casella per uso come scrubber CO 2. </li><li> Pipettare tutto il substrato radiomarcato e miscela colorante blu sul fondo di una fiala cibo mosca vuoto (altezza: 9.4 cm, larghezza: 2,2 cm). </li><li> standard di calore volare cibo in un forno a microonde fino a quando il cibo è solo liquefatto (15 - 20 secondi a livello di potenza alto per un flaconcino contenente 10 ml di cibo). </li><li> Aggiungere alimentare 975 ml fuso al substrato radiomarcato / blu mix colorante e rapidamente turbinare, il monitoraggio uniformità del colore blu, per garantire la completa miscelazione. </li><li> Lasciare cibo per raffreddare e solidificare completamente a temperatura ambiente per 20 - 30 min. </li></ol> 2. alimentazione Substrati marcata radioattivamente metabolico per mosche adulte di frutta <ol><li> Anestetizzare mosche adulte utilizzando un&#39;apparecchiatura anestetizzante CO 2 composto da polietilene porosa fusa a base acrilica e collegato ad un serbatoio di CO 2 con un regolatore di pressione. Flusso di CO 2 nell&#39;apparecchio anestetizzante a 5 l / min. <ol><li> Trasferimento anestetizzared vola a flaconi contenenti radioattivi, alimentare blu-tinto (n = 15 - 30 mosche per flaconcino). fiale Cap con un tappo di gomma piuma, e riposare orizzontalmente fino mosche svegliano. fiale trasferirla in un contenitore con coperchio in acrilico (180 cm x 180 cm x 240 cm di altezza). </li></ol></li><li> Per l&#39;alimentazione a breve termine, di fame mosche per 18 - 24 ore prima di trasferire le mosche al cibo radioattivo per un 2 -. Step di alimentazione 3 ore T ha fame passaggio è importante perché le mosche Fed non mangiano in modo affidabile una nuova fonte di cibo presentato a loro . Per l&#39;alimentazione a lungo termine nel corso di 5 - 7 giorni mosche non devono essere fame, ma lo sperimentatore devono monitorare il contenuto di acqua del cibo radiomarcato nei flaconcini mosche sono alloggiati e utilizzare un ago e siringa per aggiungere acqua per fiale con cibo secco. </li><li> Trasferimento vola al cibo senza etichetta &quot;battere&quot; loro in un nuovo flacone. Un periodo di caccia iniziale di 2 - 4 ore permette mosche per pulire le particelle di cibo radioattivi dalle loro cuticole e permette la digestione di radiomarcatocibo ed restante nell&#39;intestino. Monitorare i progressi del cibo attraverso l&#39;intestino mediante ispezione visiva delle mosche per cercare addome blu. </li><li> Successivamente, il trasferimento vola a diversi tipi di alimenti (12 - 24 ore sul cibo standard o 1% agar per la misurazione degli effetti di nutriti rispetto digiuno sulla respirazione) o temperatura ambiente (12-96 ore a 18 C o C per 30 genetica manipolazioni utilizzando GAL80 sensibile alla temperatura (GAL80 ts), per esempio). Nota: La durata di questo periodo di chase varierà con l&#39;essere eseguito l&#39;esperimento. Per esempio, può essere necessario un inseguimento a 96 ore a 30 C in esperimenti usando GAL80 ts al fine di attivare completamente l&#39;espressione del transgene GAL4-dipendente. </li></ol> 3. Preparazione della CO 2 -Collection Apparatus <ol><li> Assemblare materiali per la costruzione di &quot;volare baccelli&quot;, tubi di maglia-capped che conterranno le mosche etichettati con acido e tha C-palmitico 14 C-glucosio o 14t rimarrà aperto all&#39;atmosfera. Tagliare la parte superiore di 50 mm da 12 mm tubi di polipropilene x 75 mm, lasciando, tubi tondi fondo 25 mm a lungo. Preparare 35 mm x 35 mm piazze di 130 micron rete di nylon. Inoltre, ottenere nastro trasparente in un erogatore del nastro. </li><li> Assemblare materiali per i CO 2 apparati -Collection. Per ogni pod volano, montare un flaconcino da 20 ml di vetro scintillazione, un tappo superiore in gomma con foro eccentrico, un centro ben essere inserito attraverso il foro nel tappo superiore, grado GF / carta da filtro in microfibra di vetro B (diametro 2,1 centimetri cerchio, 1 pori micron). carta da filtro GF / B viene utilizzato per la sua elevata resistenza a umido e capacità di carico. </li><li> Preparare 5% KOH fresco il giorno di utilizzo. Appena prima del punto 3.4, piegare e posizionare la carta circolare filtro GF / B verso il centro e che è filettata attraverso il foro del tappo di gomma superiore e saturare con 100 ml di 5% KOH. Fare