Name: Rapida verifica di Terminator Uso del PGR-blu plasmidi e Golden Gate Assembly (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Impara a quantificare rapidamente la forza dei terminatori usando Golden Gate Assembly e plasmidi pGR-blu. Questo protocollo accelera la validazione sperimentale in biologia sintetica.

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Gli autori vorrebbero riconoscere Malcolm Campbell e Todd Eckdahl con il Genome Consortium per l&#39;insegnamento attivo (GCAT) e il HHMI-Science Education Alliance - Cacciatori fagi Avanzando Genomica e Evolutionary Science programma (SEA-fagi). Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Center for Research Resources (P20RR016460) e l&#39;Istituto Nazionale di General Medical Sciences (P20GM103429) dal National Institutes of Health. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalla National Science Foundation sotto concessione # IIA-1.457.888. (Ouachita Baptist University) fondi Inoltre istituzionali sono stati forniti attraverso il JD Patterson Estate Research Fellowship.

1. Progettazione e ordinare oligonucleotidi con le appropriate Sticky Ends <ol><li> Identificare i potenziali terminatori Rho-indipendente attraverso l&#39;analisi genomica utilizzando programmi che sono liberamente disponibili online. 7 </li><li> Quando si lavora con DNA a doppio filamento, determinare l&#39;orientamento del terminatore da testare. 7 Il plasmide PGR-Blue verifica solo terminatori legatura in 5 &#39;a 3&#39; sulla parte superiore (filamento in avanti). <ol><li> Convertire un fondo (reverse) Strand terminatore al suo complemento invertita per riorientare la sequenza di test in PGR-blu utilizzando il software gratuito on-line, ad esempio, scimmia. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;orientamento è determinato per essere corretta, aggiungere alla fine appiccicoso &quot;5&#39;-CGAC-3 &#39;&quot; al 5&#39; estremità del filo superiore. Aggiungere fine appiccicoso &quot;5&#39;-CCGC-3 &#39;&quot; al 5&#39; estremità del filo inferiore. 8 Questo assicurerà che inserto legatura sarà inserito nell&#39;appositoorientamento utilizzando GGA. </li><li> Una volta che le sequenze sono determinati, ordinare come singoli oligonucleotidi bloccati commercialmente. </li></ol> 2. ricottura oligonucleotidi (si applica solo a liofilizzato DNA) <ol><li> Risospendere singoli oligonucleotidi in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 100 pM. </li><li> Fare 10x tampone ricottura: 1 M NaCl e 100 mM Tris-HCl pH 7,4. buffer di ricottura può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane. Una volta buffer di ricottura è fatto e oligonucleotidi sono ri-sospesi, iniziare la ricottura 8. </li><li> Per ogni terminazione da testare, aggiungere 16 ml di acqua ultra-pura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 2 ml di 10x tampone di ricottura ad ogni provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di oligonucleotide filo superiore (100 micron) dal terminatore desiderato. </li><li> Aggiungere 1 ml di oligonucleotide fondo filamento (100 micron) dal terminatore desiderato. </li><li> Creare un bollente ba acquaesimo con un bicchiere di 1.000 ml contenente circa 400 ml di acqua di rubinetto e posto su un piatto caldo. </li><li> Mettere le provette da microcentrifuga dal punto 2.6 in un galleggiante e far bollire per 4 minuti. Dopo 4 minuti, spegnere il calore a piastre, ma lasciare il tubo e galleggiare nel bagno d&#39;acqua per raffreddare lentamente O / N (18 ore) 8. Conservare le terminazioni ricotto a -20 ° C. </li></ol> 3. Golden Gate Assembly (Mix Standard - Costo efficiente) <ol><li> Fare un nM diluizione dei terminatori ricotto 40. Aggiungere 124 ml di acqua priva di nucleasi di 1 ml di Terminator mix ricotto (100 micron). <ol><li> campioni di centrifugazione per 30 secondi a 10.000 xg e memorizzare sul ghiaccio. </li></ol></li><li> In un nuovo tubo appropriata per il termociclatore in uso, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi. </li><li> Aggiungere 1 ml di commerciale DNA Ligase Buffer [300 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl 2, 100 mM DTT, e 10 mm ATP]. Eseguire tutti i passaggi successivi su ghiaccio. </li><li> Aggiungere1 ml di PGR-blu (35-50 ng / ml) plasmide