Formare giganti di dimensioni Polymersomes Uso reidratazione Gel-assistita

L'obiettivo generale di questo metodo di reidratazione assistita da gel è quello di formare in modo robusto vescicole polimeriche giganti unilamellari intatte in cui la distribuzione delle dimensioni delle vescicole possa essere facilmente controllata. Questo metodo offre una solida alternativa per la formazione di vescicole polimeriche, che possono essere utilizzate per studiare le proprietà fisiche della membrana e quindi integrare tali vescicole in applicazioni di bioingegneria. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di produrre facilmente centinaia di vescicole polimeriche giganti intatte molto più rapidamente e in modo meno laborioso rispetto alle tecniche tradizionali.

Quindi, l'idea è nata quando abbiamo appreso della tecnica di reidratazione assistita da gel per formare vescicole lipidiche giganti. I nostri metodi attuali per formare polimerisomi giganti, tuttavia, sono impegnativi e spesso a bassa resa, quindi abbiamo deciso di utilizzare questa metodologia come approccio alternativo. Iniziare la preparazione della soluzione polimerica facendo roteare cinque milligrammi di copolimero diblocco PEO-PBD in un millilitro di cloroformio in una fiala di vetro fino a completa dissoluzione.

Aggiungere una soluzione di cinque milligrammi per millilitro di polimero e cloroformio e una soluzione di un milligrammo per millilitro di lipidi marcati in fluorescenza e cloroformio in una nuova fiala fino ad ottenere una concentrazione finale del 99,5% di polimero molare e dello 0,5% di lipidi. Per ridurre al minimo l'evaporazione, trasferire la soluzione polimerica in una fiala ermetica con un coperchio resistente al cloroformio e conservarla a 20 gradi Celsius per un uso successivo. Per iniziare la preparazione del film di agarosio, aggiungere 50 millilitri di acqua e 0,5 grammi di agarosio standard a un pallone di Erlenmeyer da 250 millilitri.

Far bollire per un minuto usando un microonde. Prima di continuare, raffreddare la soluzione di agarosio a una temperatura compresa tra 65 e 75 gradi Celsius per evitare una scarsa aderenza o la formazione di grumi. Quindi, tagliare l'estremità di un puntale per pipetta da 1000 microlitri e utilizzarlo per pipettare 300 microlitri di soluzione di agarosio su un vetrino di vetro quadrato da 25 millilitri.

Indossando i guanti, afferrare il bordo del vetrino coprioggetto e distribuire uniformemente l'agarosio su tutta la superficie utilizzando il bordo lungo di un altro puntale per pipetta da 1000 microlitri. Posizionare il vetrino coprioggetto con l'agarosio rivolto verso l'alto sul parafilm e incubarlo a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Continuare pipettando 30 microlitri della soluzione polimerica precedentemente preparata sul vetrino coprioggetto rivestito con film di agarosio.

Tenere il bordo del vetrino coprioggetto con le dita guantate e stendere la soluzione polimerica sulla pellicola di agarosio con un movimento circolare utilizzando il bordo lungo di un ago calibro 18. Terminare posizionando il vetrino coprioggetto con il lato in polimero rivolto verso l'alto in una capsula di Petri di plastica all'interno di un essiccatore sottovuoto. Evacuare l'essiccatore per almeno un'ora per rimuovere eventuali residui di solvente.

Per formare i polimerisomi, far aderire prima un pozzetto di copertura al lato polimerico del vetrino coprioggetti rivestito premendo delicatamente fino a formare una tenuta ermetica. Quindi, aggiungere da 200 a 500 microlitri di soluzione reidratante nella camera. Quindi, posiziona una salvietta da laboratorio arrotolata bagnata lungo il bordo interno di una capsula di Petri di vetro per formare una camera di umidità.

Posizionare bene il vetrino coprioggetto con il coperchio aderente nel piatto e coprirlo con un coperchio. Coprire la capsula di Petri con un foglio di alluminio per ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto e poi posizionarla su una piastra calda a 40 gradi Celsius per almeno 30 minuti per completare la formazione dei polimeri. Per iniziare il processo di imaging FRAP, posizionare il vetrino coprioggetto con il coperchio aderente sul tavolino di un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un condensatore regolabile.