riferimento alla Figura 1. </li><li> Dopo l&#39;incubazione (s) su supporti senza etichetta, unanesthetize vola con CO 2. Spazzola vola nel tubo di taglio in polipropilene, tappo con rete di nylon, e utilizzare il nastro trasparente per aderire mesh tubo. Lavorare velocemente per evitare di mosche risveglio e fuggire prima che la rete è stata apposta in modo sicuro al tubo. Un numero uguale di linea dovrebbe essere usato in ogni pod fly per un particolare esperimento; 10 - 20 mosche per volare pod producono sufficiente radiomarcato-CO 2 per la misura dal conteggio per scintillazione (passo 4.1 sotto). </li><li> Trasferire il pod volo per un 20 ml in vetro scintillazione flaconcino. Tappare la fiala di vetro con il tappo superiore di gomma in possesso di un centro ben contenente carta da filtro GF / B KOH-saturo. Piegare la larghezza superiore del tappo superiore in gomma sul bordo della fiala di vetro scintillazione. Fare riferimento alla Figura 1. </li><li> fiale di vetro set contenente le mosche in un coperchio, il contenitore acrilico, e incubare per periodi di tempo variabili (da 2 a 12 ore funziona bene). </li></ol> 4. Analisi dei risultati <ol><li> AAlla fine dell&#39;incubazione, fiale di vetro Uncap e carta da filtro GF / B KOH satura trasferimento ad una plastica fiala di scintillazione 6 ml contenente 4 ml di scintillazione cocktail. </li><li> Se necessario, bloccare mosche in baccelli volare sul ghiaccio secco e conservare a -80 ° C per la determinazione successiva di substrati memorizzati. Si noti che questi campioni sono radioattivi e devono essere memorizzati conseguenza. </li><li> Preparare ulteriori fiale di scintillazione: uno contenente carta da filtro / B GF non utilizzati per servire come sfondo e uno a due altri contenenti 0,1 - 0,5 pCi substrato radioattivo per determinare cpm / uCi. </li><li> Misurare CPM per ogni campione utilizzando un contatore a scintillazione secondo il protocollo del produttore. </li><li> Calcolare pmol 14 CO 2 / cpm e 14 pmol di CO 2 per volare all&#39;ora. Sottrarre il CPM di fondo dal valore CPM per ogni campione. Dai dati substrato radioattivi pulito, calcolare il cpm / pCi di campione di fondo corretta contato. <ol><li> Usa ilfornito dal produttore attività specifica e concentrazione radiochimica del substrato radiomarcata (per esempio, 50 pCi / mol e 0,1 pCi / ml, rispettivamente) per calcolare pmol / cpm. Utilizzare questo fattore per convertire i dati fly pod sfondo con correzione da cpm 14 CO 2 / campione pmol 14 CO 2 / campione. Poi dividere per il numero di mosche e il numero di ore nel contenitore mosca. </li></ol></li></ol>

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</ol>

L'autore dichiara di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive un metodo per misurare l&#39;ossidazione di substrati specifici radiomarcati in adulti Drosophila melanogaster. Questa tecnica è semplice, quantitativa, riproducibile e sensibile, e integra metodi esistenti che misurano produzione totale di CO 2 e il consumo di O 2 in quanto può essere utilizzato per identificare la sostanza nutriente (s) essendo ossidato per la produzione di ATP. Misurazione della CO 2 liberata dalla ossidazione di substrati specifici radiomarcati utilizzando il metodo qui descritto è complementare a tecniche che misurano produzione totale di CO 2. Totale produzione di CO 2 (V CO2) permette di stimare il tasso metabolico e, quando è noto consumo totale O 2 (V O2), il tasso metabolico può essere calcolato e la fonte di combustibile per l&#39;ossidazione può essere stimato sulla base del rapporto di scambio respiratorio (V CO2 / V O2 = RER). quandoi carboidrati sono il substrato esclusiva, RER = 1, ma quando gli acidi grassi sono la fonte esclusiva, RER = 0.7, a causa della stechiometria delle reazioni di glucosio e ossidazione dei lipidi. In assenza di apparecchiature per misurare il consumo di ossigeno in Drosophila 14, il combustibile ossidativo non può essere identificato. Tuttavia, mediante l&#39;etichettatura vola con tracce di un substrato radioattivo o l&#39;altro e tassi di misura di radioattivo produzione di CO 2, si possono trarre conclusioni circa la capacità delle mosche di ossidare un determinato substrato in diversi momenti durante uno stimolo o sugli effetti di un data mutazione