destinazione alla provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di i 40 nm terminatori ricotto alla provetta. </li><li> Aggiungere 0,5 microlitri commerciale ad alta fedeltà BsaI endonucleasi di restrizione alla provetta. </li><li> Aggiungere 0,5 microlitri di DNA ligasi commerciale alla provetta. </li><li> Centrifugare la miscela di reazione a 10.000 xg per 120 sec. Quindi inserire il tubo direttamente nel termociclatore. </li><li> Eseguire il programma termociclatore: 20 cicli di 1 minuto a 37 ° C seguita da 1 min a 16 ° C, seguiti da 1 ciclo di 15 min a 37 ° C. Utilizzare i campioni immediatamente o congelare e conservare a -20 ° C. 8 </li></ol> 4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - tempo efficiente) <ol><li> Aggiungere 124 ml di acqua priva di nucleasi a 1 l di 100 micron terminazioni creato nel passaggio 2. Questo diluisce la concentrazione di DNA di terminazione a 40 nm ricottura.Eseguire questo passaggio in una nuova, etichettato 1,5 ml provetta. </li><li> In un nuovo tubo appropriata per il termociclatore, aggiungere 14 ml di acqua priva di nucleasi. Assicurarsi che il nuovo tubo è etichettato di conseguenza. </li><li> Aggiungere 2 ml di Commercial Master Mix Buffer alla provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di PGR-Blue plasmide (35-50 ng / mL) alla provetta. </li><li> Aggiungere 2 ml di i 40 nm terminatori ricotto alla provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di Commercial Master Mix alla provetta. </li><li> Centrifugare il tubo di 40 Nm a 10.000 xg per 120 sec. Quindi inserire il tubo direttamente nel termociclatore. </li><li> Eseguire il programma termociclatore: 1 ciclo di 60 min a 37 ° C seguita da 1 ciclo di 15 min a 55 ° C. Utilizzare i campioni immediatamente o congelare e conservare a -20 ° C. </li></ol> 5. Trasformazione e selezione Colony <ol><li> Preparare Luria Base (LB) piastre di agar Petri contenenti 1 mM concentratione di ampicillina (Amp) e una concentrazione di 10 mM di arabinosio (ARB). Preparare almeno 10 ml di 1 M L -arabinose soluzione madre perché questa soluzione madre verrà utilizzato nei passaggi successivi. </li><li> Utilizzare qualsiasi alta efficienza (10 8 - 10 9 trasformanti / mg) E. chimicamente competente coli (JM109), le cellule per la trasformazione. 9 Per ottenere i migliori risultati, aggiungere 3-5 ml della reazione legatura a 50 ml di cellule competenti. Quando si usano le cellule chimici competenti, seguire il protocollo di trasformazione specifico per le cellule utilizzate. </li><li> Stendere la metà (25 ml) delle cellule trasformate sul pre-riscaldato LB (Amp / ARB) piastre di agar utilizzando una sterile forma di L &quot;bastone da hockey&quot; e incubare O / N a 37 ° C. A causa del rapido tasso ampicillina di decomposizione, non incubare a 37 ° C superiore a 24 ore. </li><li> Eseguire la selezione delle colonie in base al colore mediante ispezione visiva. Una legatura di successo deve essere di colore bianco / giallo in luce visibile e fluorescenza verde undeR blu (450 nm) o la luce UV. Una legatura successo produrrà una colonia che è di colore blu sotto la luce visibile dopo 18 - 20 ore. </li></ol> 6. Verifica e quantificazione dei Terminator <ol><li> Preparare 5 ml sterili tubi LB-brodo con 1 mM ampicillina e 10 mm arabinosio. Il numero di tubi necessari dipende dal numero di terminatori essere testati più controlli (cellule con resistenza all&#39;ampicillina che non fluorescenti e cellule contenenti l&#39;uncut plasmide PGR-blu). </li><li> Sotto la luce visibile raccogliere 2-3 colonie bianche / gialle (passo 5,4) utilizzando un&#39;ansa sterile. Permettere ai campioni di incubare in brodi su un agitatore a 37 ° C e 160 rpm per 16-18 ore. Non incubare questi campioni per più di 24 ore. <ol><li> Facoltativamente, utilizzare uno spettrofotometro per determinare la densità cellulare ottica a 600 nm (OD 600) per garantire un&#39;adeguata crescita cellulare. In generale, un diametro esterno 600 di ~ 0,8-1,0 si osserva dopo 16-18 ore di crescita. </li></ol></li><li> Usouna piastra a 96 pozzetti sterili per i passaggi rimanenti. Eseguire questi passaggi in un ambiente asettico e in triplicato. Aggiungere 199 ml di brodo sterile LB + Amp / arabinosio (1 mM ampicillina / 10 mM arabinosio) in ciascun