Name: Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri la terapia genica adenovirale per la cheratopatia diabetica: normalizza la guarigione delle ferite corneali e ripristina l'espressione dei marcatori delle cellule staminali epiteliali in colture umane.

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Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario di NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), la sovvenzione CTSI UL 1RR033176 (AVL) e le sovvenzioni del Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.

La malattia Nazionale delle Ricerche Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) ha fornito titolari di autorizzazione post mortem sani e diabetici occhi umani e cornee. protocollo di raccolta dei tessuti umani di NDRI è stato approvato dal comitato direttivo e soggetti a National Institutes of supervisione Salute. Questa ricerca è stata condotta sotto la omologato Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) protocollo esenti EX-1055. Collaborare chirurghi corneali, Drs. E. Maguen e Y. Rabinowitz, forniti cerchi corneosclerale di scarto per l&#39;isolamento di colture di cellule epiteliali corneali arricchito staminali. Questa ricerca è stata condotta nell&#39;ambito del protocollo IRB approvato Pro00019393. 1. umana corneale Cultura Organo Nota: cornee normali e diabetici o gli occhi interi vengono ricevuti nel supporto di memorizzazione della cornea raffreddato (ad esempio, Optisol GS) entro 48 ore dopo la morte dal fornitore nazionale NDRI. <ol><li> Rimuovere le cornee da contenitore di stoccaggio con una pinza e lavarli due volte in il (ABAM) miscela antibiotico-antimicotico. In caso di occhi interi, tagliare le cornee fuori dai globi con forbici curve. Lasciare almeno 5 mm Cerchio congiuntivale e anche lavare le cornee in ABAM. </li><li> Preparare la miscela da collocare nella concavità corneale. Consiste in mezzo privo di siero minimo essenziale (MEM) contenente ABAM, 1 mg / ml di vitello collagene della pelle (fatto da una soluzione stock di 10 mg / ml di acido 0,1 N acetico), 1% agar, e insulina-transferrina selenite integrare 7. </li><li> Microwave questa miscela all&#39;ebollizione per la sterilizzazione e dissoluzione agar. Si può richiedere fino a 1 minuto per ogni cosa a sciogliere. Lasciare il tappo della provetta parzialmente aperta, perché la miscela trabocca facilmente quando bolle. Per questa ragione, possono essere necessari più cicli ebollizione, ciascuno per 10-15 sec. Raffreddare il composto di 37-39 ° C. </li><li> Posizionare le cornee lato epiteliale nel sterili 60 mm piatti. Riempire la concavità corneale con circa 0,5 ml della miscela descritta in 1.2. Ilmiscela solidifica sulle cornee all&#39;interno 2 min. </li><li> Posizionare le cornee lato agar verso il basso in piatti sterili da 60 mm e aggiungere il supporto completo contenente MEM con ABAM, e insulino-transferrina-selenite supplemento 7 (37 ° C) per mantenere il suo livello approssimativamente al limbus per la cultura interfaccia aria-liquido. Il volume medio è di 7-8 ml per piatto. </li><li> Porre le capsule con le cornee in un incubatore CO 2 5% umidificata con una vaschetta dell&#39;acqua (in questo modo, il livello di umidità è mantenuta pari o superiore al 95%) a 35 ° C (temperatura normale corneale). Aggiungere 100 microlitri di media (due gocce) ogni giorno sul dell&#39;epitelio per inumidire le cornee. </li><li> Monitorare la morfologia corneale e la vitalità delle cellule epiteliali microscopio in luce trasmessa utilizzando un microscopio standard con un obiettivo di 4X. Farlo una volta al giorno. </li><li> Cambiare la media ogni tre giorni. Le cornee possono essere coltivate per almeno tre settimane. Per gli esperimenti di terapia genica, la cultura le cornee per 3-5 giorni, poi transduce con i geni di interesse (4,1-4,4), lascia per altri 3-5 giorni a seconda del transgene e soggetti al protocollo guarigione delle ferite (2.1-2.4). </li></ol> 2. La guarigione delle ferite epiteliale Nota: Nelle cornee diabetici, il debridement epiteliale raschiamento meccanico non è fattibile perché la fragile membrana basale dell&#39;epitelio si stacca nel processo, che non avviene nelle cornee normali. Pertanto, per mantenere le cornee normali e diabetici in condizioni simili di guarigione delle ferite, rimozione chimica dell&#39;epitelio con n-eptanolo viene utilizzato 19. Questa procedura rimuove l&#39;epitelio ma lascia dietro una membrana basale intatta in entrambe le cornee normali e