sul ossidazione del combustibile. Ci sono un certo numero di passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, si deve prestare attenzione quando si usano materiali radioattivi per evitare fuoriuscite e la contaminazione delle aree di ricerca. In secondo luogo, quando anestetizzare le mosche durante le fasi 2.1 e 3.4, lo sperimentatore dovrebbe lavorare velocemente per evitare gli effetti di una prolungata CO 2l&#39;esposizione sul metabolismo e sul comportamento. Un gruppo di 20 mosche può essere anestetizzato e trasferito in un nuovo flacone o in un baccello mosca in 20 secondi o meno. Quando trasferito da un apparecchio di anestesia in una fiala di cibo, il flaconcino deve essere riposato su un lato per evitare che le mosche anestetizzati di rimanere bloccati sulla superficie alimentare. Quando mosche sono cibo radioattivo nutriti nel corso di diversi giorni come al punto 2.2, lo sperimentatore deve assicurare che il cibo non si secchi in linea sono sensibili alla disidratazione. La FED o digiuno prima dell&#39;etichettatura, la scelta dell&#39;etichetta, la lunghezza del tempo di etichettatura, il periodo di tempo nel contenitore mosca, e il metodo di anestesia sono parametri che possono essere sottoposti a guasti e modifica quando si utilizza questa tecnica. In primo luogo, vola sottoposti a periodi di etichettatura brevi (2-3 hr) è improbabile che consumano quantità significative di cibo radioattivo a meno sottoposto ad un periodo di digiuno in anticipo. In secondo luogo, la scelta dell&#39;etichetta cun effetto le conclusioni si è in grado di disegnare su fenotipi metabolici. Ad esempio, la produzione di CO 2 radioattivo da D- [1- 14 C]-glucosio può riflettere ossidazione attraverso il ciclo dell&#39;acido citrico o lo shunt del fosfato pentoso, mentre radioattivo produzione di CO 2 da D- [6- 14 C]-glucosio riflette l&#39;ossidazione attraverso il ciclo dell&#39;acido citrico solo 12,15,16. Alimentazione mosche con un tracciante radiomarcato per un amminoacido essenziale 17,18 sarebbe una buona strategia per valutare ossidazione degli aminoacidi derivati ​​dalle proteine. Infine, i periodi di etichettatura lunghi con glucosio radioattivo anche aumentare la possibilità di costituzione di questo precursore in altre classi di molecole, come i trigliceridi 19 e aminoacidi come alanina, che interconverts facilmente con piruvato. Questo può essere valutata misurando la radioattività incorporata in queste diverse classi di molecole 6. rad Infatti, coorti separate di mosche possono essere alimentatisubstrati iolabeled nello stesso modo e poi utilizzato per esperimenti di volo POD o misurazione del radiomarcato che viene memorizzato e rimane in glicogeno e trigliceridi nel nutriti e digiunato condizioni 6, per esempio. Un&#39;altra strategia è quella di utilizzare i periodi di breve etichettatura che potrebbero rivelare l&#39;ossidazione delle sostanze nutrienti nella dieta radiomarcati se stessi e non le forme di questi nutrienti di stoccaggio. In terzo luogo, è anche possibile che due gruppi di mosche potrebbero avere tassi identici di 14 CO 2 produzione di un determinato periodo di tempo, ma velocità molto diverse inizialmente. Pertanto, variando la quantità di tempo che vola passare nel contenitore volo può essere un parametro importante per alterare nel valutare variazione fenotipica. Infine, questo protocollo prevede l&#39;utilizzo di un breve periodo di CO 2 anestesia quando mettendo linea nell&#39;apparato fly pod. È possibile che le anestesia CO 2 possono influenzare la funzione metabolica nel corso dell&#39;esperimento fly pod. Un supplente unAPPROCCIO è quello di utilizzare l&#39;anestesia azoto che non influenza il tasso metabolico 20. Come con qualsiasi tecnica che misura un sistema complesso come l&#39;ossidazione del combustibile e il ritmo metabolico, il metodo qui descritto ha limitazioni. Innanzitutto, è possibile che vola in diversi gruppi potrebbero consumare diverse quantità di cibo radiomarcato e quindi sarebbe entrare nella fase di raccolta CO 2 del test con diverse quantità di partenza di substrato. Questo può essere controllato per qualche misura eseguendo l&#39;esperimento con campioni di grandi dimensioni e alimentando mosche in massa. Per periodi brevi di etichettatura, mosche con