pozzetto. Includere camera sul piatto per tre comandi separati. <ol><li> Utilizzare i seguenti tre controlli: solo un bene (1) contenente brodo / arabinosio LB + Amp e un pozzo (2) per le cellule competenti non trasformate (vuote) per servire come un vuoto. Per la quantificazione (3) della forza terminatore, cellule contenenti non tagliati PGR originale o contenenti PGR-blu legatura con un non-terminazione sequenza dovrebbero essere incluse (controllo di riferimento per la quantificazione). Vedere la Figura 1 per il layout lettore di piastre. </li></ol></li><li> Pipettare 1 ml di soluzione di cella dal O / N brodi in singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti. </li><li> piastre di tenuta con una copertura traspirante e agitare per 18-20 ore a 37 ° C e 160 giri al minuto. </li><li> Utilizzando un lettore di piastre, determinare OD 600 con la letturaassorbanza a 600 nm. Misurare la fluorescenza GFP come segue: eccitazione 395 ed emissione 509. Misura RFP fluorescenza come segue: eccitazione 575 ed emissione 605. Dopo 18-20 ore, l&#39;OD 600 deve essere di circa 0,5. </li><li> Per normalizzare le variazioni nella crescita, utilizzare l&#39;equazione: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq1.jpg" /> sia per la GFP e RFP. </li><li> Dopo la normalizzazione, determinare la resistenza di terminazione relativa utilizzando l&#39;equazione <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq2.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Li, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+promoter+sequence+and+its+strength+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+biology+undergraduate+education%2C+a+call+for+action--initial+responses%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses.</a> CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).</li>
<li>Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+the+biology+community%3A+snapshots+of+change%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in the biology community: snapshots of change.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).</li>
<li>Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARNold%3A+a+web+tool+for+the+prediction+of+Rho-independent+transcription+terminators%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators.</a> RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).</li>
<li>Campbell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pClone%3A+Synthetic+Biology+Tool+Makes+Promoter+Research+Accessible+to+Beginning+Biology+Students%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).</li>
<li>Rhee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+medium+composition+and+plasmid+combination+on+the+growth+of+recombinant+Escherichia+coli+JM109+and+on+the+production+of+the+fusion+protein+EcoRI%3A%3ASPA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA.</a> J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).</li>
<li>Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+mutations+in+the+Escherichia+coli+AraC+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein.</a> J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).</li>
<li>Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+L-arabinose+operon+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli.</a> Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composability+of+regulatory+sequences+controlling+transcription+and+translation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).</li>
<li>Sharon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+gene+regulatory+logic+from+high-throughput+measurements+of+thousands+of+systematically+designed+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters.</a> Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il passo più importante in questo protocollo è corretta progettazione oligonucleotide prima di ordinare. Gli oligonucleotidi devono avere le estremità coesive opportune aggiunte alla estremità 5 &#39;della parte superiore e inferiore trefoli per garantire che GGA incorporazione è possibile. Inoltre, è importante cambiare l&#39;orientamento delle terminazioni rivolto verso sinistra (terminatori che fermano la trascrizione sul filamento basso) a quella di destra di fronte (termina la trascrizione sul filo alto) terminator...

