Name: Valutazione della myofilament Ca 2+ Sensibilità Alla base Cardiac eccitazione-contrazione Accoppiamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Scopri come valutare la sensibilità al Ca²⁺ dei miofilamenti nei miociti cardiaci isolati da cuori di ratto. Questo protocollo integra misurazioni di accorciamento sarcomerico e livelli di Ca²⁺ intracellulare con Fura-2 AM per analizzare l'accoppiamento eccitazione-contrazione cardiaco.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca di scienza di base attraverso il National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell&#39;Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (2.013.068,067 mila); dal Graduate Programme cervello Corea 21 del Ministero coreano dell&#39;Istruzione, della Scienza e della Tecnologia, Seoul National University Hospital, la società coreana of Hypertension (2013), Fondo di ricerca Telecom SK (n. 3.420.130,29 mila) e dalla National Science Foundation naturale della Cina (NSFC 31.460.265; NSFC 81.260.035).

Il protocollo è in conformità con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio pubblicati dal National Institutes of Health delle Nazioni Unite (NIH Publication No. 85-23, rivisto 1996). E &#39;stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) di Seoul National University (approvazione IACUC no .: SNU-101.213-1). 1. Buffer Preparazione (Materiali e attrezzature Tabella) <ol><li> Preparare 300 ml di soluzione di isolamento fresco il giorno dell&#39;esperimento (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4, MgCl 2, 3,5, glucosio, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4, taurina, 20; pH 7,4 con NaOH). </li><li> Preparare 100 ml di soluzione di conservazione fresco il giorno dell&#39;esperimento (in mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO 4 5; CaCl 2 0.2; sodio piruvato 5; glucosio 5,5; taurina 20; HEPES 10; mannitolo 29; pH 7,4 con NaOH). </li><li> Preparare 1L di soluzione di perfusione (in mm: NaCl, 141.4, KCl, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MGCl 2, 1; HEPES, 10; glucosio, 5.5; CaCl 2, 1.8; mannitolo, 14.5; pH 7,4 con NaOH). </li><li> Preparare 30 ml di soluzione di collagenasi 1 aggiungendo collagenasi (1 mg / ml), proteasi (0,1 mg / ml), albumina di siero bovino (BSA, 1.67mg / ml), e Ca 2+ (0.05 mM) a 25 ml di isolamento soluzione. </li><li> Preparare 20 ml di soluzione di collagenasi 2 aggiungendo collagenasi (1 mg / ml), BSA (1.67 mg / ml), e Ca 2+ (0.05 mM) di 16,7 ml di soluzione di isolamento. </li><li> Preparare 40 ml di soluzione di BSA aggiungendo 0,4 g di BSA a 40 ml di soluzione di isolamento. Separati da 10 ml e 30 ml in due bicchieri. Aggiungere Ca 2+ a 30 ml di soluzione di BSA in modo che la concentrazione finale di Ca 2+ nella soluzione BSA è 1 mM. </li></ol> 2. Preparazione per l&#39;isolamento di ventricolare sinistra (LV) miociti <ol><li> Trasferire 8-12 ratti Sprague-Dawley (SD) settimane di età, di sesso maschile in gabbie di trasporto puliti dal stabulario per la stanza di preparazione e l&#39;isolamento. </li><li> Hmangiare due bagni di acqua a 37 ° C. Nota: utilizzare il bagno uno di acqua per l&#39;acqua - serbatoio camicia ed i tubi di perfusione del sistema di perfusione Langendorff. Utilizzare l&#39;altro bagno d&#39;acqua per agitare tronchi tessuto miocardico in modo da separare singoli miociti. </li><li> Aggiungere 5 ml e 3,3 ml di soluzione di BSA (senza Ca 2+) a 25 ml di soluzione di collagenasi 1 e 16,7 ml di soluzione di collagenasi 2 per compensare il volume a 30 ml e 20 ml, rispettivamente. </li><li> Aggiungere soluzione di isolamento (100 ml) e soluzione