Rapida verifica di Terminator Uso del PGR-blu plasmidi e Golden Gate Assembly

L'obiettivo generale del protocollo di biologia sintetica è determinare rapidamente la funzionalità del terminatore e quantificare la forza del terminatore in un sistema in vitro che utilizza l'assemblaggio del golden gate. Questo protocollo viene utilizzato per testare i terminatori che abbiamo trovato in silico utilizzando la bio-informatica e testarli in un ambiente biologico. Ciò consente una conferma rapida e semplice dei terminatori identificati bio-informaticamente in un ambiente di laboratorio.

Il vantaggio principale di questo protocollo è la sua velocità. Possiamo passare dall'identificazione bioinformatica alla conferma biologica in meno di una settimana. E così facendo, possiamo anche verificare che un terminatore è in realtà un terminatore e possiamo quantificare la sua forza di terminazione.

In generale, gli individui inizialmente avranno difficoltà con questa tecnica, perché sembra controintuitivo aggiungere l'enzima di restrizione con una ligasi nella stessa provetta. Tuttavia, utilizziamo endonucleasi di restrizione di tipo 2S e il sito di riconoscimento dell'enzima è separato dal sito di taglio effettivo. Una volta che il terminatore è legato nel plasmide blu pGR, questa è una legatura permanente.

Tuttavia, avendo l'enzima restricton e la ligasi nello stesso tubo, passando attraverso più cicli, possiamo ottenere un'elevata efficienza di chiusura. Iniziare questa procedura rimettendo in sospensione i singoli oligonucleotidi in acqua priva di nucleasi a una concentrazione di 100 micromolari, quindi preparare un tampone di ricottura 10x. Quindi, etichettare una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri per ciascun terminatore da testare.

A ciascun tubo, aggiungere 16 microlitri di acqua ultrapura, 2 microlitri di tampone di ricottura 10x e 1 microlitro ciascuno degli oligonuclotidi del filamento superiore e inferiore dei terminatori desiderati. È molto importante assicurarsi che gli oligonuclotidi che hai ordinato abbiano le estremità appiccicose corrette. Perché una volta ricotti insieme, è importante assicurarsi che il terminatore sia nell'orientamento corretto.

Se il terminatore è orientato in modo errato, pGR blue non sarà in grado di verificare se si tratta di un terminatore funzionante. Posizionare quindi le provette per microcentrifuga in un galleggiante e farle bollire per quattro minuti a bagnomaria. Dopo quattro minuti, spegni la piastra riscaldante ma lascia il tubo nell'acqua per una notte a raffreddarlo lentamente.

Conservare i terminatori ricotti a 20 gradi Celsius. Per effettuare una diluizione di 40 nanomolari dei terminatori ricotti, prima scongelarli con ghiaccio, quindi in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri, aggiungere 124 microlitri di acqua priva di nucleasi a 1 microlitro di terminatori ricotto. Centrifugare i campioni per 30 secondi a 10.000x g.

Dopo la centrifuga, conservare i campioni in ghiaccio. In un nuovo tubo adatto al termociclatore, aggiungere 6 microlitri di acqua priva di nucleasi. Quindi aggiungere un microlitro di tampone DNA ligasi commerciale.

Esegui tutti i passaggi successivi sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere 1 microlitro contenente da 35 a 50 nanogrammi per microlitro del plasmide di destinazione blu pGR, 1 microlitro dei terminatori ricotti da 40 nanomolari, 0,5 microlitri di endonucleasi di restrizione BSA1 commerciale ad alta fedeltà e 0,5 microlitri di DNA ligasi commerciale. Centrifugare la miscela di reazione a 10.000x g per 120 secondi.

Quindi posizionare il tubo direttamente nel termociclatore ed eseguire il seguente programma: 20 cicli di 1 minuto a 37 gradi Celsius, seguiti da 1 minuto a 16 gradi Celsius e poi un ciclo di 15 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la corsa, congelare e conservare i campioni a 20 gradi Celsius oppure procedere immediatamente alla trasformazione.

Trasformare le reazioni di legatura in cellule di E. coli chimicamente competenti utilizzando qualsiasi protocollo di trasformazione appropriato. Qui, le cellule JM109 vengono trasformate utilizzando la trasformazione zippy.

Utilizzando un bastone da hockey in vetro a forma di L, distribuire 25 microlitri di cellule trasformate su piastre di agar LB preriscaldate contenenti 1 millimolare di ampicillina e 10 millimolari di arabinosio. Incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius. Non incubarli per più di 24 ore.