diabetici. <ol><li> Per eseguire centrale epiteliale sbrigliamento 20, inserire un disco di carta filtro di 5 millimetri imbevuta di n-eptanolo sulla superficie anteriore della cornea centrale per 75 sec. </li><li> Rimuovere il filtro e lavare le cornee in piena media. Riempire la concavità con 0,5 ml di agar-collagenemiscela e della cultura come in 1.4. Dopo debridement, le cellule epiteliali di solito muoiono e slough off lasciando intatto microscopio membrana basale 7. </li><li> Utilizzare 8,5 mm dischi per creare grandi ferite epiteliali negli esperimenti con solo terapia genica limbare. Ciò garantirà il coinvolgimento delle cellule staminali del limbus nel processo di guarigione. </li><li> Monitorare la guarigione della cornea al microscopio. Fare fotografie a 4X e 10X ogni giorno fino a quando il difetto epiteliale è completamente guarita. Il processo di guarigione può richiedere da 2 a 15 giorni a seconda dello stato (normale o diabetica) e le dimensioni della ferita. Nota: Durante il processo di guarigione, le cellule simili a ragni neri sono stati osservati sul piano focale superiore. Queste cellule sono apoptotici cheratociti stromali che sono morti dopo la rimozione dell&#39;epitelio 4. La guarigione è determinato per essere completo quando queste cellule morte sono ricoperte da epitelio guarigione e non sono più visibili (Figura 2, nel riquadro). </li><li> dopo la guarigionecompletamento, tagliare le cornee a metà, li incorporare in OCT compound e di processo per immunofluorescenza indiretta su sezioni al criostato o per Western blot 16,21. </li></ol> 3. Isolamento di cellule del limbus e manutenzione di colture cellulari staminali arricchita Nota: Preparare la cellula primaria limbare epiteliali stelo (LESC) culture -enriched dai cerchi corneosclerale. I cerchi provenienti da donatori sani e scartati dopo trapianti di cornea vengono ricevuti dai chirurghi che collaborano nel supporto di memorizzazione della cornea standard (ad esempio, Optisol). Altrimenti, le culture LESC arricchita possono essere ottenuti dai cerchi asportati dalle normali e diabetici cornee interi o globi ricevuti dal NDRI nel supporto di memorizzazione corneale. <ol><li> Se si utilizzano le intere cornee o globi, prima di isolare le zone limbari. Per fare ciò, posizionare la cornea su un piatto di plastica sterile con lato epiteliale e rimuovere la zona centrale con un trapano 9 mm (coltello corneale circolare).Eliminare questa parte centrale. Poi asportare la zona limbare utilizzando un trapano da 13 mm e scartare la parte esterna congiuntivale. Per isolare le cellule utilizzano il bordo limbare bagel-like. Prima di isolamento delle cellule, rimuovere le cellule endoteliali e aderenti resti dell&#39;iride dal lato interno della cornea opposta all&#39;epitelio superficie con un tampone di cotone sterile. </li><li> Isolare fogli di cellule del limbus con trattamento dispasi. Incubare ciascun bordo corneosclerale con 2.4 U / ml dispasi II in 1,5 ml di cheratinociti mezzo privo di siero (KSFM) supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS) a 37 ° C per 2 ore 22. </li><li> Delicatamente facilitare strato di cellule epiteliali limbari dal cerchio sotto un microscopio da dissezione stereo con una pinza e dissociare le cellule in 1 ml di 0,25% tripsina - soluzione EDTA 0,02% per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule in 10 ml di terreno (ad esempio, Epilife) e pellet a 300 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere °e le cellule in terreno di coltura: media con N2, B27 e integratori di crescita dei cheratinociti umani, e 10 fattore ng / ml di crescita epidermico (EGF). </li><li> Seme le cellule a 3.000-5.000 cellule / ml in flaconi o 60 piatti mm rivestiti con una miscela di proteine ​​di membrana basale umana compresa fibronectina, collagene di tipo IV e laminina (FCL), a 0,5-1 mg / cm 2, in KSFM medie. </li><li> Cultura le cellule in un umidificata (95% o superiore umidità) CO 2 incubatore a 37 ° C fino a formare monostrati confluenti completamente. Questa operazione potrebbe richiedere 1-2 settimane. Nota: Regolarmente confermare l&#39;identità delle cellule con colorazione immunocitochimica positivo per i marcatori LESC putativi tra cui PAX6, la cheratina (K) 14, K15, K17, e ΔNp63α. I dettagli di colorazione tra cui gli anticorpi primari sono stati pubblicati 8,16-18,22. </li><li> Per passare le cellule confluenti, trattarli in un 1 ml 0,05% tripsina (1: 5 diluizione della soluzione di 0,25%) per 10 min