di collagenasi 1 (30 ml) alla colonna 1 (Col. 1) e la colonna 2 (Col. 2) nel sistema Langendorff perfusione, rispettivamente (Figura 1A). </li><li> Ossigenare la soluzione di isolamento e soluzione di collagenasi 1 nella Colonna 1 e Col.2 tramite il tubo di collegamento ossigeno nel sistema di perfusione Langendorff (Figura 1A). Analogamente, soluzione di collagenasi ossigenato 2 e la soluzione BSA nel bagnomaria agitazione con 100% O 2 tramitetubo di collegamento di ossigeno. </li></ol> 3. Isolamento di LV miociti <ol><li> Anestetizzare un ratto SD tramite iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (30 mg / kg) e confermare lo stato anestetico da punta pizzicare e la mancanza di recesso riflessione. </li><li> Spostare il ratto di un vassoio dissezione. Nella posizione supina, fissare le quattro gambe ai lati del corpo con nastro. </li><li> Applicare incisioni metà assiale del torace con le forbici chirurgiche per aprire il torace, assicurando di non danneggiare il cuore. Utilizzare un altro paio di forbici pulite per sezionare il cuore dai vasi di collegamento (ad esempio, superiore e vena cava inferiore, vasi polmonari, e l&#39;aorta) e la membrana pericardica 13. </li><li> Lasciare una porzione dell&#39;aorta di lunghezza sufficiente (5 - 8 mm), bloccare l&#39;aorta con pinza sottile, e rapidamente montare la cannula del sistema di perfusione Langendorff entro 1 min (Figura 1A). Tie filo di sutura 4/0 strettamente sopra l&#39;aorta. </li><li&gt; accendere la valvola sul Col. 1 e profumato cuore isolato con soluzione di isolamento pre-riscaldato e ossigenato per 10 min (velocità di perfusione: 12-14 ml / min). Spegnere la valvola Col. 1, attivare la valvola sul Col. 2 e profumato il cuore con soluzione di collagenasi 1 per 8 - 10 min. </li><li> Smontare il cuore digerita tagliando l&#39;aorta e trasferirla tenendo l&#39;aorta con una pinza nel pallone contenente soluzione di isolamento fresco (Figura 1BI). Usare le forbici sottili e pinze per tagliare la maggior parte della parete libera LV (compreso il setto) in pezzi più piccoli (~ 22 mm, Figura 1Bii). </li><li> Trasferire i pezzi in un pallone contenente soluzione di collagenasi fresca pre-riscaldato e ossigenata 2 (figura 1Biii). Agitare per 10 min. Mantenere fornire ossigeno alla soluzione di collagenasi miociti contenente 2. </li><li> Spostare il miociti - sospensione in una provetta da 10 ml centrifuga using contagocce con un bulbo di aspirazione e aggiungere Ca 2+ - contenente soluzione di BSA (1: 1 in volume). Centrifugare a 30 g per 2 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet miociti in 5 ml di soluzione di BSA. Centrifuga e scartare il surnatante. </li><li> Disperdere il pellet miociti e tenere miociti in 10 ml di soluzione di storage pre-ossigenato a temperatura ambiente (Figura 1Biv-VI). </li><li> Ripetere le procedure (passi 3.7 - 3.9) si con il restante tessuto LV nel pallone. Nota: Mantenere ripetendo le procedure (punti 3.7 - 3.9) si ancora fino maggior parte del tessuto LV scompare per ottenere una buona resa di miociti. </li><li> Mantenere i miociti in soluzione di archiviazione per 6-8 ore a temperatura ambiente fino alla fine degli esperimenti. </li></ol> 4. Le misurazioni simultanee di intracellulari Ca 2+ transitori e miociti Contrazione <ol><li> miociti carico LV con la acetossimetil estere Fura-2 AM (2 micron). Nota: eseguire tutte le operazioni di carico e gli esperimenti con i miociti caricato in un tubo scuro (Figura 1Bvii). <ol><li> Centrifuge sospensione miociti (1 ml) a 2.000 xg per 10 sec. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet miociti in 1 ml di soluzione Tyrode con una bassa concentrazione di Ca 2+ (250 micron, materiali e attrezzature tabella). </li><li> Aggiungere Fura-2 del mattino e polossamero 407 (2 ml), disperdere delicatamente la sospensione dei miociti, e mantenere la miscela a temperatura ambiente (20 - 24 ° C) per 15 minuti (Figura 1Bvii). </li><li> Centrifugare la miscela per 5 sec, scartare il surnatante e disperdere il pellet miociti in 1 ml di soluzione di perfusione contenente 500 mM Ca 2+. Dopo 10 minuti, centrifugare la miscela per 5 secondi e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere la soluzione perfusione fresco (500 mM Ca 2+, 1 ml) e mantenere il Fura-02:00 - pellet miociti caricata in questa soluzione per registrazioni. </li></ol></li><li> Misura di LV miociti contrazione e intracellulare di Ca 2+ <ol><li> Prima di registrare, riempire il tubo perfusione che attraversa uncamicia d&#39;acqua con la soluzione Tyrode, che è pre-riscaldata a 36 o C. </li><li> Mettere qualche goccia della Fura 02:00 - loaded sospensione dei miociti LV sulla camera di un microscopio a fluorescenza invertito per 5-8 min. Lentamente profumato la soluzione di Tyrode (2,2 ml / min). </li><li> Premere il tasto &quot;start&quot; sul pannello frontale del stimolatore digitale per avviare stimolazione del campo (2 Hz). Nota: La tensione di uscita (10 V, 5 msec durata) è applicato al miociti nella camera attraverso fili di platino posizionate su entrambi i lati della camera. <ol><li> Selezionare i miociti che si contraggono in modo stabile (non quelli visualizzazione iper o ipo-contrazione) per la registrazione. </li></ol></li><li> Regolare la miociti di scelta nella posizione orizzontale del sistema di rilevazione sarcomero basato su video e regolare la messa a fuoco del microscopio per ottenere immagini ottimali di sarcomeri. Posizionare la scatola rettangolare viola sulla zona in cui sarcomeres chiari sono chiaramente rispettati solo alla mediadi lunghezze sarcomero (picco rosso) mostra un picco singolare affilato (Figura 2A, immagine in basso). </li><li> Registrare le variazioni di lunghezza sarcomero in risposta alla stimolazione del campo (Figura 2A e B). Nota: utilizzare i miociti caricati entro 1 - 2 ore. </li><li> Regolare il diaframma della telecamera in modo che il campo nel sistema di rilevazione sarcomere video-based è la dimensione della miociti (Figura 2A). Stimolare la miociti con eccitazione a 360 nm / 380 nm ed emissione a 510 nm (frequenza di acquisizione 1.000 Hz). Record accorciamento sarcomere e il rapporto Fura2 AM con stimolazione del campo (Figura 2B). </li></ol></li></ol> 5. Valutazione di myofilament Ca 2+ Sensibilità <ol><li> La media dei lunghezze sarcomero e Ca 2+ transitori a stato stazionario (10 - 20 tracce) e tracciare il ciclo di fase piano del rapporto di Fura-2 rispetto alla lunghezza del sarcomero dello stesso miociti (entrambe con valore misuratoS e delta cambi; Figura 2C). </li><li> In ogni trama, definire il rapporto Fura -2 al relax% 50 (EC 50, Figura 2C). Confronto sia il loop e EC 50 di ogni intervento. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui, descriviamo i protocolli per valutare i cambiamenti di myofilament Ca 2+ sensibilità in un&#39;unica miociti cardiaci isolati e sottolineare l&#39;importanza di misurare questo parametro insieme a proprietà elettrofisiologiche, intracellulari di Ca 2+ transitori, e la dinamica myofilament. Questo perché le registrazioni di uno o due dei parametri non possono spiegare i meccanismi sottostanti contrazione cardiaca e relax. A differenza dei metodi convenzionali che misurano miociti contrazione e ...

