Name: Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Impara la microiniezione per transgenesi e genome editing nel pesce stickleback. Questo metodo consente di generare organismi geneticamente modificati per analizzare la funzione di geni ed enhancer in biologia evolutiva e dello sviluppo.

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Questo lavoro è stato finanziato in parte dal NIH R01 # DE021475 (CTM), un NIH predoctoral formazione di Grant 5T32GM007127 (PAE), e un Graduate Research Fellowship NSF (NAE). Ringraziamo Kevin Schwalbach per l&#39;esecuzione di BAC recombineering e iniezioni, Nick Donde per la generazione di dati di sequenziamento Sanger CRISPR, e Katherine Lipari per il feedback utile sul protocollo di iniezione.

<ol><li>Bell, M. A., Foster, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+MA+%22The+Evolutionary+Biology+of+the+Threespine+Stickleback%22">The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback</a>. , Oxford University Press. (1994).</li>
<li>Jones, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+basis+of+adaptive+evolution+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks.</a> Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).</li>
<li>Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+assembly+improvement+and+mapping+convergently+evolved+skeletal+traits+in+sticklebacks+with+Genotyping-by-Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing.</a> G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).</li>
<li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+skeletal+evolution+in+sticklebacks+is+controlled+by+additive+and+clustered+quantitative+trait+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci.</a> Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).</li>
<li>Shapiro, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+developmental+basis+of+evolutionary+pelvic+reduction+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks.</a> Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).</li>
<li>Colosimo, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+parallel+evolution+in+sticklebacks+by+repeated+fixation+of+Ectodysplasin+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles.</a> Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+regulatory+change+underlying+altered+expression+and+Wnt+response+of+the+stickleback+armor+plates+gene+EDA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA.</a> eLife. , e05290(2015).</li>
<li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li>
<li>Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+developmentally+temporal+quantitative+trait+loci+underlie+convergent+evolution+of+increased+branchial+bone+length+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks.</a> Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822(2014).</li>
<li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> EvoDevo. 5 (1), (2014).</li>
<li>Ellis, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+and+genetic+mechanisms+underlie+convergently+evolved+tooth+gain+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks.</a> Development. 142, 2442-2451 (2015).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+linkage+disequilibrium+and+parallel+adaptive+divergence+across+threespine+stickleback+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+parallel+adaptation+in+threespine+stickleback+using+sequenced+RAD+tags%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags.</a> PLoS Genet. 6 (2), e1000862(2010).</li>
<li>McKinnon, J. S., Rundle, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+in+nature%3A+the+threespine+stickleback+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Speciation in nature: the threespine stickleback model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).</li>
<li>Shao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+feedback+effects+on+LH+and+FSH%2C+and+photoperiodic+control+of+reproduction+in+male+three-spined+sticklebacks%2C+Gasterosteus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).</li>
<li>Katsiadaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-spined+stickleback%3A+an+emerging+model+in+environmental+endocrine+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Int.+J.+Environ.+Physiol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption.</a> Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).</li>
<li>Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+local+immunological+adaptation+of+two+stickleback+ecotypes+by+experimental+infection+and+transcriptome-wide+digital+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis.</a> Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).</li>
<li>Barber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticklebacks+as+model+hosts+in+ecological+and+evolutionary+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology.</a> Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).</li>
<li>Erickson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+190+base+pair%2C+TGF-%CE%B2+responsive+tooth+and+fin+enhancer+is+required+for+stickleback+Bmp6+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression.</a> Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).</li>
<li>Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+microinjection+protocol+for+making+transgenic+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-Devo+and+an+expanding+evolutionary+synthesis%3A+a+genetic+theory+of+morphological+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution.</a> Cell. 134 (1), 25-36 (2008).</li>
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<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
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<li>Talbot, J. C., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+CRISPR+pipeline+to+reliably+generate+zebrafish+frameshifting+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles.</a> Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transposon-Mediated+Gene+Trap+Approach+Identifies+Developmentally+Regulated+Genes+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
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<li>Dale, R. M., Topczewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+evolutionarily+conserved+regulatory+element+of+the+zebrafish+col2a1a%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a.</a> Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).</li>
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<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+Gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Iniettano embrioni stickleback una cella per transgenesi o la modifica del genoma presenta tre sfide principali. In primo luogo, relativamente agli embrioni di zebrafish, lo spinarello embrionali corion è dura e spesso rompere gli aghi. Questo problema può essere superato parzialmente usando micropipette di vetro più spesse e più forti e iniettando perpendicolare al corion (vedi protocollo, figura 2). Assicurare che il meno acqua possibile si aggiunge agli embrioni (quanto basta per causare il corion a ...