I grandi progetti di biologia sintetica richiedono l'uso di terminatori di trascrizione altamente efficaci per aiutare a regolare l'espressione genica. L'identificazione di nuovi terminatori richiede l'analisi bioinformatica di nuovi genomi. Tuttavia, man mano che vengono sviluppate quantità crescenti di software bioinformatico, ciascuno con un algoritmo unico utilizzato per la previsione, si verifica una maggiore discrepanza tra i risultati putativi. Poiché questo processo è in qualche modo soggettivo e viene eseguito in silico, queste previsioni necessitano di conferma biologica. 1 Inoltre, il volume di terminatori putativi identificati attraverso l'analisi in silico richiede l'uso di strategie di clonazione che possono essere completate in un lasso di tempo relativamente breve. 
Il plasmide PGR-Blue è una modifica del plasmide PGR che è stato riprogettato per utilizzare il Golden Gate Assembly (GGA) per semplificare la procedura di clonaggio consentendo di eseguire simultaneamente tutte le fasi di reazione in una provetta per microcentrifuga. 2,3 La selezione del colore è stata incorporata nel plasmide per aumentare la facilità di identificazione delle colonie positive. Una legatura riuscita dovrebbe essere bianco/giallo alla luce visibile e fluorescente al verde sotto la luce blu (450 nm) o ultravioletta (UV) se coltivata su piastre contenenti arabinosio. Poiché il pGR-blue non tagliato contiene una proteina cromografica blu (amilCP), le colonie contenenti un plasmide non modificato sono blu sotto la luce visibile. Questa semplificazione, insieme al protocollo semplificato, consente ai ricercatori di procedere dall'identificazione bioinformatica alla conferma biologica in tre o quattro giorni. La natura progettuale di questo sistema può essere vantaggiosa sia nel laboratorio di ricerca che in contesti educativi.
Il plasmide pGR-Blue permette la quantificazione della forza del terminatore. 4 Un singolo promotore inducibile dell'arabinosio viene utilizzato per produrre la proteina fluorescente verde (GFP) e la proteina fluorescente rossa (RFP). Il terminatore viene clonato nel plasmide dopo la sequenza GFP ma prima della sequenza RFP, interrompendo così la trascrizione della proteina RFP. La forza del terminatore è determinata dal rapporto tra GFP prodotto e RFP prodotto. 
Il rapporto Vision and Change5 ha suggerito che l'educazione in Scienza, Tecnologia, Ingegneria e Matematica (STEM) incorpora esperienze basate sulla ricerca in classe. 6 Tuttavia, ciò richiede lo sviluppo di protocolli che possono essere eseguiti da studenti con competenze limitate in un periodo di tempo definito. Sebbene il protocollo possa essere completato in soli tre giorni, è stato anche progettato in modo che ogni passaggio principale possa essere completato in un periodo di laboratorio settimanale separato (2-3 ore) per creare un'esperienza di ricerca del corso (CRE). Se utilizzata in questo modo, la procedura richiederà tra le tre e le sei settimane ed è appropriata sia per i corsi introduttivi che per quelli avanzati di Genetica, Biologia Cellulare o Bioinformatica.