Cardiac accoppiamento eccitazione-contrazione (EC) è lo schema fondamentale per analizzare le proprietà meccaniche del miocardio, cioè, la funzione contrattile del cuore 1,2. Accoppiamento CE è avviata da depolarizzazione della membrana secondaria alle attività di canali ionici sarcolemma (ad esempio, il canale Na + voltaggio-dipendenti, che può essere misurata mediante tecniche di patch-clamp). Successiva attivazione di voltaggio-dipendenti di tipo L Ca 2+ canali (LTCCs) e Ca 2+ afflusso tramite LTCCs innescare la maggior parte di Ca 2+ rilascio attraverso i recettori rianodinici (RyRs), aumentando la concentrazione citoplasmatica di Ca 2+ dal nanomolari (nm ) a livello micromolare (micron). Tale aumento di Ca 2+ citosolico promuove Ca 2+ legame troponina C (TNC) a filamenti sottili e suscita cambiamenti conformazionali del complesso filamento per facilitare l&#39;interazione actina-miosina e myocardi raggiungeAl contrazione 3. Viceversa, il citosolico Ca 2+ è ri-uptaken indietro nel reticolo sarcoplasmatico (SR) attraverso il Ca 2+ -ATPasi in SR (SERCA2a) o viene estrusa dalla miociti tramite la Na + / Ca 2+ scambiatore e la plasmalemmal Ca 2+ ATPasi 1,2. Di conseguenza, il declino della Ca citosolico 2 + istiga cambiamenti conformazionali di filamenti sottili di nuovo allo stato originale, con conseguente dissociazione di actina-miosina e miociti relax 1-3. In questo schema, l&#39;attività di SERCA2a è generalmente considerato per determinare la velocità di rilasciamento miocardico perché il 70 - 90% di citosolico rimozione Ca 2+ nella maggior cellule cardiache mammifero 1. Come tale, anormale Ca 2+ movimentazione da LTCC, RyR e SERCA2a, ecc è stato considerato i meccanismi primari per contrattilità alterata e relax nel cuore malato 1-4. 2+ che funziona come il messaggero in conti di accoppiamento CE per circa l&#39;1% del totale intracellulare di Ca 2+ e la maggior parte di Ca 2+ è destinata a intracellulari di Ca 2+ buffer 5,6. Ciò è dovuto al fatto che i vari Ca 2+ buffer sono abbondanti in miociti cardiaci, ad esempio, i fosfolipidi di membrana, ATP, fosfocreatina, calmodulina, parvalbumina, myofibril TnC, miosina, SERCA2a e calsequestrina nella SR. 5,6,7. Tra questi, SERCA2a e TnC sono i predominanti Ca 2+ buffer 5,6,7. Inoltre, Ca 2+ vincolante ai suoi buffer è un processo dinamico durante contrazione (ad esempio, 30-50% di Ca 2+ si lega a TnC e dissociare da esso durante Ca 2+ transitori 7) e la variazione di Ca 2+ causa aggiuntiva vincolante &quot;release&quot; del libero Ca 2+ al citosol, i risultati nelle alterazioni della intracellulare Ca 2+ concentration. Di conseguenza, perturbazione del intracellulare livello di Ca 2+ induce movimenti myofilament anomali, che sono i precursori di disfunzione contrattile e aritmie 8,9. Molti fattori (sia fisiologici e patologici) possono essere le fonti di modificazioni post-trascrizionali di proteine ​​myofilament, che influenzano myofilament Ca 2+ buffering e myofilament Ca 2+ sensibilità 8-10. Recentemente, è stato riportato che le mutazioni nelle proteine ​​myofilament aumentano il Ca 2+ affinità di legame e intracellulare movimentazione Ca 2+, innescando potenziamento pausa-dipendente di Ca 2+ transitori, rilascio anormale Ca 2+, e aritmie 8. In linea con questo concetto, abbiamo anche dimostrato che myofilament Ca 2+ desensibilizzazione nei cuori di ratto ipertesi secondari per l&#39;up-regolazione di neuronale ossido nitrico sintasi è associata ad diastolica elevata e sistolica Ca 2+ livelli11, che a sua volta, aumenta la vulnerabilità del LTCC Ca 2+ -dipendente inattivazione 12. Quindi, myofilament Ca 2+ sensibilità è un regolatore &quot;attivo&quot; di intracellulare omeostasi e miociti funzione contrattile Ca 2+. E &#39;diventato necessario analizzare le interazioni tra myofilament e Ca 2+ movimentazione proteine ​​per un&#39;indagine approfondita di miociti accoppiamento CE e la funzione cardiaca. Qui, descriviamo un protocollo che valuta i cambiamenti di myofilament Ca 2+ sensibilità in isolate miociti cardiaci. Analisi completa di intracellulare Ca 2+ profilo, myofilament Ca 2+ sensibilità e la contrazione sarà scoprire nuovi meccanismi meccanici del miocardio sottostanti.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley rat</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 settimane</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Corea)</td><td>AHN901</td><td>Codice assicurativo:645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Piruvato</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Albumina fetale bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Sonde molecolari</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 Soluzione al 20% in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua con agitazione</td><td>Chang Shin</td><td>Modello scientifico: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Costruttore sperimentale</td><td>Acquisizione e analisi dei dati di accoppiamento EC nei miociti</td></tr><tr><td>Miociti Calcio & Sistema di registrazione della contrattilità</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua circolante</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza per miociti</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescenza & Rilevamento video</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescenza & Interfaccia di sistema</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa di eccitazione</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>Lampada ARC ad alta intensità Alimentazione</td><td>Cairn Resresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controller ruota portafiltri</td><td>IonOptix</td><td>GB / MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore digitale</td><td>Sistemi medici Porzione</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>Composizioni di soluzioni