a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di soia trsoluzione inibitore ypsin (10 mg / ml) diluito 1: 4 in media, e centrifugare le cellule come in 3.5. </li><li> Lavare il pellet cellulare in 3 ml di soia soluzione diluita inibitore della tripsina. Piastra le cellule su FCL-rivestito (vedi 3.7) piatti o le diapositive da camera in vetro a 2 x 10 4 cellule / ml. </li></ol> 4. trasduzione adenovirale delle cornee organo-colta Nota: I adenovirus ricombinanti (AV) includono AV-vettore (nessun gene inserito), AV-CMET (con il gene aperta griglia di lettura c-met), AV-shM10 (con shRNA di MMP-10), e AV-shCF ( con shRNA di catepsina F). Sono E1 / E3-cancellato Tipo 5 AV esprimere geni sotto il controllo del grande promotore immediato precoce citomegalovirus. I virus AV-CMET sono generati utilizzando AV vettore pad / CMV / V5-DEST 16. I virus AV-shRNA sono personalizzati generati da subcloning di sequenze shRNA con HH1 promotore e GFP sequenza di tag da iLenti-EGFP vettore in una Huma replica-incompetente (E1 / -E3)n tipo AV 5 genoma utilizzando adeno-4 sistema di espressione 17. <ol><li> Trasdurre una cornea organo-colta di ogni coppia con AV-vettore e un altro cornea, con un AV espressione genica-modulante. Utilizzare l&#39;AV-CMET a 0,8 a 1,25 x 10 8 unità formanti placca (PFU) per cornea in terreno di coltura per 48 ore a 37 ° C mantenendo le cornee sotto la superficie del terreno ciascuno in un pozzo di un piatto da 24 pozzetti. Utilizzare i virus AV-shRNA a 1-2 x 10 8 pfu per cornea. </li><li> Utilizzare i virus per la trasduzione in piena media integrato con 75 mg / ml sildenafil citrato. Questo reagente attiva il trasporto caveolina facilitare l&#39;assorbimento virale da parte delle cellule epiteliali 21. A causa della breve emivita del sildenafil in soluzioni acquose, aggiungere nuovamente la stessa quantità al mezzo 4-5 hr tardi. Il trattamento standard è per 48 ore. </li><li> Trasferimento cornee a nuovi piatti con un finale rotondo spatola sterile e cultura nel mezzo senza AV mantenere il livello medio al limbus. Dopo l&#39;addtransi- 4-8 giorni all&#39;interfaccia liquido-aria, processo le cornee AV-trattati per varie analisi o di prova per epiteliale guarigione della ferita (vedi sopra). Ordinariamente inumidire le cornee in coltura aggiungendo 100 microlitri di media (due gocce) sulla parte superiore della cornea. </li><li> Per la trasduzione delle sole cellule del limbus, incubare i virus con le cornee all&#39;interfaccia aria-liquido con livello medio al limbus, per evitare trasduzione dell&#39;epitelio centrale. </li></ol> 5. Trasduzione adenovirale di cellule in coltura limbare <ol><li> Mantenere le culture LESC-arricchito nel mezzo con 10 ng / ml EGF (vedi 3.5) su piatti di plastica rivestiti con la miscela FCL a 0,5 mg / cm 2. </li><li> Trasdurre cellule in coltura che hanno raggiunto il 70-80% di confluenza con l&#39;AV ospitare il gene della proteina fluorescente verde (AV-GFP) o AV-strapazzate shRNA-GFP in una serie di molteplicità di infezione (MOI: 1-300 pfu / cell) , nel mezzo con 2 ng / ml EGF. Eseguire la transduction per 4 ore a 37 ° C in un volume minimo (0,2 ml), seguita da 20 ore in 0,5 ml di mezzo. La caveolina sildenafil trasporto attivatore non è necessaria per la trasduzione coltura cellulare. </li><li> Utilizzare uno dei seguenti reagenti che facilitano il legame alla superficie cellulare AV per migliorare l&#39;efficienza AV trasduzione: o policationi (1 mg / ml di poli-L-lisina o 5 mg / polibrene ml), o 6 microlitri / ml trasduzione reattivo ( ad esempio, ViraDuctin), o 20 microlitri / ml enhancer trasduzione (ad esempio, ibiBoost). </li><li> Dopo aver sostituito il mezzo per una senza l&#39;AV, incubare cellule coltivate per 4 giorni, nella umidificata CO 2 incubatore e valutare il livello di espressione GFP usando un microscopio a fluorescenza invertito. </li><li> Utilizzare il test la guarigione della ferita zero per valutare la migrazione delle cellule nelle colture AV-trasdotte. Far crescere le cellule nelle diapositive da camera pozzetti. Effettuare le ferite in un monostrato da graffi cellule in un movimento lineare dritto con un PI 200 plPette punta. Dopo ferendo, cambiare il mezzo per una fresca per rimuovere le cellule staccate. </li><li> Fotografare le ferite ogni giorno con una fotocamera digitale collegata ad un microscopio invertito a 4X ingrandimento. Registra il tempo in cui la guarigione è completa (ai bordi della ferita vengono a contatto lungo tutta la ferita). </li></ol>