<table><tbody><tr><td>pGR-Blue Plasmid</td><td>Addgene</td><td>68374</td><td></td></tr><tr><td>pGR-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>46002</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal-(Fogli sterili)</td><td>Excel Scientific</td><td>BS-25</td><td>Fogli sterili solo</td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligasi Buffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>L'enzima non HF funzionerà ma è meno stabile al calore.</td></tr><tr><td>NEB Golden Gate Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E1600S</td><td>Commerial Master Mix a cui si fa riferimento nel protocollo.</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Rotondo Microcentrifuga Floating Rack</td><td>Nova Tech International</td><td>F18875-6401</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-3256</td><td>D-Arabinosio non indurrà il promotore pBAD</td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Brodo, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1900</td><td></td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Agar, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2025</td><td></td></tr><tr><td>Tecan-Infinite M200 Plate Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix & Go Competent Cells - Ceppo JM109</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td>Utilizzare il protocollo di trasformazione raccomandato dall'azienda</td></tr><tr><td>ApE: Un software di editor di plasmidi</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tris-HCl, cloruro</td> di sodio <td>Promega</td><td>H5121</td><td></td>di grado molecolare</tr><tr><td>(cristallino/biologico, certificato)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671</td><td></td></tr><tr><td>Sintesi commerciale di oligonucleotidi</td><td>Tecnologie integrate del DNA (IDT)</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali per microtest - 96 pozzetti (sterile)</td><td>Micobatteriofago Falcon</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>"Bernal13"</td><td>Banca</td><td>genetica KJ510413</td><td></td></tr><tr><td>Acqua libera da nucleasi</td><td>Tecnologie integrate del DNA (IDT)</td><td>IDT004</td><td></td></tr><tr><td>Sterile, a forma di L Hockey-Stick Cell Life</td><td>Science Products</td><td>6444-S1</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>ARNold: uno strumento web per la previsione di terminatori di trascrizione Rho-indipendenti.</td><td></td><td></td><td></td>http://rna.igmors.u-psud.fr/</tr></tbody></table>

rapida verifica di terminator uso del pgr-blu plasmidi e golden gate assembly

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

L'obiettivo di questo protocollo è consentire la verifica rapida dei terminatori identificati bioinformaticamente. Inoltre, il plasmide (pGR-Blue) è progettato specificamente per questo protocollo e consente la quantificazione dell'efficienza del terminatore. Come prova di concetto, sei terminatori sono stati identificati bioinformaticamente nel micobatteriofago Bernal13. Una volta identificati, i terminatori sono stati quindi realizzati come oligonucleotidi con le estremità appiccicose appropriate e ricotti insieme. Utilizzando il Golden Gate Assembly (GGA), i terminator sono stati poi clonati in pGR-Blue. Alla luce visibile, le colonie false positive appaiono blu e le colonie trasformate positivamente sono bianche/gialle. Dopo l'induzione di un promotore inducibile dell'arabinosio (pBad) con arabinosio, la forza della colonia può essere determinata misurando il rapporto tra la proteina fluorescente verde (GFP) prodotta e la proteina fluorescente rossa (RFP) prodotta. Con pGR-Blue, il protocollo può essere completato in soli tre giorni ed è ideale in un contesto educativo. Inoltre, i risultati mostrano che questo protocollo è utile come mezzo per comprendere le previsioni in silico dell'efficienza del terminatore legate alla regolazione della trascrizione.

Questo protocollo produrrà cellule contenenti PGR-blu con un terminatore legatura tra la GFP e RFP utilizzando il Golden Gate di montaggio (Figura 2). colonie positive contenenti inserto legatura possono essere selezionati in base al colore. Alla luce visibile colonie positive saranno bianco / giallo e falsi positivi produrranno colonie blu dopo 18-20 ore di incubazione a 37 ° C (Figura 3). Do...

Questo protocollo utilizza Golden Gate Assembly e il plasmide pGR-blue per quantificare rapidamente la forza dei terminatori presenti nel silico.