simili coraggio di colore blu avranno consumato radiomarcato e può essere portato avanti alla porzione caccia dell&#39;esperimento. La quantità di prodotto radiomarcato rimanente in un gruppo di mosche può essere misurato al termine dell&#39;esperimento e in coorti separate di mosche dopo la fine del periodo di alimentazione e chase iniziale. In secondo luogo, i livelli di attività tragruppi di mosche in baccelli mosca possono essere diverse. Questo dovrà essere determinato sperimentalmente e presi in considerazione quando si interpretano i dati. Terzo, questa tecnica non misura CO 2 produzione totale, solo la produzione di uno specifico elemento nutritivo o il modulo di memorizzazione (s) di tale nutriente. Questo protocollo non è un sostituto per ma invece è complementare alle misure di VCO 2 perché fornisce informazioni diverse e supplementari. Il metodo qui descritto misure espirata, CO 2 radioattivo che è un prodotto di ossidazione di tracce di specifici substrati metabolici. Variando l&#39;etichetta utilizzata - glucosio, acidi grassi, o aminoacidi - si può progettare esperimenti sempre più sofisticati per valutare i contributi di diversi substrati per il metabolismo in diverse condizioni fisiologiche, come la fame e su diversi background genetico. Le future applicazioni di questa tecnica includono la misurazione di metabolism negli stadi larvali e pupe di sviluppo, due fasi del ciclo di vita Drosophila che sono caratterizzate da estremi rispettivamente stoccaggio nutrienti e ripartizione,.

Il lavoro nella organismo modello Drosophila melanogaster ha contribuito notevolmente alla comprensione dei principi genetici, processi di sviluppo, la crescita, l&#39;invecchiamento, il comportamento, l&#39;immunità e malattia umana 1,2. Una miriade di approcci biologici genetici e cellulari in Drosophila ha guidato i progressi in questi settori. Tuttavia, lo studio del metabolismo in drosofila ha sviluppato più lentamente, dovuto in gran parte alla difficoltà nel misurare parametri metabolici in un piccolo animale simile. L&#39;interesse ad utilizzare Drosophila come modello per lo studio di malattie umane come il diabete e per la comprensione dei contributi del metabolismo alla crescita e varie patologie ha spinto il settore a sviluppare e adattare le tecniche metabolici per questo organismo 3,4. metodi affidabili sono ora disponibili per la misurazione di una serie di parametri metabolici nel mosca della frutta. Ad esempio, è semplice valutare l&#39;assunzione di cibo <sup&gt; 5, i livelli di trigliceridi immagazzinati e glicogeno, così come i livelli circolanti emolinfa di glucosio e il principale zucchero circolante nel fly, trealosio, che è un disaccaride composto da due molecole di glucosio 4. Uso di traccianti metabolici ha consentito lo studio di assorbimento dei nutrienti dalla dieta e la conversione dei nutrienti assorbiti come il glucosio alle forme accumulo di glicogeno e trigliceridi 6. Tassi metabolici possono essere valutati nel frutto volare attraverso la misurazione del consumo di ossigeno 7,8 e anidride carbonica (CO 2) di produzione. Il ciclo dell&#39;acido citrico ossida unità a due atomi di carbonio che possono entrare nel ciclo come coenzima A (CoA), che è derivato dal metabolismo dei carboidrati alimentari e immagazzinati ed acidi grassi. Ogni giro del ciclo genera una molecola ciascuno di GTP (o ATP) e il donatore di elettroni FADH2, tre molecole di NADH e due molecole del prodotto di scarto CO 2. Produzione di CO 2 puòessere utilizzato per stimare il metabolismo basale. Produzione totale di CO 2 può essere quantificato in Drosophila attraverso l&#39;uso di respirometri disponibili in commercio o artigianali 9-10,11. La misurazione della produzione totale di CO 2, soprattutto quando accoppiato con la misurazione del consumo di O 2, fornisce informazioni preziose metabolismo energetico di tutto il corpo. Tuttavia, questa misura non identificare la sostanza nutritiva viene ossidato per l&#39;adenosina trifosfato (ATP) di produzione. Tre classi principali di nutrienti possono entrare nel ciclo dell&#39;acido citrico a seguito della conversione di acetil-CoA: carboidrati, acidi grassi e proteine. Glucosio-6-fosfato, derivato dal glucosio dietetico o glicogeno immagazzinato, può essere convertito in piruvato