<ol><li>Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+changes+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Diabetes+Rev%22%5BJournal%5D)">Corneal changes in diabetes mellitus.</a> Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).</li>
<li>Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+quality+of+the+diabetic+eye%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Optical quality of the diabetic eye: a review.</a> Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).</li>
<li>Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+changes+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22DOS+Times%22%5BJournal%5D)">Corneal changes in diabetes mellitus.</a> DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Saghizadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+matrix+metalloproteinase-10+and+matrix+metalloproteinase-3+in+human+diabetic+corneas%3A+a+possible+mechanism+of+basement+membrane+and+integrin+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations.</a> Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).</li>
<li>Saghizadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+and+growth+factor+alterations+revealed+by+gene+microarray+analysis+of+human+diabetic+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).</li>
<li>Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+diabetic+corneas+preserve+wound+healing%2C+basement+membrane%2C+integrin+and+MMP-10+differences+from+normal+corneas+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture.</a> Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).</li>
<li>Saghizadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+epithelial+stem+cell+marker+patterns+in+human+diabetic+corneas+and+effects+of+c-met+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy.</a> Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).</li>
<li>Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+epigenetic+modifications+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).</li>
<li>Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+epithelial+repair%3A+modulation+of+stem+cell+and+transit+amplifying+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation.</a> J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).</li>
<li>Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).</li>
<li>Rama, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+stem-cell+therapy+and+long-term+corneal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration.</a> N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).</li>
<li>Di Girolamo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+fate+of+limbal+epithelial+progenitor+cells+in+the+murine+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea.</a> Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).</li>
<li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+stem+and+progenitor+cells+of+the+murine+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium.</a> Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).</li>
<li>Di Girolamo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+epithelia%3A+Tracking+the+fate+of+mammalian+limbal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells.</a> Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).</li>
<li>Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+wound+healing+and+diabetic+markers+in+organ+cultured+human+diabetic+corneas+by+adenoviral+delivery+of+c-met+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).</li>
<li>Saghizadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+wound+healing%2C+kinase+and+stem+cell+marker+expression+in+diabetic+organ-cultured+human+corneas+upon+MMP-10+and+cathepsin+F+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).</li>
<li>Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+wound+healing+and+stem+cell+marker+patterns+in+organ-cultured+human+diabetic+corneas+by+gene+therapy+of+limbal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells.</a> Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).</li>
<li>Hatchell, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+the+epithelial+basement+membrane+in+the+corneas+of+diabetic+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits.</a> Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).</li>
<li>Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+topical+Na-hyaluronan+on+hemidesmosome+formation+in+n-heptanol-induced+corneal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury.</a> Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).</li>
<li>Saghizadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-driven+overexpression+of+proteinases+in+organ-cultured+normal+human+corneas+leads+to+diabetic-like+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes.</a> Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).</li>
<li>Sareen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+limbal-derived+induced+pluripotent+stem+cells+into+limbal-like+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).</li>
<li>Funari, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+expressed+wound+healing-related+microRNAs+in+the+human+diabetic+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea.</a> PLoS One. 8 (12), e84425(2013).</li>
<li>Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+gene+therapy%3A+basic+science+and+translational+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Corneal gene therapy: basic science and translational perspective.</a> Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+tropism+of+adenoviruses+and+adeno-associated+viruses+to+corneal+cells%3A+implications+for+corneal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy.</a> Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).</li>
<li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).</li>
<li>Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P38+and+ERK1%2F2+coordinate+cellular+migration+and+proliferation+in+epithelial+wound+healing%3A+evidence+of+cross-talk+activation+between+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades.</a> J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).</li>
<li>Saika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+p38+MAP+kinase+in+regulation+of+cell+migration+and+proliferation+in+healing+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).</li>
<li>Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose+suppresses+epidermal+growth+factor+receptor%2Fphosphatidylinositol+3-kinase%2FAkt+signaling+pathway+and+attenuates+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing.</a> Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).</li>
<li>Xu, K., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+epithelial+wound+healing+and+EGFR+signaling+pathways+in+the+corneas+of+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).</li>
<li>Takamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldose+reductase+inhibitor+counteracts+the+enhanced+expression+of+matrix+metalloproteinase-10+and+improves+corneal+wound+healing+in+galactose-fed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats.</a> Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).</li>
<li>Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibition+improves+corneal+epithelial+innervation+and+wound+healing+in+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).</li>
<li>Deng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+limbal+stem+cell+deficiency+by+in+vivo+laser+scanning+confocal+microscopy%3A+a+microstructural+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach.</a> Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).</li>
<li>Lagali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+morphology+of+the+limbal+palisades+of+Vogt+correlates+with+progressive+stem+cell+deficiency+in+aniridia-related+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari.