sperimentali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Soluzione di isolamento (pH: 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentrazione (mmol) 135</td></tr><tr><td>Concentrazione KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>(mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentrazione (mmol) 5</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Concentrazione Sigma</td><td>G8270</td><td>(mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentrazione (mmol) 3.5</td></tr><tr><td>Concentrazione di Taurina</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>(mmol) 20</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Concentrazione (mmol) 0,4</td></tr><tr><td>Soluzione di conservazione (pH: 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentrazione (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentrazione (mmol) 5,4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentrazione (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentrazione (mmol) 5,5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentrazione (mmol) 0,2</td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentrazione (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Concentrazione (mmol) 5</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Concentrazione (mmol) 5</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentrazione (mmol) 20</td></tr><tr><td>Soluzione di perfusione (soluzione di Tyrode, pH: 7,4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentrazione (mmol) 141,4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentrazione (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Concentrazione (mmol) 0,33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentrazione (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentrazione (mmol) 5,5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentrazione (mmol) 1,8&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Per il carico di Fura 2AM, le concentrazioni di CaCl2 sono 0,25 mM e 0,5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentrazione (mmol) 1</td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentrazione (mmol) 14,5</td></tr><tr><td>Soluzione di collangenasi 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di isolamento (30 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina fetale bovina (soluzione BSA 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Concentrazione (mmol) 1,67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentrazione (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Proteasi</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Concentrazione (mmol) 0,1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentrazione (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>Soluzione di collangenasi 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di isolamento ( 20 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina fetale bovina (soluzione BSA 3,3 mL)</td><td></td><td></td><td>Concentrazione (mmol) 1,67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentrazione (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentrazione (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td><td></td>BSA</tr><tr><td>Soluzione di isolamento ( 40mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina fetale bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Concentrazione (mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentrazione (mmol) 1mM</td></tr></tbody></table>

valutazione della myofilament ca<sup&gt; 2+</sup&gt; sensibilità alla base cardiac eccitazione-contrazione accoppiamento

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

L&#39;insufficienza cardiaca e aritmie cardiache sono le principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. Tuttavia, il meccanismo di patogenesi e malfunzionamenti miocardio nel cuore malato deve essere ancora pienamente chiariti. Prova convincente recente dimostra che i cambiamenti nel myofilament Ca 2+ sensibilità influenzano Ca 2+ intracellulare attività omeostasi e canali ionici in miociti cardiaci, i meccanismi fondamentali responsabili del potenziale d&#39;azione cardiaco e la contrazione nei cuori sani e malati. Infatti, le attività di canali ionici e trasportatori sottostanti potenziali d&#39;azione cardiaci (ad esempio, Na +, Ca 2+ e canali K + e Na + -Ca 2+ scambiatore) e Ca 2+ movimentazione proteine ​​intracellulari (ad es., Recettori rianodinici e Ca 2+ -ATPasi nel reticolo sarcoplasmatico (SERCA2a) o fosfolambano e la sua fosforilazione) sono convenzionalmente misurata condotta in basemangiato i meccanismi fondamentali di attacco cardiaco eccitazione-contrazione (EC). Entrambe le attività elettrica nella membrana e intracellulari Ca 2+ cambiamenti sono i segnali di attivazione di accoppiamento CE, che myofilament è l&#39;unità funzionale di contrazione e rilassamento, e myofilament Ca 2+ sensibilità è indispensabile nella realizzazione di prestazioni myofibril. Tuttavia, pochi studi incorporano myofilament Ca 2+ sensibilità nell&#39;analisi funzionale del miocardio a meno che non è al centro dello studio. Qui, descriviamo un protocollo che misura sarcomere accorciamento / ri-allungamento e il livello di intracellulare di Ca 2+ usando Fura-2 AM (rilevamento raziometrico) e valutare i cambiamenti di myofilament Ca 2+ sensibilità nei miociti cardiaci da cuori di ratto. L&#39;obiettivo principale è quello di sottolineare che myofilament Ca 2+ sensibilità dovrebbe essere presa in considerazione in abbinamento CE per l&#39;analisi meccanicistica. un&#39;indagine completa di isui canali ionici, trasportatori, intracellulare di gestione di Ca 2+, e myofilament Ca 2+ sensibilità che sono alla base dei miociti contrattilità nei cuori sani e malati fornirà informazioni preziose per la progettazione di strategie più efficaci di traslazione e valore terapeutico.