Una componente fondamentale di capire come la biodiversità si pone è la determinazione delle basi genetiche e di sviluppo dei cambiamenti fenotipici evoluti in natura. Il pesce Spinarello, Gasterosteus aculeatus, è emerso come un ottimo modello per studiare le basi genetiche dell&#39;evoluzione. Spinarelli hanno subito molti cambiamenti evolutivi adattativi come i pesci marini hanno colonizzato gli ambienti di acqua dolce innumerevoli intorno nell&#39;emisfero settentrionale, con conseguente morfologica drammatico, fisiologici, e cambiamenti comportamentali 1. I genomi di individui di ventuno popolazioni stickleback sono stati sequenziati e assemblati, e una mappa linkage alta densità è stato generato per migliorare ulteriormente il gruppo 2,3. Esperimenti di mappatura genetici hanno identificato regioni genomiche sottostante fenotipi evoluti 4 - 6, e in alcuni casi, i ruoli funzionali di geni specifici sono stati testati 7,8. Un certo numero di regioni genomiche sottostanti cambiamenti morfologici sono stati identificati con promettenti geni candidati, ma questi candidati non sono ancora stati testati funzionalmente 9 - 12. Inoltre, spinarelli sono modelli comuni per gli studi di genetica delle popolazioni / genomica 13,14, speciazione 15, il comportamento 1, endocrinologia 16, ecotossicologia 17, l&#39;immunologia 18 e parassitologia 19. Futuri studi in ciascuno di questi settori beneficeranno della possibilità di eseguire manipolazioni genetiche funzionali in spinarelli. Oltre a manipolare le sequenze codificanti, i ruoli dei geni candidati possono essere valutate studiando le loro sequenze -regulatory cis e funzionalmente crescente, decrescente o eliminando espressione del gene candidato. Microiniezione e transgenesi metodi in spinarelli sono ben stabiliti 7,8,20 e sono stati inizialmente sviluppati utilizzando un meganuclease-mediataMetodo 21 descritto per primo nel Medaka 22. Il metodo microiniezione modificato presentato qui è stato ottimizzato sia per la transgenesi Tol2-mediata e recentemente sviluppato reagenti di modifica del genoma tra Talens e CRISPRs. Modifiche a cis -regulatory elementi sono pensati per essere critico per l&#39;evoluzione morfologica, come cis -regulatory cambiamenti possono evitare le conseguenze negative pleiotropici di codifica mutazioni 23. Pertanto, prova e il confronto putative sequenze -regulatory cis è diventato un obiettivo centrale di un numero crescente di studi evolutivi. Inoltre, la maggior parte delle varianti di malattie umane sono varianti normative 24,25 e sistemi modello vertebrati sono dolorosamente necessari per studiare cis Funzione di un elemento -regulatory e la logica. I pesci che fertilizzare i loro embrioni esternamente in gran numero offrono potenti sistemi di vertebrati a studiare -Regolamento cis. Il sistema di trasposoni Tol2, in cui commDNA gn per essere integrato nel genoma è fiancheggiato da Tol2 trasposasi siti di legame e di co-iniettato con Tol2 trasposasi mRNA, funziona con alta efficienza per l&#39;integrazione con successo plasmide costruisce sui genomi di pesce 26 - 28. In genere, un potenziale Enhancer è clonato a monte di un promotore basale (come hsp70l 29) e del gene reporter fluorescente come EGFP (enhanced green fluorescent protein) o mCherry in una spina dorsale Tol2 e iniettato con trasposasi mRNA 26. L&#39;osservazione di espressione del reporter fluorescente, sia in embrioni o discendenti con transgeni stabilmente integrati iniettati, fornisce informazioni sulla regolazione spazio-temporale dell&#39;espressione genica guidato dal enhancer putativo. In ulteriori esperimenti, esaltatori validati possono essere utilizzati per guidare sovraespressione tessuto-specifica dei geni di interesse. Per l&#39;analisi delle più grandi regioni -regulatory cis, di alta qualità genom grande insertolibrerie IC utilizzando cromosomi batterici artificiali (BAC) sono stati costruiti per entrambe le marine e di acqua dolce spinarelli 30. Questi BAC possono essere recombineered per sostituire un gene con un gene reporter fluorescente nel contesto di un grande (150-200 kb) regione genomica 31. Il reporter fluorescente viene poi espressa in un modello spazio-temporale, come determinato dal sequenze regolatrici all&#39;interno del BAC. Per gli studi nei pesci, siti Tol2 possono essere aggiunti alla BAC per facilitare genomico integrazione 32,33. Nelle fasi successive di sviluppo, quando l&#39;ibridazione in situ è tecnicamente impegnativo, la lettura fluorescenza del BAC può essere utilizzato per studiare gli schemi di espressione genica, come è stato dimostrato per stickleback proteina morfogenetica 6 (BMP6) 20. Inoltre, i modelli di espressione fluorescenti in un individuo possono essere monitorati nel corso del tempo, che non può essere realizzato con l&#39;ibridazione in situ. BAC può essere utilizzato anche per aggiungere un additional copia di una regione genomica di aumentare il dosaggio di un gene di interesse. Per lo studio della funzione del gene, editing genoma è un campo esplosivo espansione che può essere utilizzato per produrre cambiamenti mirati a sequenze genomiche in un&#39;ampia varietà di organismi 34. Trascrizione attivatore-come nucleasi effettrici (Talens) sono, nucleasi modulari sequenza-specifiche originariamente isolato da agenti patogeni delle piante che possono essere progettati proprio per legarsi direttamente ad una sequenza genomica di scelta e di generare un doppio filamento pausa 35,36. Cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / sistemi CAS sono stati originariamente trovati nei batteri e utilizzare un RNA guida e la proteina Cas9 per generare una pausa in una sequenza di DNA