La cornea sembra essere un tessuto ideale per la terapia genica per la sua posizione superficie in cui il gene delivery, nonché la valutazione della efficacia e gli effetti collaterali, sono facili. Tuttavia, una traduzione clinica di questo approccio potente è ancora lento a causa della scarsa informazione sulle cause genetiche delle malattie corneali e gli obiettivi di terapia genica 24. Complicanze del diabete, tra cui alterazioni corneali possono essere in gran parte epigenetica in natura, che si traduce ...

La malattia della cornea diabetica si traduce principalmente in epiteliale degenerativa (cheratopatia) e nervose modifiche (neuropatia). E &#39;spesso manifesta con le anomalie di epiteliale guarigione delle ferite e la riduzione dei nervi della cornea 1-4. Si stima che circa il 60-70% i diabetici hanno vari problemi corneali 1,3. I nostri studi hanno individuato una serie di proteine ​​marker con alterata espressione in cornee diabetici umani, compresa la down-regulation di c-met proto-oncogene (recettore del fattore di crescita degli epatociti) e l&#39;up-regolazione di metalloproteinasi della matrice-10 (MMP-10) e catepsina F 5, 6. abbiamo anche documentato significativamente diminuita espressione di diversi marcatori di cellule staminali epiteliali putativi nelle cornee diabetici umani. Negli studi precedenti, abbiamo sviluppato una terapia a base di adenovirale gene per normalizzare i livelli di marcatori diabete alterato con sistema di coltura di organi umani diabetica corneale, che mostra lenta guarigione delle ferite, diabeticomodifiche marcatori, e arginare la riduzione dell&#39;espressione marker delle cellule simili alle ex vivo cornee 7,8. Questa persistenza di cambiamenti sembra essere dovuto alla presenza di epigenetica memoria metabolica 9. Questo sistema di coltura è stata ulteriormente utilizzati per la terapia genica. Gli obiettivi di questa terapia sono stati scelti da marcatori o con ridotta espressione in cornee diabetici (c-met proto-oncogene), o aumento dell&#39;espressione (MMP-10 e catepsina F). L&#39;adenovirus (AV) la terapia è stata usata in tutto il cornee organo-colta o solo il corneosclerale vano limbare periferico. Questo comparto nutre le cellule staminali epiteliali che rinnovano l&#39;epitelio corneale e partecipano attivamente alla guarigione delle ferite 4,10-15. Qui, i protocolli sono forniti per la cultura normale e diabetico umano corneale organo, epiteliale la guarigione delle ferite, l&#39;isolamento e la caratterizzazione di cellule arricchita di colture di cellule staminali limbare, e la cella adenovirale e trasduzione corneale. Nostrorisultati dimostrano la fattibilità di questa terapia per normalizzare l&#39;espressione marcatore e la guarigione delle ferite nei diabetici cornee per il trapianto possibile futuro. Essi inoltre suggeriscono che la terapia di combinazione è il modo più efficace per ripristinare il normale modello marcatore e la guarigione epiteliale nella cornea diabetica 16-18.

