Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

L'obiettivo generale di questa tecnica di microiniezione è quello di generare spinarelli transgenici e modificati con genoma per testare la funzione del gene e del potenziatore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella genetica dello sviluppo e dell'evoluzione, come ad esempio il modo in cui i geni e i potenziatori funzionano per generare il modello corporeo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che genera in modo efficiente pesci transgenici per l'analisi genetica funzionale.

Dopo aver preparato due plasmidi e l'mRNA secondo il protocollo di testo, estrarre almeno quattro aghi per micropipette dal vetro borosilicato. Conservare verticalmente in un barattolo capillare con le estremità affilate rivolte verso il basso. Per fecondare fino a cento uova di spinarello, aggiungi 50 microlitri di soluzione di sperma e usa la punta di una pipetta per mescolare delicatamente per assicurarti che tutti gli ovuli siano fecondati.

Mentre si lavora sul ghiaccio, riempire nuovamente almeno tre aghi pipettando 0,5 microlitri di soluzione iniettabile nell'estremità smussata dell'ago e lasciarlo scolare. Nel frattempo, accendere la luce di transilluminazione per il microscopio da dissezione e posizionare una lastra di vetro di 13 centimetri quadrati sulla base della luce del microscopio con una lama per gesso da 15 centimetri sopra la lastra di vetro. Orientare la sega perpendicolarmente all'apparato di iniezione con le rientranze rivolte verso il portaago, quindi accendere la scatola di controllo e assicurarsi che la pressione sia impostata a circa 175 kilopascal.

Impostare la durata dell'iniezione su 180 millisecondi. Quindi allentare il supporto dell'ago, quindi inserire un ago pieno nel supporto fino a quando non si avverte la resistenza del supporto in gomma e serrare il supporto dell'ago fino a quando non è stretto con le dita. Quindi regolare l'angolo dell'ago a circa 45 gradi.

Utilizzare i controlli del micromanipolatore per regolare l'ago in modo che l'estremità sia centrata nel campo visivo. Ingrandisci fino a un ingrandimento di circa 40x e concentrati sulla punta dell'ago, che non deve toccare il vetro sottostante. Con la pinza da orologiaio, afferrare la punta dell'ago a due o tre pinze dall'estremità e rompere delicatamente la punta con un angolo di 60 gradi.

Quindi premere più volte il pedale dell'iniezione per verificare se l'ago è rotto. Dopo alcuni tocchi, minuscole goccioline rosse dovrebbero iniziare a fuoriuscire dall'estremità. Utilizzare una pipetta di trasferimento usa e getta per posizionare alcune gocce di acqua di spinarello sulla lastra di vetro.

Abbassa delicatamente l'ago nell'acqua, quindi aumenta la contropressione fino a quando un debole flusso di liquido rosa non fuoriesce dall'ago. Ritrarre l'ago il più possibile in modo che non venga danneggiato durante la preparazione degli embrioni. Circa 25 minuti dopo la fecondazione, utilizzare due puntali per pipette da 10 microlitri per rimuovere da cinque a 10 embrioni dalla frizione e trasferirli sulla lastra di vetro.

Con le punte della pipetta, separare delicatamente gli embrioni in singole rientranze della lama della sega facendo attenzione a non forare gli embrioni. Successivamente, con una pipetta di trasferimento, aggiungere abbastanza acqua di spinarello per coprire gli embrioni. Quindi, dopo tre o cinque secondi, rimuovere la maggior parte dell'acqua lasciando solo un piccolo volume che copre ogni embrione.

Iniziando dall'embrione più lontano, fai scorrere la lastra di vetro e ingrandisci l'embrione in modo che riempia circa il 25% del campo visivo. Abbassare l'ago nel campo visivo, quindi utilizzare una punta di pipetta da 10 microlitri per ruotare delicatamente l'embrione per identificare il blastomero, una protuberanza granulosa, leggermente gialla e rialzata di citoplasma sulla parte superiore del tuorlo. Ruotare l'embrione in modo che il blastomero sia direttamente perpendicolare all'estremità dell'ago.

Abbassare l'ago esercitando una pressione lenta e uniforme per perforare il corion e inserire l'ago nel citoplasma senza spingerlo attraverso il tuorlo sottostante. Premere il pedale tre o quattro volte per iniettare in modo che un bolo rosso con bordi leggermente diffusi riempia circa 1/8 del diametro del citoplasma. Avere un ago affilato perpendicolare al corion faciliterà questo passaggio.

Limitare la quantità di acqua aggiunta aiuterà a mantenere il corion morbido. E infine, il targeting del citoplasma aumenterà la probabilità di ottenere un animale transgenico. Utilizzare i comandi del micromanipolatore per ritrarre l'ago e, con la punta della pipetta da 10 microlitri, tenere premuto l'embrione se si attacca all'ago.

Dopo aver ritirato l'ago, far scorrere la lastra di vetro per allineare l'embrione successivo con l'ago e ripetere l'iniezione. Quando tutti gli embrioni sono stati iniettati, utilizzare la pipetta di trasferimento con l'estremità tagliata per aggiungere acqua alla piastra. Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere gli embrioni e metterli in una capsula di Petri da 150 millimetri riempita con acqua spinarello.

Incubare gli embrioni a 18 gradi Celsius. Un giorno dopo l'iniezione, versare delicatamente l'acqua dello spinarello e sostituirla con acqua fresca. Verificare la presenza di embrioni morti o malformati e rimuoverli per evitare contaminazioni.

Come illustrato qui, per i transgeni che hanno attività di potenziamento, l'iniezione di successo si traduce in un'espressione cellulare specifica del transgene. Ad esempio, nelle pinne pettorali e mediane e nella notocorda. I pesci iniettati possono quindi essere incrociati per produrre linee stabili come questa linea stabile posteriore che guida l'espressione della GFP nel cuore embrionale a quattro giorni dalla fecondazione.

Per un potenziatore attivo, dal 40 al 50% degli embrioni mostrerà un'espressione transgenica tessuto-specifica, ad esempio nelle pinne mediane e pettorali. Fino al 100% dei pesci F0 positivi alla GFP che esprimono transgeni plasmidici toll two producono prole transgenica. Tuttavia, la percentuale di prole portatrice del transgene varia ampiamente da meno dell'uno per cento al 72 per cento.

Salvare solo gli embrioni iniettati positivi alla GFP generalmente aumenta l'efficienza della trasmissione. Solo fino al 10% degli embrioni spinarelli F0 iniettati mostra fluorescenza nei tessuti previsti. Inoltre, la velocità di trasmissione dei dorsi è inferiore a quella dei costrutti plasmidici.

Solo fino al 14% degli spinarelli schermati trasmette il retro. In contrasto con la bassa efficienza della transgenesi posteriore, dal 70 al 100% dei pesci iniettati con gli artigli presenta lesioni a mosaico. Qui, un amplicone PCR non tagliato in ciascuno degli embrioni iniettati indica che alcune cellule in ciascun embrione portano lesioni nel locus bersaglio.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poco più di un'ora per una covata di 100 embrioni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che sono necessarie pratica e pazienza per migliorare la tecnica e la sopravvivenza degli embrioni. Seguendo questa procedura, altri metodi come la microscopia confocale possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande sui modelli dettagliati di espressione dell'enhancer.

Inoltre, i pesci modificati con il genoma possono essere allevati in incrocio per studiare i fenotipi risultanti da mutazioni indotte. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della genetica evolutiva e dello sviluppo per studiare la regolazione genica e la funzione negli spinarelli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare embrioni spinarello per la transgenesi e l'editing del genoma.