che è decarbossilata dal piruvato deidrogenasi per formare acetil CoA. Ripartizione degli acidi grassi derivati ​​dalla dieta o da trigliceridi memorizzati da rendimenti ß-ossidazione acetil-CoA che poi entra nel ciclo dell&#39;acido citrico. Finalmente, Una maggioranza di aminoacidi può entrare nel ciclo dell&#39;acido citrico seguente conversione piruvato, acetil CoA o acido citrico intermedi del ciclo come alfa-chetoglutarato. contributo specifico-Nutrient al metabolismo energetico durante condizioni basali e stimolate può essere monitorato mediante l&#39;uso di traccianti radioattivi. Il protocollo presentato qui è adattato per l&#39;uso in Drosophila da un protocollo utilizzato per valutare l&#39;ossidazione nelle cellule in coltura 12,13. In questo approccio, i moscerini della frutta sono alimentati 14 substrati C-radioattivo metaboliche (carboidrati, acidi grassi, o aminoacidi) nella dieta per un breve (ore) o lunghe (giorni) di impulso, inseguiti sul cibo senza etichetta, e quindi esposti a un camera contenente idrossido di potassio (KOH) carta da filtro saturi per intrappolare CO espirata 2 come bicarbonato. bicarbonato radioattivo può essere quantificato dal conteggio a scintillazione. Le differenze di radiomarcato-produzione di CO 2 tra esperimentoAl gruppi di linea possono riflettere uso di combustibili diversi per la produzione di ATP nel corso di un prolungato differenze veloci o intrinseche nel metabolismo di carburante tra genotipi, per esempio.

<table><tbody><tr><td>ACIDO PALMITICO, [1-14C]-, 50 &micro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUCOSIO, D-[6-14C]-, 50 &micro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>glucosio, D-[1-14C]-, 50&micro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di Drosophila, strette, polistirene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in polipropilene a fondo tondo, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Rete, nylon nitex, 120 & micro; m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di scintillazione in vetro borosilicato da 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Tappo superiore per pallone con foro decentrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Pozzetto centrale in polipropilene</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B carta da filtro in microfibra di vetro, cerchio, diametro</td> <td>2,1 cmFisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>Fiale a scintillazione da 6 ml con tappi Push-On/Twist-Off National</td><td>Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

misura della produzione di anidride carbonica da marcata radioattivamente substrati in<em&gt; drosophila melanogaster</em

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

Il potere della genetica Drosophila viene sempre applicato a problemi di segnalazione ormonale e il metabolismo e allo sviluppo di modelli di malattie umane in questo organismo. metodi sensibili per la misurazione di parametri quali i tassi metabolici sono necessari per guidare la comprensione della fisiologia e malattie in piccoli animali come la mosca della frutta. Il metodo descritto qui valuta l&#39;ossidazione del combustibile in un piccolo numero di mosche adulte alimentati alimenti contenenti tracce di 14 substrati C-etichettato come il glucosio o acidi grassi. Dopo il periodo di alimentazione ed eventuali manipolazioni sperimentali aggiuntivi, mosche vengono trasferiti tubi corti ricoperte con rete, che vengono poi inseriti in flaconcini di vetro contenenti carta da filtro KOH-saturo che trappole esalato, radiomarcato CO 2 generato dalla ossidazione di substrati radiomarcati come bicarbonato di potassio, KHCO 3. Questo bicarbonato radiomarcato è misurato mediante conteggio a scintillazione. Questo è aqapproccio quantitative, riproducibile e semplice per lo studio dell&#39;ossidazione del carburante. L&#39;utilizzo del glucosio radioattivo, acidi grassi, o aminoacidi permette di determinare il contributo di queste diverse fonti di combustibile per il metabolismo energetico, in condizioni diverse, come l&#39;alimentazione e il digiuno e in diversi background genetico. Ciò integra altri approcci utilizzati per misurare in vivo il metabolismo energetico e dovrebbe favorire la comprensione della regolazione metabolica.