<table><tbody><tr><td>terreno minimo essenziale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Optisol-GS&nbsp;</td><td>Bausch & Lomb</td><td>50006-OPT</td><td></td></tr><tr><td>ABAM miscela antibiotico-antimicotica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>collagene di pelle di vitello&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>agar, grado per coltura tissutale</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>n-eptanolo</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>72954-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. composto&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Applied Science</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>terreno privo di siero per cheratinociti (KSFM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife medium con calcio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MEPI500CA</td><td></td></tr><tr><td>N2 medium integratore, 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 medium integratore, 50x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>integratore per la crescita dei cheratinociti umani, 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>tripsina 0,25% - EDTA 0,02% con rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>tripsina 0,25% con rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>inibitore della tripsina di soia...</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>integratore di insulina-transferrina-selenito (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I3146-5ML</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo contro cheratina 14</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53253</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo contro cheratina 15</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47697</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo contro cheratina 17</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-58726</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo contro &Delta; NP63&alfa;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8609</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo contro PAX6</td><td>BioLegend</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo contro nidogen-1</td><td>R& Sistemi D</td><td>MAB2570</td><td></td></tr><tr><td>anticorpi contro integrina e alfa; 3&beta; 1</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1992</td><td></td></tr><tr><td>fibronectina umana</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>laminina umana</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L4445</td><td></td></tr><tr><td>collagene umano di tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Adenovirus C6745-1ML</td><td></td></tr><tr><td>che esprime MMP-10 shRNA</td><td>Capital BioSciences</td> adenovirus <td>su misura</td><td></td></tr><tr><td>che esprime catepsina F shRNA</td><td>Capital BioSciences</td> adenovirus <td>su misura</td><td></td></tr><tr><td>che esprime shRNA strapazzato e GFP</td><td>Capital BioSciences</td> adenovirus <td>su misura</td><td></td></tr><tr><td>che esprime c-met</td><td>OriGene (plasmide)</td><td>SC323278</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus che esprime GFP</td><td>KeraFAST</td><td>FVQ002</td><td></td></tr><tr><td>sildenafil citrato, 25 mg</td><td>Pfizer</td><td>da farmacia</td><td></td></tr><tr><td>fattore di crescita epidermico.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>polibrene</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>ViraDuctin</td><td>Cell Biolabs</td><td>AD-200</td><td></td></tr><tr><td>ibiBoost</td><td>ibidi, Germania</td><td>50301</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Spatola a punta tonda Corning&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 60 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174888</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II vetrini per camera multipozzetto&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6807</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l puntali per pipette</td><td>Bioexpress</td><td>P-1233-200</td><td>altri fornitori disponibili</td></tr><tr><td>microscopio invertito&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Diaphot</td><td>altri fornitori/modelli disponibili</td></tr><tr><td>umidificato CO2 incubatore&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370 (Steri-Cycle)</td><td>altri fornitori/modelli disponibili</td></tr><tr><td>microscopio fluorescente</td><td>Olympus, Giappone</td><td>BX-40</td><td>altri fornitori/modelli disponibili</td></tr><tr><td>stereomicroscopio da dissezione</td><td>Leica, Germania</td><td>S4 E</td><td>altri fornitori/modelli disponibili</td></tr></tbody></table>