bersaglio complementare alla guida 37. La successiva riparazione della rottura a doppio filamento creato da entrambe le Talens e CRISPRs spesso lascia dietro di sé una piccola inserimento o la cancellazione, che possono interferire con la funzione della sequenza bersaglio35-37. In spinarelli, Talens sono stati utilizzati per distruggere l&#39;espressione genica di mira un potenziatore 20, ed entrambi Talens e CRISPRs hanno prodotto con successo le mutazioni in sequenze codificanti (dati non pubblicati). Un protocollo dettagliato per la generazione di CRISPRs per l&#39;utilizzo in zebrafish può essere utilizzato come linea guida per sviluppare CRISPRs per spinarelli 38. esperimenti di modifica transgenici e genoma richiedono l&#39;introduzione di acidi nucleici in un appena fecondato embrione unicellulare. Con l&#39;introduzione del transgene strumento o del genoma di modifica nelle prime fasi di sviluppo, il numero di cellule figlie geneticamente manipolate in l&#39;embrione è massimizzata. embrioni iniettati vengono poi proiettati visivamente per fluorescenza o molecolarmente sottoposti a screening per le modifiche del genoma. Se le cellule che contribuiscono alla linea germinale sono mirati con successo, il transgene o mutazioni possono essere trasmessi a un sottoinsieme di prole, anche quando post-iniezione letale è elevata. Il pesce a mosaico possono essere outcrossed oincrocia e la loro prole proiettato per recuperare i alleli mutanti o un transgene stabilmente integrata di interesse. Questo protocollo descrive i metodi per l&#39;introduzione di transgeni e l&#39;editing di reagenti genoma in embrioni spinarello uno-cellula e di monitoraggio per le modifiche genomiche di successo.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscopio con transilluminazione</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore manuale</td><td>Strumentazione scientifica applicata</td><td>MM33</td><td>Micromanipolatore Marzhauser M33</td></tr><tr><td>Sistema di iniezione di pressione</td><td>Strumentazione scientifica applicata</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Strumentazione scientifica applicata</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Kit porta micropipette</td><td>Strumentazione scientifica applicata MPIP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supporto base magnetica</td><td>Strumentazione scientifica applicata</td><td>Base</td><td></td></tr><tr><td>magnetica Interruttore a pedale</td><td>Strumentazione scientifica applicata</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Piastra in ferro (base magnetica)</td><td></td>Estrattore per micropipette <td>Narishige</td> IP <td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Strumento</td><td></td> <td>SutterP-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento monouso</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0,5% rosso fenolo in DPBS</td><td>Sigma</td><td>P0290</td> pinza <td>tracciante per iniezione</td></tr><tr><td>#5, biologie dumoxel&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>per la rottura dell'ago</td></tr><tr><td>Barattolo per micropipette</td> World <td>Precision Instruments</td><td>E210</td><td>contiene aghi</td></tr><tr><td>6", 6 denti per pollice sega per cartongesso</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td> <td>contiene uova per iniezione</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm lastra di vetro</td><td>qualsiasi negozio di ferramenta-Capillari</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>in vetro borosilicato, 1,0 mm OD / 0,58 mm ID&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*vetro più duro del pesce zebra capillari di iniezione</td></tr><tr><td>150 x 15 mm Piastra di Petri</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>allevare embrioni di spinarello</td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 35 mm x 10 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>conservare le uova pre-iniezione</td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina metansolfonato/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>anestesia/eutanasia dei pesci</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione Sp6</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Per la trascrizione di TALEN e trasposasi mRNA</td></tr><tr><td>RNeasy cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>purificare la trasposasi o TALEN RNA</td></tr><tr><td>QiaQuick PCR cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>pulire i plasmidi per iniezione</td></tr><tr><td>Proteinasi K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>per la preparazione del DNA</td></tr><tr><td>Kit Nucleobond BAC 100</td><td>Clontech</td><td>740579</td><td>per la preparazione del DNA</td></tr><tr><td>BAC NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polimerasi</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>contiene il tampone di risciacquo delle endotossine</td></tr><tr><td>QIAQuick Estrazione Gel</td><td>Qiagen</td><td>28704&nbsp;</td><td>per sequenziamento di mutazioni indotte</td></tr><tr><td>Fenolo:cloroformio:Alcool isoamilico</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (grado di biologia molecolare)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x tampone Tris-acetato-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0,5-10 Kb RNA ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&nbsp; Spettrofotometro</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus Scala DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Sigma</td><td></td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Provetta PCR a 12 strisce</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