Rapida verifica di Terminator Uso del PGR-blu plasmidi e Golden Gate Assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

L'obiettivo generale del protocollo di biologia sintetica è determinare rapidamente la funzionalità di un terminatore e quantificarne la forza in un sistema in vitro che utilizza l'assemblaggio Golden Gate. Questo protocollo viene impiegato per testare i terminatori identificati in silico mediante bioinformatica e verificarne l'attività in un contesto biologico. Ciò consente una rapida e semplice conferma, in condizioni da banco di laboratorio, dei terminatori identificati bioinformaticamente.Il principale vantaggio di questo protocollo è la sua velocità. Possiamo passare dall'identificazione bioinformatica alla conferma biologica in meno di una settimana. In questo modo, possiamo inoltre verificare che un terminatore sia effettivamente un terminatore e possiamo quantificare la sua forza di terminazione.Generalmente, le persone incontreranno inizialmente difficoltà con questa tecnica, poiché sembra controintuitivo aggiungere l'enzima di restrizione insieme alla ligasi nello stesso tubo. Tuttavia, utilizziamo endonucleasi di restrizione di tipo 2S, il cui sito di riconoscimento è separato dal sito di taglio effettivo. Una volta che il terminatore viene ligato nel plasmide pGR blue, questa ligazione diventa permanente.Tuttavia, utilizzando l'enzima di restrizione e la ligasi nello stesso tubo e sottoponendoli a diversi cicli, possiamo ottenere un'elevata efficienza di clonaggio. Iniziare questa procedura risospendendo i singoli oligonucleotidi in acqua priva di nucleasi a una concentrazione di 100 micromolare, quindi preparare il tampone di annealing 10x. Successivamente, etichettare un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro per ciascun terminatore da testare.A ciascun tubo aggiungere 16 microlitri di acqua ultrapura, 2 microlitri di tampone per l'anellamento 10x e 1 microlitro ciascuno degli oligonucleotidi del filamento superiore e inferiore provenienti dai terminator desiderati. È molto importante verificare che gli oligonucleotidi ordinati presentino le estremità appiccicose corrette. Poiché, una volta anellati tra loro, è fondamentale garantire che il terminator sia nell'orientamento corretto.Se il terminatore è in orientamento errato, pGR blue non sarà in grado di verificare se si tratta di un terminatore funzionante. Successivamente, posizionare le provette micro-centrifuga su un galleggiante e farle bollire per quattro minuti in un bagno d'acqua. Dopo quattro minuti, spegnere la piastra riscaldante ma lasciare le provette nell'acqua tutta la notte per un raffreddamento lento.Conservare i terminatori ricotturati a 20 gradi Celsius. Per preparare una diluizione di 40 nanomolari dei terminatori ricotturati, scongelarli prima sul ghiaccio, quindi in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri aggiungere 124 microlitri di acqua priva di nucleasi a 1 microlitro dei terminatori ricotturati. Centrifugare i campioni per 30 secondi a 10.000x g.Dopo la centrifugazione, conservare i campioni sul ghiaccio. In un nuovo tubo adatto per termociclatore, aggiungere 6 microlitri di acqua priva di nucleasi. Quindi aggiungere un microlitro di buffer per DNA ligasi commerciale.Eseguire tutti i passaggi successivi sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere 1 microlitro contenente da 35 a 50 nanogrammi per microlitro del plasmide bersaglio pGR blue, 1 microlitro di terminatori annealed a 40 nanomolari, 0,5 microlitri di enzima di restrizione BSA1 ad alta fedeltà commerciale e 0,5 microlitri di DNA ligasi commerciale. Centrifugare il campione a 10.000x g per 120 secondi.Quindi posizionare il tubo direttamente nel termociclatore ed eseguire il seguente programma: 20 cicli di 1 minuto a 37 gradi Celsius, seguiti da 1 minuto a 16 gradi Celsius, quindi un ciclo di 15 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine del programma, congelare e conservare i campioni a 20 gradi Celsius oppure procedere immediatamente alla trasformazione.Trasformare le reazioni di ligazione in cellule di e. coli chimicamente competenti utilizzando un qualsiasi protocollo di trasformazione appropriato. In questo caso, le cellule JM109 vengono trasformate mediante trasformazione zippy.Utilizzando un’asta di vetro a forma di L, distribuire 25 microlitri delle cellule trasformate su piastre di agar LB preriscaldate contenenti ampicillina 1 millimolare e arabinosio 10 millimolare. Incubare le piastre per tutta