Quindi, selezionare un set di filtri in base al lipide fluorescente utilizzato e visualizzare i polimerisomi sulla superficie superiore del vetrino coprioggetti utilizzando un obiettivo a olio 100X. Per caratterizzare la fluidità della membrana utilizzando FRAP, concentrarsi prima su un polimeroma, quindi chiudere il condensatore del microscopio a una piccola apertura e assicurarsi che i bordi del polimero si trovino all'interno del campo dell'immagine. Successivamente, aumentare l'esposizione della fotocamera, rimuovere tutti i filtri a densità neutra e lasciare che la regione di interesse schiarisca le foto per 30-60 secondi.

Infine, spegnere la lampada e aprire completamente il condensatore. Ridurre l'esposizione alle impostazioni iniziali e acquisire immagini ogni 30 secondi per tre minuti. Aprire il software di analisi delle immagini sul computer del microscopio e caricare le immagini acquisite dei polimerisomi.

Imposta la scala per la misurazione aprendo il menu a discesa Analizza e selezionando l'opzione Imposta scala. Immettere le unità di calibrazione appropriate per la distanza in pixel, la distanza nota e l'unità di lunghezza, quindi selezionare OK. Quindi, utilizzare la casella degli strumenti linea e tracciare una linea che attraversa il diametro di un polimero selezionato.

Misurare il diametro del polimersoma aprendo il menu a discesa Analizza e selezionando Misura. Per facilitare l'analisi, utilizzare il controllo più D per stampare la linea di misurazione sull'immagine prima di passare al polimero successivo. Continuare a misurare i polimerisomi utilizzando la procedura sopra descritta e aggiungendo ogni misurazione alla finestra dei dati fino al completamento.

Infine, salva i dati facendo clic su File e salva con nome.Fare clic su Salva nella finestra che si apre, quindi aprire il file dei risultati come foglio di calcolo per analizzare i dati. I polimerisomi formati da film polimerici di PEO-PBD reidratati con vari tamponi sono stati sottoposti a imaging mediante microscopia a fluorescenza. Le immagini mostrano che i polimerisomi sono di dimensioni non omogenee nelle diverse condizioni di reidratazione, con un diametro tipicamente inferiore a 10 micrometri.

Le immagini di epifluorescenza dei polimerisomi formati in acqua a diverse temperature mostrano che all'aumentare della temperatura di reidratazione, si formano polimerisomi più grandi. Sono stati calcolati i diametri medi per più di 100 polimerisomi formati in acqua a diverse temperature di reidratazione. A 24 gradi Celsius, il diametro medio era di 2,93 micrometri, aumentando fino a 14,04 micrometri a 70 gradi Celsius.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere sempre i polimerisomi in soluzione. Assicurarsi che il pozzetto del coperchio sia fissato saldamente al vetrino coprioggetto per evitare perdite della soluzione reidratante e l'essiccazione dei polimerisomi.

Seguendo questa procedura, metodi come la microscopia elettronica possono essere utilizzati per comprendere ulteriori proprietà strutturali dei polimerisomi. Questa tecnica apre la strada alla ricerca in biologia sintetica e bioingegneria per esplorare i polimerisomi come alternativa robusta e chimicamente personalizzabile alle membrane lipidiche per la ricerca e l'interfaccia abiotico-biotica, la ricerca sulla somministrazione di farmaci e i sistemi di protocellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come formare in modo robusto polimerisomi giganti utilizzando la reidratazione assistita da gel, regolare le dimensioni complessive delle vescicole e caratterizzare la loro integrità di membrana.

Non dimenticare che lavorare con il cloroformio o l'agarosio e gli aghi può essere pericoloso. Prestare molta attenzione durante l'esecuzione di queste procedure. Prendi precauzioni come lavorare in una cappa aspirante e usa sempre occhiali e guanti.