microiniezione per transgenesi e genome editing in threespine spinarelli

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Il pesce Spinarello è emersa come un potente sistema per studiare la base genetica di una vasta gamma di morfologica, fisiologica, e fenotipi comportamentali. I fenotipi notevolmente diverse che si sono evoluti come le popolazioni marine si adattano agli ambienti di acqua dolce innumerevoli, combinata con la capacità di attraversare le forme marine e d&#39;acqua dolce, forniscono un sistema di vertebrati raro in cui la genetica può essere utilizzato per mappare regioni genomiche il controllo sia evoluto tratti. Eccellenti risorse genomiche sono ora disponibili, facilitando molecolare dissezione genetica dei cambiamenti evoluti. Mentre gli esperimenti di mappatura generano liste di geni candidati interessanti, manipolazioni genetiche funzionali sono necessari per testare il ruolo di questi geni. regolazione genica può essere studiato con plasmidi reporter transgenici e BAC integrate nel genoma utilizzando il sistema trasposasi Tol2. Funzioni di specifici geni candidati e gli elementi -regulatory cis possono essere valutate inducendo miratamutazioni con Talen e CRISPR / Cas9 reagenti modifica del genoma. Tutti i metodi richiedono l&#39;introduzione di acidi nucleici in fecondate embrioni spinarello un cellulare, un compito reso difficile dalla fitta corion di embrioni stickleback e il relativamente piccolo e sottile blastomeri. Qui, un protocollo dettagliato per la microiniezione di acidi nucleici in embrioni spinarello è descritto per le applicazioni transgeniche e la modifica del genoma per studiare l&#39;espressione genica e la funzione, così come le tecniche per valutare il successo di transgenesi e recuperare le linee stabili.

Per transgeni Reporter gene che hanno attività enhancer, iniezione di successo si tradurrà in specifico, espressione cellulare del transgene (Figura 4A, 4C). Pesci iniettati possono essere outcrossed per produrre linee stabili (esempio di una linea stabile BAC mostrato nella Figura 4B). L&#39;iniezione di DNA in embrioni stickleback in genere si traduce in letalità di gran lunga superiore rispetto alla sola RNA. È tipico vedere fino al 5...

Manipolazioni transgeniche e la modifica del genoma sono fondamentali per il collaudo funzionale i ruoli dei geni ed elementi -regulatory cis. Ecco una dettagliata protocollo microiniezione per la generazione di modifiche genomiche (compresi costrutti Tol2-mediate fluorescenti giornalista transgene, Talens, e CRISPRs) è presentato per il pesce modello emergente, il Spinarello.