adenovirale terapia genica per diabetici cheratopatia: effetti sulla guarigione delle ferite e stem cell marker expression in human organ cornee-coltura e le cellule epiteliali limbal

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere le alterazioni molecolari in cornee diabetici umani e dimostrare come possono essere alleviati con la terapia genica adenovirale in cornee organo-colta. La malattia corneale diabetica è una complicanza del diabete con frequenti anomalie dei nervi corneali e epiteliali guarigione delle ferite. Abbiamo anche documentato l&#39;espressione significativamente alterato di diversi marcatori di cellule staminali epiteliali putativi in ​​cornee diabetici umani. Per alleviare questi cambiamenti, la terapia genica adenovirale è stato implementato con successo utilizzando la up-regolazione dell&#39;espressione proto-oncogene c-met e / o la sottoregolazione di matrice proteinasi metalloproteinasi-10 (MMP-10) e catepsina F. Questa terapia accelerato la guarigione delle ferite nei diabetici cornee anche se solo il vano di cellule staminali limbari è stato trasdotto. I migliori risultati sono stati ottenuti con il trattamento combinato. Per possibile il trapianto del paziente di cellule staminali normalizzati, un esempio è presentato anche del optimizatisu di gene trasduzione in colture di cellule staminali arricchita utilizzando esaltatori policationici. Questo approccio può essere utile non solo per i geni selezionati, ma anche per gli altri mediatori di cicatrizzazione corneale epiteliale e gambo funzione delle cellule.

Abbiamo precedentemente dimostrato che nelle culture organo corneali, le differenze nell&#39;espressione di marcatori diabetici (per esempio, proteine ​​della membrana basale e integrina α3β1) e la guarigione della ferita tra le cornee normali e diabetici sono conservati. Questo sistema di coltura è stato sottoposto alla terapia genica finalizzato a normalizzare i livelli dei marcatori diabete alterati, c-met, MMP-10 e catepsina F. <p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

Un esempio di terapia genica adenovirale nelle cornee umane in coltura di organi diabetici viene presentato verso la normalizzazione della guarigione ritardata delle ferite e l'espressione marcatamente ridotta dei marcatori delle cellule staminali epiteliali in queste cornee. Descrive anche l'ottimizzazione di questo processo in colture epiteliali limbari arricchite con cellule staminali.

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è descrivere le alterazioni molecolari nei cheratociti umani diabetici e dimostrare come queste possano essere attenuate mediante terapia genica con vettori adenovirali, in cornee coltivate in organocultura. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della cornea diabetica, come quali alterazioni molecolari sottendono il ritardo nella guarigione delle ferite epiteliali nei soggetti diabetici e l'espressione anomala delle molecole SEM epiteliali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di testare approcci di terapia genica mirati a diversi mediatori della guarigione delle ferite epiteliali corneali e della funzione delle cellule staminali in cornee in organocultura.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di altre malattie corneali legate alla disfunzione delle cellule staminali, poiché abbiamo dimostrato la validità del metodo nel normalizzare le cellule staminali corneali di soggetti ultradiabetici. Posizionare le cornee con il lato epiteliale rivolto verso il basso in piastre sterili da 60 millimetri e riempire la concavità con 0,5 millilitri di miscela agar

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Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio mouse.