L'ampicillina si degrada rapidamente. Il giorno successivo, ispeziona il colore delle colonie. Una legatura riuscita dovrebbe essere bianca o gialla alla luce visibile e sarà fluorescente al verde sotto la luce blu o UV.

Una legatura non riuscita produrrà una colonia di colore blu alla luce visibile. Per ciascuno dei terminatori e dei controlli, preparare una provetta contenente 5 millilitri di brodo LB sterile con 1 millimolare di ampicillina e 10 millimolare di arabinosio. Quando si esegue questo protocollo, con pGR è molto importante assicurarsi che siano in atto i controlli adeguati.

Il primo controllo dovrebbe essere solo il brodo LB. Il controllo successivo dovrebbe essere costituito da cellule che hanno resistenza all'ampicillina, ma non emettono fluorescenza sotto la luce blu. Questi serviranno come uno spazio vuoto.

Il controllo successivo è un plasmide pGR che non viene tagliato, quindi non ha un terminatore in posizione e questo servirà come base per la forza del terminatore e l'ultima delle provette sarà per il campione. Sotto la luce visibile, usa un anello sterile per raccogliere da 2 a 3 colonie bianche o gialle e trasferiscile nel brodo LB. Lasciare incubare i campioni su un agitatore a 37 gradi Celsius a 160 giri/min per 16-18 ore.

Il giorno successivo, utilizzare uno spettrofotometro per determinare la densità ottica delle celle di ciascun campione a 600 nanometri. Generalmente, dopo questo periodo di tempo, è previsto un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,0. Posizionare una piastra sterile a 96 pozzetti nella cappa.

Per ogni campione o controllo, preparare 3 pozzetti con 199 microlitri di brodo LB sterile con ampicillina e arabinosio. Quindi, pipettare 1 microlitro della soluzione cellulare dai brodi notturni nei singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti. Riempi le piastre con una copertura traspirante e poi agitale per 18-20 ore a 37 gradi Celsius e 160 giri/min.

Il giorno successivo, utilizzare un lettore di piastre per determinare l'OD 600, che dovrebbe essere di circa 0,5. Inoltre, misurare il G della fluorescenza P a una lunghezza d'onda di eccitazione di 395 nanometri e a un'emissione di 509 nanometri. Misura la fluorescenza RFP a una lunghezza d'onda di eccitazione di 575 nanometri e un'emissione di 605 nanometri.

Utilizzando Excel, normalizzare la variazione di crescita dividendo la fioritura per OD 600. Dopo la normalizzazione, determinare l'intensità relativa del terminatore prendendo la fluorescenza del terminatore GFP sulla fluorescenza di controllo GFP e dividendola per la fluorescenza del terminatore RFP sulla fluorescenza di controllo RFP. I terminatori putativi fissi da T1 a 6 identificati bio-informaticamente nel microbatterio fago bernal 13 sono stati analizzati come descritto in questo video.

Questi risultati mostrano una fluorescenza relativa. Tutti i risultati sono stati normalizzati utilizzando come controllo cellule contenenti PGR non tagliato e non modificato. Si è scoperto che T3 è un terminatore forte.

Tutti i risultati rappresentano singole colonie cresciute in triplice copia e mediate per la rappresentazione visiva. Le barre di errore rappresentano le deviazioni tra i punti dati mediati. Per determinare il miglior controllo di riferimento per quantificare la forza del terminatore, sono stati confrontati i dati grezzi utilizzando il plasmide pGR originale che non conteneva terminatore e il blu pGR clonato con una sequenza nota per non essere un terminatore.

Come si può vedere qui, entrambi i controlli hanno mostrato livelli simili di espressione di GFP e RFP e, cosa più importante, hanno prodotto rapporti GFP/RFP simili. Tutti questi risultati rappresentano singole colonie che sono state coltivate in triplice copia e mediate per la rappresentazione visiva. Una volta padroneggiata, questa tecnica può richiedere solo 72 ore, compresi i tempi di spedizione e ordinazione.

È importante notare che il blu pGR funziona solo in e.coli. Inoltre, dal momento che stiamo guardando solo una piccola parte del terminatore, non abbiamo davvero idea di altri elementi regolatori che possano controllare la trascrizione. Per verificare i risultati ottenuti con questo protocollo utilizzando il blu pGR, è possibile utilizzare metodi aggiuntivi come la PCR quantitativa.

Inoltre, l'inserto pGR può essere tagliato e legato in un plasmide di vostra scelta.