La quantità di esalato e intrappolati CO 2 radiomarcato che viene prodotto dal metabolismo di un substrato radioattivo dovrebbe correlare con il numero di mosche in un baccello mosca così come la quantità di tempo gli animali trascorrono nell&#39;apparato raccolta CO 2. Per verificare ciò, le mosche che sono stati a digiuno per 18 ore sono stati alimentati con acido palmitico radioattivo (0,02 pCi / cibo ml) per 2 ore e poi testato per radioattivo produzione di CO 2 in gruppi di 12 o 25 animali per 3 o 6 incubazione hr. La quantità di CO 2 prodotta da 25 mosche era quasi il doppio della quantità prodotta da 12 mosche, e l&#39;importo per ogni gruppo ha raddoppiato quando il tempo di incubazione è stata aumentata da 3 ore a 6 ore (Figura 2A). Il pmol 14 CO 2 / fly / ora era quasi equivalente in ciascun gruppo. Il digiuno stimola la ripartizione degli acidi grassi per ß Ossidazione; quindi produzione di CO 2 da ossidazione degli acidi grassi dovrebbe essere elevata in animali a digiuno rispetto agli animali alimentati. Per determinare se questo fosse il caso, a 18 ore a digiuno mosche sono stati alimentati con acido palmitico radioattivo per 2 ore. Seguendo questo impulso alimentazione breve, mosche sono stati divisi in due gruppi e trasferiti al cibo fly non marcato o 1% agar per 3 ore e poi trasferite per volare cialde per 2 ore. In due esperimenti separati, le mosche inseguito su agar prodotta CO significativamente più radioattivo 2 rispetto alle mosche inseguito sul cibo (Figura 2B), indicando che l&#39;ossidazione ß è stata aumentata negli animali a digiuno. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;apparecchio per la raccolta espirato radiomarcata CO 2. Mosche che hanno consumato substrati metabolici radioattivi sonoinseriti in un &quot;fly pod&quot; (FP), un tubo di cutoff centrifuga ridotta con rete (M). Il pod mosca viene inserito in un 20 ml di vetro scintillazione fiala e ricoperto con un tappo superiore in gomma (S) contenente un foro eccentrico, attraverso il quale è posto un pozzetto centrale (CW) che contiene carta da filtro GF / B saturato con 100 microlitri 5% KOH. Espirato CO 2 reagisce con il KOH ed è intrappolato sulla carta filtro come bicarbonato. Intrappolato, CO 2 radioattivo può essere quantificata mediante conteggio a scintillazione della carta da filtro saturo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> Figura 2. 14 CO 2 Correlates di produzione con il tempo e il numero di mosche in unFly Pod e risponde a Fed e digiunato condizioni. (A) La quantità di 14 CO 2 prodotta in mosche alimentato palmitato radiomarcato è correlato al numero di mosche testati (n = 12 (bar aperto) o 25 (bar chiusi)) e il tempo trascorso in un baccello mosca (3 o 6 ore ). Su una base per-fly, mosche prodotte 0.99, 1.13, 1.10 e 1.01 pmol 14 CO 2 / h (dati elencati nello stesso ordine da sinistra a destra come dati del grafico). (B) le mosche che sono stati cacciati su agar ossidata più radioattivo palmitato di mosche che sono stati cacciati sul cibo. I dati provengono da due esperimenti e sono segnalati come mezzi deviazione standard, n = 16 - 17 mosche / gruppo (esperimento 1); n = 10 mosche / gruppo (esperimento 2). * P = 0.017, test t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Questo articolo descrive un metodo per la misurazione dell'ossidazione del carburante in Drosophila melanogaster in cui tracce di specifici substrati metabolici radiomarcati vengono somministrati alle mosche. La CO2 radiomarcata espirata, prodotta dall'ossidazione del combustibile, viene raccolta e misurata.