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di microiniezione è generare pesci di stickleback transgenici e con il genoma modificato per verificare la funzione di geni e potenziatori genetici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella genetica dello sviluppo e nell'evoluzione, come ad esempio come i geni e i potenziatori agiscano per generare i modelli corporei. Il principale vantaggio di questa tecnica è che genera in modo efficiente pesci transgenici per l'analisi genetica funzionale.Dopo aver preparato i due plasmidi e l'mRNA secondo il protocollo descritto nel testo, preparare almeno quattro aghi per micropipetta in vetro borosilicato. Conservarli in posizione verticale in un barattolo per la conservazione dei capillari, con le estremità appuntite rivolte verso il basso. Per fecondare fino a cento uova di stickleback, aggiungere 50 microlitri di soluzione di sperma e utilizzare una punta di pipetta per mescolare delicatamente, assicurandosi che tutte le uova vengano fecondate.Mentre si lavora su ghiaccio, riempire almeno tre aghi retrocedendo aspirando con una pipetta 0,5 microlitri di soluzione per iniezione nell’estremità ottusa dell’ago e lasciarla scorr

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Biologia dello sviluppo

Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l'introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l'esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Fonte: Chen, S., et al., Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica nelle cellule striatali del cervello di topo neonatale. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra l'iniezione stereotassica di un vettore virale che codifica per la Cre ricombinasi e la proteina a fluorescenza verde o GFP nello striato di un cucciolo di topo geneticamente modificato per ottenere la manipolazione genica asportando una cassetta STOP fiancheggiata da loxP, attivando la proteina a fluorescenza rossa o RFP...

Microiniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione genica in uno striato di cucciolo di topo

In questo articolo, abbiamo dimostrato un metodo per la manipolazione dell'espressione genica nelle cellule ventricolari del telencefalo zebrafish adulto utilizzando oligonucleotidi antisenso morpholino. Presentiamo questo metodo come protocollo efficiente e rapido che può essere utilizzato per studi funzionali nel cervello dei vertebrati adulto.

Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

Gene-targeting mutagenesi è ora possibile in una vasta gamma di organismi che utilizzano tecniche di editing genoma. Qui, dimostriamo un protocollo per la mutagenesi genica mirata utilizzando trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talens) in Astianatte mexicanus, una specie di pesci che comprende pesce di superficie e cavefish.

Genome Editing in<em&gt; Mexicanus Astianatte</em&gt; Uso Trascrizione Activator simile Effector nucleasi (Talens)

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

Un protocollo di microiniezione semplice ed efficiente per l'editing di gene in embrioni di pesce gatto della manica usando il sistema CRISPR/Cas9 è presentato. In questo protocollo, guida RNA e proteina Cas9 erano microiniettati in tuorlo di embrioni di topo. Questo protocollo è stato convalidato battendo fuori due geni immuno-correlati di pesce gatto della manica.

Microinjection di proteine CRISPR/Cas9 in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embrioni per Gene Editing

Microiniezione di embrioni Nasonia vitripennis è un metodo essenziale per la generazione di modifiche del genoma ereditabile. Una procedura dettagliata per microiniezione e il trapianto di embrioni Nasonia vitripennis , che agevolerà notevolmente la manipolazione del genoma futuri in questo organismo è descritto qui.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come microiniettare una miscela DNA/DOTAP in boccioli di occhiali di embrioni di Xenopus laevis di un giorno, e come immaginare e ricostruire singole proteine fluorescenti verdi (GFP) che esprimono arbori assonali ottici nei midbrain intatti, vivono girini Xenopus.

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Qui viene presentato un protocollo per produrre e retrocedere il genoma CRISPR/Cas9 knockout pesce elettrico. In dettaglio sono indicati i requisiti di biologia molecolare, allevamento e allevamento necessari sia per una palestra che per un mormyrid, e tecniche di iniezione per produrre larve indeletta F0 indotte da Cas9.

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Il presente protocollo descrive la microiniezione di zigote di CRISPR-Cas9 e DNA del donatore per produrre in modo efficiente topi knock-in e floxed con cassette geniche.

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

Impara la microiniezione per transgenesi e genome editing nel pesce stickleback. Questo metodo consente di generare organismi geneticamente modificati per analizzare la funzione di geni ed enhancer in biologia evolutiva e dello sviluppo.

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

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