la notte a 37 gradi Celsius. Non incubare per più di 24 ore.L'ampicillina si degrada rapidamente. Il giorno successivo, esaminare il colore delle colonie. Una ligazione riuscita dovrebbe essere bianca o gialla alla luce visibile e fluorescere di verde sotto luce blu o UV.Una ligazione non riuscita produrrà una colonia di colore blu alla luce visibile. Per ciascuno dei terminatori e dei controlli, preparare un tubo da provetta contenente 5 millilitri di brodo LB sterile con 1 millimolare di ampicillina e 10 millimolari di arabinosio. Quando si esegue questo protocollo, con pGR è molto importante assicurarsi che siano presenti i controlli appropriati.Il primo controllo dovrebbe essere solo brodo LB. Il controllo successivo dovrebbe essere cellule resistenti all'ampicillina, ma che non fluorescono alla luce blu. Queste fungeranno da bianco.Il prossimo controllo è un plasmide pGR che non è stato tagliato, quindi non contiene un terminatore inserito e servirà come valore di riferimento per la forza del terminatore; l'ultimo dei tuoi tubi sarà dedicato al tuo campione. Alla luce visibile, utilizza un’ansa sterile per prelevare da 2 a 3 colonie bianche o gialle e trasferiscile nel brodo LB. Lascia incubare i campioni in agitazione a 37 gradi Celsius e 160 giri al minuto per 16-18 ore.Il giorno successivo, utilizzare uno spettrofotometro per determinare la densità ottica delle cellule di ogni campione a 600 nanometri. In genere, dopo questo periodo di tempo, ci si aspetta un OD 600 compreso tra 0,8 e 1,0. Posizionare una piastra sterile a 96 pozzetti nell'incubatore.Per ogni campione o controllo, preparare 3 pozzetti con 199 microlitri di brodo LB sterile contenente ampicillina e arabinosio. Successivamente, pipettare 1 microlitro della soluzione cellulare dai brodi della notte precedente in pozzetti individuali della piastra a 96 pozzetti. Coprire le piastre con un coperchio traspirante e quindi agitarle per 18-20 ore a 37 gradi Celsius e 160 rpm.Il giorno successivo, utilizzare un lettore di piastre per determinare l'OD 600, che dovrebbe essere circa 0,5. Inoltre, misurare la fluorescenza di G di P a una lunghezza d'onda di eccitazione di 395 nanometri e a un'emissione di 509 nanometri. Misurare la fluorescenza di RFP a una lunghezza d'onda di eccitazione di 575 nanometri e a un'emissione di 605 nanometri.Utilizzando Excel, normalizzare la variazione della crescita dividendo la fluorescenza per l'OD 600. Dopo la normalizzazione, determinare la forza relativa del terminatore dividendo la fluorescenza del terminatore GFP per la fluorescenza del controllo GFP e dividendo il risultato per il rapporto tra la fluorescenza del terminatore RFP e la fluorescenza del controllo RFP. I terminatori putativi T1-T6, identificati mediante analisi bioinformatica nel fago di microbatteri bernal 13, sono stati analizzati come descritto in questo video.Questi risultati mostrano la fluorescenza relativa. Tutti i risultati sono stati normalizzati utilizzando cellule contenenti PGR non tagliato e non modificato come controllo. È stato scoperto che T3 è un terminatore forte.Tutti i risultati rappresentano colonie singole coltivate in triplo e mediate per la rappresentazione visiva. Le barre di errore indicano le deviazioni tra i punti dati mediati. Per determinare il miglior controllo di riferimento per la quantificazione dell'efficienza del terminatore, sono stati confrontati i dati grezzi ottenuti utilizzando il plasmide pGR originale privo di terminatore e il plasmide pGR blue clonato con una sequenza nota per non essere un terminatore.Come si può vedere qui, entrambi i controlli hanno mostrato livelli simili di espressione di GFP e RFP e, cosa più importante, hanno prodotto rapporti simili tra GFP e RFP. Tutti questi risultati rappresentano colonie singole coltivate in triplicato e mediate per la rappresentazione visiva. Una volta padroneggiata, questa tecnica può richiedere anche soli 72 ore, compresi i tempi di spedizione e ordinazione.È importante notare che pGR blue funziona solo in e.coli. Inoltre, poiché stiamo analizzando soltanto un piccolo frammento del terminatore, non abbiamo alcuna informazione riguardo ad altri elementi regolatori che potrebbero controllare la trascrizione. Per verificare i risultati ottenuti con questo protocollo utilizzando pGR blue, possono essere impiegati metodi aggiuntivi come la PCR quantitativa.Inoltre, l'inserto pGR può essere escisso e ligato in un plasmide a scelta.

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