Misura della produzione di anidride carbonica da marcata radioattivamente Substrati in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è misurare l'anidride carbonica prodotta da moscerini della frutta integri, utilizzando substrati radiomarcati come l'acido palmitico o il glucosio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali per i ricercatori di Drosophila, ad esempio se una determinata mutazione possa influenzare il metabolismo energetico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente misurazioni quantitative, sensibili e riproducibili dell'ossidazione dei combustibili in piccoli numeri di moscerini della frutta.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di assemblaggio della capsula per moscerini richiedono una rapida manipolazione di piccole parti, necessaria per garantire la corretta costruzione dell'apparato sperimentale prima che le mosche si riprendano dall'anestesia. Il carbonio-14 è un emettitore beta a bassa energia e ha un breve raggio d'azione nell'aria, ma è comunque necessario prestare attenzione per evitare lo spargimento di molecole radioattive o un'eventuale ingestione accidentale da parte dell'operatore. Mescolare da uno a due microcurie di substrato radioattivo con 15 microlitri di colorante alimentare blu FD&C Numero Uno e acqua, fino a ottenere un volume totale di 25 microlitri.Trasferire con la pipetta tutta la miscela di substrato radioattivo e colorante blu nella parte inferiore di una provetta vuota per il cibo delle mosche. Poiché le provette per il cibo delle mosche si rovesciano facilmente, assicurarsi di collocarle all'interno di un contenitore che ne impedisca il rovesciamento. Riscaldare il cibo standard per mosche in un forno a microonde fino a quando il cibo si è appena liquefatto.Da 15 a 20 secondi a potenza elevata sono generalmente sufficienti per un vial contenente 10 millilitri di cibo. Aggiungere 975 microlitri di cibo fuso alla miscela di substrato radiomarcato e colorante blu, quindi agitare rapidamente controllando l'uniformità del colore blu per assicurare un mescolamento completo. Le punte dei pipetti potrebbero dover essere tagliate con le forbici per allargare l'estremità stretta, consentendo così un prelievo accurato del cibo fuso viscoso.Lasciare raffreddare il cibo e solidificare completamente a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Per anestetizzare le mosche adulte si utilizza un apparato anestetizzante a biossido di carbonio costituito da polietilene poroso fuso su una base in acrilico e collegato a una bombola di biossido di carbonio dotata di regolatore di pressione. Far fluire il biossido di carbonio nell'apparato anestetizzante a cinque litri al minuto.Trasferire le mosche anestetizzate in provette contenenti cibo colorato di blu con traccianti radioattivi. Chiudere ogni provetta con un tappo di schiuma e posizionarla in orizzontale fino al risveglio delle mosche. Trasferire le provette in un contenitore acrilico con coperchio.Per un'alimentazione a breve termine, privare le mosche del cibo per 18-24 ore prima del loro trasferimento sul cibo radiomarcato, in modo da garantire che mangino durante la fase di alimentazione della durata di due o tre ore. Per un'alimentazione a lungo termine della durata di cinque a sette giorni, non è necessario privare le mosche del cibo, ma lo sperimentatore deve monitorare il contenuto di acqua del cibo radiomarcato nei flaconi, utilizzando un ago e una siringa per aggiungere acqua ai flaconi con cibo secco. Al termine del periodo di alimentazione con il substrato radiomarcato, trasferire le mosche su cibo non marcato, facendole cadere in un nuovo flacone.Un periodo iniziale di attesa di due a quattro ore permette alle mosche di rimuovere le particelle di cibo radiomarcate dal loro cuticolo e consente la digestione del cibo radiomarcato rimasto nell'intestino. Monitorare il transito del cibo attraverso l'intestino ispezionando visivamente le mosche alla ricerca di addomi di colore blu. Successivamente, trasferire le mosche su diversi tipi di cibo o a diverse temperature ambienti.La durata di questo periodo di caccia varierà a seconda dell'esperimento in corso. Prima di preparare l'apparato per la raccolta di anidride carbonica, assemblare i materiali necessari per costruire i contenitori per moscerini, ovvero tubi con tappo in rete che conterranno moscerini marcati con glucosio C-14 o acido palmitico C-14, e che rimarranno aperti all'atmosfera. Fissare una lametta con un emostatico, riscaldarla nella fiamma di un becco Bunsen fino a quando diventa incandescente, e utilizzare la lametta riscaldata per tagliare la parte superiore di 50 millimetri di tubi in polipropilene di 12 millimetri per 75 millimetri, ottenendo tubi di 25 millimetri di lunghezza con fondo arrotondato.Preparare quadrati di rete in nylon di 35 millimetri per 35 millimetri e 130 micron di spessore. Tagliare diversi pezzi di nastro trasparente lunghi da uno e mezzo a due pollici. Successivamente, assemblare i materiali per l'apparato di raccolta