miociti LV sono isolati da normali e ipertesi cuori di ratto. Miociti a forma di bastoncello con striature chiare (che rappresenta sarcomeri) e contrazioni stabili in risposta alla stimolazione campo sono considerati come i miociti ottimali e sono selezionati per le registrazioni (Figura 2A). Nell&#39;esempio illustrato in F IGURA 2A, un Fura 02:00 MOLLA LV miociti è posizionato orizzontalmente e la apertura della telecamera viene regolata in modo che il...

Questo articolo descrive un protocollo che valuta i cambiamenti della sensibilità del miofilamento Ca2+ durante la contrazione in miociti cardiaci isolati dal cuore di ratto. Insieme all'elettrofisiologia cardiaca, ai livelli di citosol sistolico/diastolico Ca2+ e alla contrazione/rilassamento, questa misurazione è fondamentale per sostenere i meccanismi che mediano l'accoppiamento eccitazione-contrazione cardiaca nei cuori sani e malati.

Valutazione della myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilità Alla base Cardiac eccitazione-contrazione Accoppiamento

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la sensibilità al calcio dei miofilamenti al fine di approfondire la comprensione dei meccanismi alla base della contrazione cardiaca nel cuore sano e in quello malato. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande relative alla congestione cardiaca e all'insufficienza cardiaca. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fornire, insieme allo studio dei canali ionici, dei trasportatori ionici e della regolazione intercellulare del calcio, una visione completa dei meccanismi alla base della contrattilità cardiaca nel topo, in condizioni fisiologiche e patologiche.Per iniziare questa procedura, riscaldare due bagni d'acqua a 37 gradi Celsius. Aggiungere cinque millilitri di soluzione di BSA priva di calcio a 25 millilitri di soluzione di collagenasi uno e 3,3 millilitri di soluzione di BSA priva di calcio a 16,7 millilitri di soluzione di collagenasi due. Successivamente, aggiungere 100 millilitri di soluzione di isolamento alla colonna uno e 30 millilitri di soluzione di collagenasi uno alla colonna due nel sistema di perfusione Langendorff.Ossigenare la soluzione di isolamento e la soluzione di collaghenasi, rispettivamente nella colonna uno e nella colonna due, tramite il tubo di connessione per l'ossigeno nel sistema di perfusione Langendorff. Analogamente, ossigenare la soluzione di collaghenasi due e la soluzione di BSA nel bagnomaria agitato con il 100% di ossigeno tramite il tubo di connessione per l'ossigeno. In questo passaggio, dopo aver anestetizzato un ratto SD mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico, verificare lo stato anestetico pizzicando l'alluce e controllando l'assenza del riflesso di ritrazione.Successivamente, trasferire il ratto su un vassoio da dissezione. In posizione supina, fissare le quattro zampe ai lati del corpo con del nastro adesivo. Quindi, clampare l'aorta con pinzette fini e montare immediatamente la cannula del sistema di perfusione di Langendorff.Successivamente, legare saldamente il filo di sutura sull'aorta. Accendere la valvola sulla colonna uno ed eseguire la perfusione del cuore isolato con soluzione di isolamento preriscaldata ed ossigenata per 10 minuti. In seguito, accendere la valvola sulla colonna due ed effettuare la perfusione del cuore con la soluzione di collagenasi uno per otto-dieci minuti.In seguito, rimuovere il cuore digerito tagliando l'aorta e trasferirlo nel flacone contenente la soluzione di isolamento fresca. Utilizzando forbici fini e pinzette, tagliare la maggior parte della parete libera del ventricolo sinistro, inclusa la settima, in pezzi più piccoli. Successivamente, trasferire i tessuti in un flacone contenente la soluzione di collaghenasi due fresca, preriscaldata e ossigenata.Quindi, agitarli per 