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

Descriviamo epatica neo-isolotto formazione STZ (streptozotocina)-indotta topi diabetici mediante trasferimento genico di Neurogenin3 (Ngn3) e Betacellulin (Btc) utilizzando helper-dipendente vettore adenovirale (HDAd) e l'inversione di iperglicemia. Il nostro metodo sfrutta le vettori adenovirali dipendenti da helper con la loro alta efficienza nella trasduzione vivo e l'espressione genica lunga durata.

Neo-Islet formazione nel fegato di topi diabetici da Helper-dipendente adenovirale Vector-Mediated Gene Transfer

L'iniezione sottoretinica è una tecnica chirurgica per la consegna efficace di geni all'epitelio pigmentato retinico nell'occhio del topo.  Qui descriviamo un metodo semplice e replicabile per l'iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico in topi sperimentali.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

Il seguente articolo fornisce un facile, tecnica riproducibile per creare efficacemente un modello sostenibile del mouse di carenza di cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello animale è utile in fase di test e confrontando l'efficacia dei trattamenti per le malattie di cellule staminali del limbus.

Una semplice procedura meccanica per creare Limbal carenza Stem Cell in mouse

Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

Qui, presentiamo un protocollo per studiare la fisiopatologia della retinopatia diabetica proliferativa utilizzando tessuti paziente-derivato, chirurgicamente asportato, fibrovascolare per coltura di tessuto nativo tridimensionale caratterizzazione ed ex vivo. Questo ex vivo modello di cultura è inoltre favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.

Un modello di coltura del tessuto Ex Vivo per fibrovascolare complicazioni nella retinopatia diabetica proliferativa

Descemet's Stripping Only è una procedura sperimentale in cui i pazienti con guttae corneale centrale derivanti dalla distrofia corneale endoteliale di Fuchs hanno la membrana di Descemet spogliata per le cellule periferiche per rigenerare lo strato endoteliale. Presentiamo una nuova metodologia che simula il DSO nelle cornee umane distrofiche ex vivo con guarigione accelerata stimolata da eFGF1 (NM141).

Un modello di coltura di organi corneali umani dello stripping di Descemet solo con guarigione accelerata stimolata dal fattore di crescita dei fibroblasti ingegnerizzato 1

In questo manoscritto, l'iniezione subcongiuntivale è dimostrata come un valido metodo di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari nei topi utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema di iniezione è adattabile anche ad altre vie di somministrazione intraoculare.

Somministrazione subcongiuntivale di vettori virali adeno-associati in modelli di piccoli animali

Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Qui proponiamo tre diversi metodi per danneggiare le fibre sensoriali che innervano la cornea. Questi metodi facilitano lo studio della rigenerazione degli assoni nei topi. Questi tre metodi, adattabili ad altri modelli animali, sono ideali per lo studio della fisiologia e della rigenerazione dell'innervazione corneale.

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

La coltura di organi corneali suini ex vivo e la guarigione delle ferite epiteliali forniscono un mezzo economico, etico, riproducibile e quantitativo per testare la tossicità oculare delle sostanze chimiche. Aiutano anche a chiarire i meccanismi alla base della regolazione dell'epitelizzazione e della riparazione dei tessuti e a valutare le terapie per il trattamento della cheratopatia diabetica e della guarigione ritardata delle ferite.

Valutazione della tossicità terapeutica e chimica mediante cornee suine coltivate in organo e guarigione delle ferite epiteliali

Scopri la terapia genica adenovirale per la cheratopatia diabetica: normalizza la guarigione delle ferite corneali e ripristina l'espressione dei marcatori delle cellule staminali epiteliali in colture umane.

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal (Video) | JoVE Journal

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