della anidride carbonica.Per ogni contenitore di moscerini, assemblare un vial di vetro da 20 millilitri, un tappo di gomma con un foro eccentrico, una camera centrale e della carta filtrante in microfibra di vetro grado GFB. Inserire la camera centrale attraverso il foro nel tappo superiore. Preparare idrossido di potassio al 5% al momento dell'uso.Subito prima di anestetizzare le mosche per il trasferimento nel contenitore per mosche, piegare e posizionare il filtro circolare in carta GFB nel pozzetto centrale, facendolo passare attraverso il foro del tappo di gomma, e saturarlo con 100 microlitri di idrossido di potassio al 5%. Il trasferimento delle mosche anestetizzate nei contenitori per mosche è il passaggio più difficile di questo protocollo. Per garantire il successo, tenere tutti i materiali necessari a portata di mano e lavorare rapidamente per limitare l'esposizione delle mosche all'anidride carbonica e per evitare che si risveglino e scappino prima che la rete sia stata fissata saldamente al tubo.Dopo l'incubazione su terreni non marcati, anestetizzare le mosche con anidride carbonica. Trasferire le mosche anestetizzate nel tubo di polipropilene tagliato, chiuderlo con una rete di nylon e fissare la rete al tubo utilizzando nastro trasparente. Per un determinato esperimento, in ciascun contenitore per mosche deve essere utilizzato un numero uguale di mosche.Da 10 a 20 moscerini per contenitore producono quantità sufficienti di anidride carbonica radiomarcata per essere misurate mediante conteggio con scintillazione. Trasferire il contenitore per moscerini nel vial di vetro da 20 millilitri. Chiudere il vial di vetro con un tappo a chiusura ermetica rivestito di gomma, contenente al centro un pozzetto con carta filtro GFB satura di idrossido di potassio.Piegare la parte larga del tappo rivestito di gomma oltre il bordo del vial in vetro per scintillazione. Posizionare i vial in vetro contenenti le mosche in un contenitore acrilico con coperchio e incubare per periodi di tempo variabili. Al termine dell'incubazione, togliere il tappo dal vial in vetro e trasferire la carta filtro GFB saturata di idrossido di potassio in un vial di plastica per scintillazione da sei millilitri contenente 4 millilitri di cocktail per scintillazione.Preparare provette per scintillazione aggiuntive, una contenente carta da filtro GFB non utilizzata da usare come fondo, e una o due provette contenenti da 0,1 a 0,5 microcurie di substrato marcati radioattivamente per determinare i conteggi al minuto per microcurie. Mediante un contatore a scintillazione, misurare i conteggi al minuto per ogni campione secondo il protocollo del produttore. Successivamente, calcolare la produzione totale di anidride carbonica come descritto nel testo del protocollo.I moscerini sono stati sottoposti a digiuno per 18 ore, nutriti con acido palmitico marcato radioattivamente per due ore e quindi sottoposti a test per la produzione di anidride carbonica marcata radioattivamente, in gruppi di 12 o 25 animali, per incubazioni della durata di tre o sei ore. Come mostrato in questo grafico, la quantità di anidride carbonica prodotta da 25 moscerini era quasi il doppio rispetto a quella prodotta da 12 moscerini, e la quantità prodotta da ciascun gruppo raddoppiava quando il tempo di incubazione aumentava da tre a sei ore. I picomoli di anidride carbonica marcata radioattivamente per moscerino per ora erano quasi equivalenti in ciascun gruppo.Dato che il digiuno stimola la degradazione degli acidi grassi tramite ossidazione beta, la produzione di anidride carbonica derivante dall'ossidazione degli acidi grassi dovrebbe essere più elevata negli animali a digiuno rispetto a quelli alimentati. Per verificare questa ipotesi, moscerini a digiuno da 18 ore sono stati nutriti con acido palmitico radiomarcato per due ore, suddivisi in due gruppi e trasferiti su cibo per moscerini non marcato o su agar al 1%. In due esperimenti separati, i moscerini coltivati su agar hanno prodotto una quantità significativamente maggiore di anidride carbonica radiomarcata rispetto ai moscerini coltivati su cibo, indicando un aumento dell'ossidazione beta negli animali a digiuno.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi complementari come la misurazione della produzione totale di anidride carbonica e del consumo totale di ossigeno, e il calcolo del rapporto di scambio respiratorio, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio riguardo alla fonte di combustibile preferita. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare questo protocollo per determinare l'effetto di una data mutazione o manipolazione sperimentale sulla capacità di utilizzare un particolare combustibile come fonte di energia. Non dimenticare che lavorare con radioattività può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come indossare guanti, camici da laboratorio e occhiali protettivi, e utilizzare un adeguato schermaggio durante l'esecuzione di questa procedura.

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