10 minuti e mantenere la soluzione di collaghenasi contenente miociti ossigenata. Successivamente, trasferire la sospensione di miociti in una provetta da centrifuga da 10 millilitri e aggiungere la soluzione di BSA contenente calcio. Centrifugare per due minuti.Dopo due minuti, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet di miociti in cinque millilitri di soluzione di BSA. Quindi, centrifugare ed eliminare nuovamente il soprannatante. Successivamente, disperdere il pellet di miociti e mantenere i miociti in 10 millilitri di soluzione di conservazione pre-ossigenata a temperatura ambiente fino al termine dell'esperimento.Ora, caricate i miociti LV con due micromoli di estere acetossimetilico Fura-2AM. Centrifugate un millilitro di sospensione di miociti per 10 secondi. Successivamente, eliminate il soprannatante e risospendete il pellet di miociti in un millilitro di soluzione di Tyrode con una bassa concentrazione di calcio.Successivamente, aggiungere Fura-2AM e due microlitri di poloxamer 407 ai miociti. Disperdere delicatamente la sospensione di miociti e mantenere la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo 15 minuti, centrifugare la miscela per cinque secondi.Eliminare il soprannatante e disperdere il pellet di miociti in un millilitro di soluzione di perfusione contenente calcio 500 micromolare. Dopo 10 minuti, centrifugare la miscela per cinque secondi ed eliminare il soprannatante. Successivamente, aggiungere soluzione di perfusione fresca e mantenere il pellet di miociti carico con Fura-2AM in questa soluzione per le registrazioni.Prima della registrazione, riempire il tubo di perfusione che attraversa un mantello di acqua con la soluzione di Tyrode a 36 gradi Celsius. Successivamente, posizionare alcune gocce della sospensione di miociti ventricolari sinistri carichi di Fura-2AM nella camera di un microscopio a fluorescenza invertito e attendere da cinque a otto minuti. Perfundere lentamente con la soluzione di Tyrode a 2,2 millilitri al minuto.Quindi, premere il pulsante di avvio sul pannello frontale dello stimolatore digitale per iniziare la stimolazione elettrica a due hertz. Selezionare i miociti che si contraggono in modo stabile per la registrazione. Qui vengono mostrati i tracciati grezzi dell'accorciamento del sarcomero e della misurazione del rapporto Fura-2 in miociti ventricolari sinistri di ratti sham e ipertesi.Di seguito sono riportati i tracciati medi della lunghezza del sarcomero e dei segnali di Fura-2. Ecco inoltre i diagrammi nello spazio delle fasi del rapporto Fura-2 in funzione della lunghezza del sarcomero nei due gruppi. Il ciclo della traiettoria è spostato verso destra e l'EC50 tende ad essere più elevata nell'ipertensione, suggerendo una desensibilizzazione del calcio a livello dei miofilamenti.Prima di eseguire questa procedura, è importante ricordare di testare il corticium, i miociti isolati, rilevando la contrazione dei miociti senza il caricamento di Fura-2AM. Inoltre, verificare sempre la contrazione dei miociti dopo il caricamento con Fura-2AM per evitare un sovraccarico. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come le tecniche di patch clamp, al fine di rispondere ad ulteriori domande.Ad esempio, l'attività del canale di tipo Ca, ovvero, in termini verbali, l'accoppiamento eccitazione-contrazione del miocita. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel futuro della fisiologia cardiaca per esplorare ulteriori approfondimenti sulle malattie cardiache nell'uomo. Dopo aver acquisito esperienza routinaria, si dovrebbe avere una buona comprensione di come analizzare l'attività del canale del calcio nei miofilamenti.Al fine di comprendere meglio i meccanismi che regolano l'accoppiamento eccitazione-contrazione cardiaco in cuori sani e malati.

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